細(xì)胞破碎與提取要點(diǎn)課件

第二章蛋白質(zhì)的制備

---細(xì)胞破碎與萃取第二章蛋白質(zhì)的制備

---細(xì)胞破碎1第一節(jié)蛋白質(zhì)制備總則

來源、胞內(nèi)（胞外）、可溶性、分子大小、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性（對溫度、pH、蛋白酶、金屬離子的耐受性）等二、方法選擇依據(jù)：

根據(jù)不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)和研究目的一、目標(biāo)：高效率、高收率、高純度、高活性1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)：第一節(jié)蛋白質(zhì)制備總則來源、二、方法選擇依據(jù)：一、目2

工業(yè)化應(yīng)用：經(jīng)濟(jì)性（高收率，純度次要）一般研究：80%-90%純度結(jié)構(gòu)研究：95%以上純度醫(yī)療：全面分析2、研究目的：

越到后面的純化越困難，增加成本，延長操作時(shí)間，收率低

考慮產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量和經(jīng)濟(jì)性工業(yè)化應(yīng)用：經(jīng)濟(jì)性（高收率，純度次要）2、研究目的：3三、確立有效成分的測定方法1、蛋白質(zhì)初步提取和濃縮

吸附法超濾法沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）透析三、確立有效成分的測定方法1、蛋白質(zhì)初步提取和濃縮吸4三、確立有效成分的測定方法2、蛋白質(zhì)高效分離純化

色譜法（凝膠過濾、離子交換、親和色譜等）電泳法

（聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦、毛細(xì)管電泳等）三、確立有效成分的測定方法2、蛋白質(zhì)高效分離純化色譜53、根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)確立分離方法溶解度不同：等電點(diǎn)，有機(jī)溶劑，鹽析電荷不同：電泳，離子交換分子形狀大小不同：離心，透析，凝膠過濾3、根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)確立分離方法溶解度不同：等電點(diǎn)，有機(jī)溶劑，6四、蛋白質(zhì)的制備流程：原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎碎片分離清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性四、蛋白質(zhì)的制備流程：原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)7首先：材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離有效成分的萃取首先：材料的選擇和預(yù)處理8第二節(jié)材料的選擇、預(yù)處理與保存一、原料選擇原則：有效成分含量高、原料來源豐富，易得；原料中雜質(zhì)含量少；原料成本低等；植物采收具有季節(jié)性微生物生長的對數(shù)期注意動物的年齡與性別第二節(jié)材料的選擇、預(yù)處理與保存一、原料選擇原則：有效成9微生物：及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。二、原料的預(yù)處理：動物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存。植物原料：要擇時(shí)采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鮮處理。微生物：及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。二、原料的預(yù)10（3）防腐劑保鮮：常用乙醇、苯酚等。適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。三、原料的保存方法（1）冷凍法：適用于所有生物原料。常用-40℃速凍。（2）有機(jī)溶劑脫水法：丙酮，該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。（3）防腐劑保鮮：常用乙醇、苯酚等。適用于液體原三、原料的保11第三節(jié)細(xì)胞破碎一、破碎方法的原則和依據(jù)

原則：最大提取、不易變性、減少干擾具體須從材料特性和目的物特性綜合考慮。第三節(jié)細(xì)胞破碎一、破碎方法的原則和依據(jù)原則：最大提取121、材料細(xì)胞的特性

動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，易破碎，只需用溫和方法植物細(xì)胞有細(xì)胞壁難破碎，須用中等或強(qiáng)度大的方法微生物細(xì)胞較復(fù)雜，一般用較強(qiáng)的方法1、材料細(xì)胞的特性動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，易破碎，只需用溫和方132、目的物的特性⑶.處理量

有些處理量大，如組織搗碎機(jī)等。有些處理量少，如超聲波破碎等。

⑴．細(xì)胞中的位置游離狀：只需溫和破碎，除去不溶部分。結(jié)合狀：結(jié)合在膜或細(xì)胞器內(nèi)，先收集膜或細(xì)胞器，再破碎⑵．敏感性

溫度、pH、氧、剪切力、雜酶等影響2、目的物的特性⑶.處理量⑴．細(xì)胞中的位置⑵．敏感性14㈠機(jī)械法1.組織搗碎機(jī)：

適用：動植物組織二、破碎方法原理：機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生剪切力的作用破細(xì)胞具體方法：2.勻漿器

適用：較柔軟、易分散的組織細(xì)胞3.研缽

適用：微生物（細(xì)菌）與植物細(xì)胞㈠機(jī)械法1.組織搗碎機(jī)：適用：動植物組織二、破碎方法15㈡物理法1．超聲波破碎2．滲透壓沖擊法：適用：處理胞壁較脆弱的微生物。細(xì)胞放在高滲溶液中，由于滲透壓作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂㈡物理法1．超聲波破碎2．滲透壓沖擊法：適用：處理胞壁較脆163．反復(fù)凍融法：-15℃～-20℃，適用：動物材料將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4．急熱驟冷法：

85～90℃數(shù)分鐘，冰浴冷卻適用：細(xì)菌及病毒中對熱不太敏感的物質(zhì)3．反復(fù)凍融法：-15℃～-20℃，適用：動物材料4．急17㈢．化學(xué)法2．

表面活性劑法

破壞細(xì)胞膜，釋放目的物（需與其它方法結(jié)合應(yīng)用）。

1．

溶劑處理法：

丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。㈢．化學(xué)法2．

表面活性劑法1．

溶劑處理法：丙酮、氯18（四）酶解法2．

外加酶法

將細(xì)胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來。細(xì)菌：加溶菌酶（結(jié)合反復(fù)凍融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加幾丁質(zhì)酶植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。1．

自溶法保溫一定時(shí)間，通過細(xì)胞本身的酶將細(xì)胞破壞。（四）酶解法2．

外加酶法1．

自溶法19例：外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形成包含體牛生長激素>30%形成包含體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包含體人胰島素原5%~26%形成包含體三、包含體及其純化例：外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源20包涵體（inclusionbodies），或包含體，是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包涵體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體（inclusionbodies），或包含體，是無定21包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包涵體后，溶解包涵體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（proteinfolding）機(jī)理研究提出了新的課題。包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)22重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們在分離純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒－包涵體（inclusionbodiesIBs)。重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了232、包含體的構(gòu)成基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。分離包含體后，需使目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。（蛋白質(zhì)折疊）

包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。2、包含體的構(gòu)成基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是243、包含體特點(diǎn):是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。包含體難溶于水，易溶于變性劑（如鹽酸胍、脲）。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，離心（5000-20000g15min）就可以沉淀。3、包含體特點(diǎn):是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。包25幾種常見的工藝路線（一）機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）差速離心提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（一）機(jī)械破碎差速離心提取出包含體加變性劑26路線1的特點(diǎn)

特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單。

缺點(diǎn):要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長?；蚬こ贪w的純化方法路線1的特點(diǎn)特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性27幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶28路線2的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染?；蚬こ贪w的純化方法缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。路線2的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白29幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性基30

路線3特點(diǎn)：基因工程包含體的純化方法優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。路線3特點(diǎn)：基因工程包含體的純化方法優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所31一、概述第四節(jié)萃取1、基本概念及分類概念：萃取是利用溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的技術(shù)。一、概述第四節(jié)萃取1、基本概念及分類32液-固萃取液-液萃取化學(xué)萃取物理萃取雙水相萃取超臨界萃取萃取原理參與溶質(zhì)分配的兩相不同分類：液-固萃取液-液萃取化學(xué)萃取物理萃取雙水相萃取超臨界萃取萃取33概念：用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程稱為固-液萃取，也稱浸取或浸出。應(yīng)用：用溫水從甜菜中提取糖，用有機(jī)溶劑從大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有機(jī)溶劑從植物中提取藥物、香料或色素等。液-固萃取概念：用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程稱為34用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)叫液-液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液-液萃取指的是有機(jī)溶劑萃取液-液萃取有機(jī)溶劑萃取法廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模的提取上。應(yīng)用比化學(xué)沉淀法分離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低；生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、易實(shí)現(xiàn)自動化控制優(yōu)點(diǎn)用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)叫液-液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液-35溶劑萃取法和其他新型分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了一系列新型分離技術(shù)：超臨界流體萃?。⊿upercriticalfluidextraction）反膠團(tuán)萃取（Reversedmicelleextraction）雙水相萃取技術(shù)（Partitionoftwoaqueousphasesystem）液-液萃取用于高品質(zhì)的天然物質(zhì)、胞內(nèi)物質(zhì)（胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）的分離提取上。溶劑萃取法和其他新型分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生液-液萃取用于高品質(zhì)36根據(jù)萃取原理分類的基本概念化學(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性復(fù)合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相分配的過程。物理萃取溶質(zhì)根據(jù)相似相溶的原理在兩相間達(dá)到分配平衡而進(jìn)行萃取的分離過程。根據(jù)萃取原理分類的基本概念化學(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與372、萃取技術(shù)的操作特點(diǎn)①萃取過程具有選擇性②能與其他純化步驟相配合③適用于各種不同的規(guī)模④傳質(zhì)速度快，生產(chǎn)周期短，便于連續(xù)操作

2、萃取技術(shù)的操作特點(diǎn)①萃取過程具有選擇性383、萃取需要考慮下列問題①生物系統(tǒng)的錯綜復(fù)雜和多組分特性②產(chǎn)物的不穩(wěn)定性③相分離性能3、萃取需要考慮下列問題①生物系統(tǒng)的錯綜復(fù)雜和多組分特性②39把目標(biāo)物質(zhì)從第一個液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個液相中。物質(zhì)的溶解和相似相溶原理。萃取是通過溶質(zhì)在兩個液相之間的竟?fàn)幮匀芙猓ǚ峙洌┒鴮?shí)現(xiàn)的。二、溶劑萃取技術(shù)（液-液萃?。┌涯繕?biāo)物質(zhì)從第一個液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個液相中40影響萃取操作的因素：溫度pH值鹽分溫度↑互溶性增大；溫度↓產(chǎn)物穩(wěn)定性提高，粘度增加，擴(kuò)散性能減小。影響分配系數(shù)，影響物質(zhì)解離情況無機(jī)鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易于轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中，另一方面還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。鹽分↑分配系數(shù)↑影響萃取操作的因素：溫度溫度↑互溶性增大；影響分配系數(shù)，影響41d．乳化分散非均相一種另一種乳劑均相（溶液）

乳化即水或有機(jī)溶劑以微小液滴分散在有機(jī)相或水相中的現(xiàn)象。d．乳化分散非均相一種另一種乳劑均相（溶液）乳化即水或有機(jī)42乳化劑類型

乳狀液可分為兩大類型水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/O，水分散在油中O/W(水包油型)W/O(油包水型)乳化劑類型乳狀液水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/43

（親憎平衡值）HLBHLB數(shù)即親水與親油平衡程度，HLB數(shù)越大，親水性越強(qiáng)，形成O/W型乳濁液，HLB數(shù)越小，親油性越強(qiáng)，形成W/O型乳濁液。（親憎平衡值）HLBHLB數(shù)即親水與親油平衡程度，44乳化與去乳化在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物質(zhì)。

由蛋白質(zhì)引起的乳化多為水包油型（O/W）。乳化帶來的問題：有機(jī)相和水相分相困難，出現(xiàn)夾帶。乳化與去乳化在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物45破乳的方法：1.加熱破乳

升溫加速乳狀液液珠的布朗運(yùn)動使絮凝速率加快，同時(shí)使界面粘度迅速降低，使聚結(jié)速率加快，有利于膜的破裂。2.高壓電破乳

高壓電場的破乳較復(fù)雜不能只看作擴(kuò)散雙電層的破壞，在電場下液珠質(zhì)點(diǎn)可排成一行，呈珍珠項(xiàng)鏈?zhǔn)?，?dāng)電壓升到某一值時(shí)，聚結(jié)過程在瞬間完成。破乳的方法：1.加熱破乳升溫加速乳狀液液珠的463.過濾破乳

當(dāng)乳狀液經(jīng)過一個多孔性介質(zhì)時(shí)，由于油和水對固體潤濕性的差別，也可引起破乳。4.化學(xué)破乳

化學(xué)破乳的原則是破壞吸附在界面上的乳化劑，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳劑。破乳劑也是一種表面活性劑，有很高的表面活性，能將界面上原來存在的乳化劑頂替走；但破乳劑分子一般具有分支結(jié)構(gòu)，不能在界面上緊密排列成牢固的界面膜，從而使乳狀液的穩(wěn)定性大大降低。3.過濾破乳當(dāng)乳狀液經(jīng)過一個多孔性介質(zhì)時(shí)，由475.電解質(zhì)破乳

對于稀的乳狀液，起穩(wěn)定作用的是擴(kuò)散雙電層，加入電解質(zhì)可破壞雙電層，也能使乳狀液聚沉5.電解質(zhì)破乳對于稀的乳狀液，起穩(wěn)定作用的是48三反膠束萃取

（反膠團(tuán)萃?。┤茨z束萃取

（反膠團(tuán)萃?。?91、基本術(shù)語膠束(micelles):

向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨[S]增大而下降。當(dāng)[S]達(dá)到一定值后，溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低。臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentration,CMC):

S在水溶劑中形成膠束的最低濃度。1、基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑50反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中加入一定濃度S和水，在有機(jī)溶劑中所會形成內(nèi)部含少量水的膠束。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中51細(xì)胞破碎與提取要點(diǎn)課件522 反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用：

反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。2 反膠束的溶解作用532 反膠束的溶解作用溶解推動力A 靜電作用：

理論上,當(dāng)溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時(shí),由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團(tuán),溶解率或分配系數(shù)較大,反之,則不能溶解到反膠團(tuán)相中,左圖為pH值對不同蛋白質(zhì)的溶解率急劇變化,當(dāng)pH<7,即在帶正電荷的pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃取起決定性作用。2 反膠束的溶解作用溶解推動力542、反膠束的溶解作用B 空間相互作用

鹽濃度增大對反膠團(tuán)相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團(tuán)直徑減小,空間排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與I-0.5成正比。圖還示：AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與AOT濃度無關(guān),這是多數(shù)反膠團(tuán)系統(tǒng)的共性.2、反膠束的溶解作用B 空間相互作用553、反膠束萃取的影響因素1)pHvalueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉。3、反膠束萃取的影響因素1)pHvalue562)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性2)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性573)、鹽離子的種類3)、鹽離子的種類584)蛋白質(zhì)分子量M4)蛋白質(zhì)分子量M595)、表面活性劑SA 種類B [S]5)、表面活性劑S606)助表面活性劑6)助表面活性劑614、應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離4、應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離622)胞內(nèi)酶的提取2)胞內(nèi)酶的提取63四、超臨界流體萃取

SupercriticalFluidExtraction四、超臨界流體萃取

SupercriticalFluid64簡介：超臨界流體萃取(SCF)是20世紀(jì)70年代后期迅速發(fā)展起來的一種新興的萃取分離技術(shù)，是利用超臨界流體作為萃取劑，對物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程。超臨界流體具有氣體和液體之間的性質(zhì)，且對許多物質(zhì)均具有很強(qiáng)的溶解能力，分離速率遠(yuǎn)比液體萃取快，可以實(shí)現(xiàn)高效的分離過程。簡介：超臨界流體萃取(SCF)是20世紀(jì)70年代后期迅速發(fā)展65超臨界流體的發(fā)展

1822年，首次報(bào)道1879年，發(fā)現(xiàn)超臨界流體對固體有溶解能力1970年從咖啡豆提取咖啡因1992年，首先報(bào)道了超臨界聚合反應(yīng)超臨界流體的發(fā)展

1822年，首次報(bào)道66（一）、超臨界流體的萃取的原理1.流體的臨界特征氣相、液相、固相三相成平衡態(tài)共存的點(diǎn)叫三相點(diǎn)。液、氣兩相成平衡狀態(tài)的點(diǎn)叫臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)是所要求的溫度和壓力分別稱為臨界溫度（Tc）和臨界壓力（pc）。穩(wěn)定的純物質(zhì)及由其組成的固定組分混合物具有固有的臨界狀態(tài)點(diǎn)。（一）、超臨界流體的萃取的原理1.流體的臨界特征67超臨界流體(SCF)超臨界流體(SCF)682.超臨界流體的特征超臨界流體(SCF)是處于臨界溫度和臨界壓力以上的非凝縮性的高密度流體。超臨界流體沒有明顯的氣-液界面，既不是氣體，也不是液體，是一種氣-液不分的狀態(tài)，性質(zhì)介于氣體和液體之間。流體處于超臨界狀態(tài)時(shí)，其密度接近液體密度，并且隨流體壓力和溫度的變化發(fā)生十分明顯的變化。2.超臨界流體的特征超臨界流體(SCF)是處于臨界溫度和臨69超臨界流體的性質(zhì)

物理特征

密度（g/cm3）

粘度（g/cm/s）

擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）

氣體（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2

液體0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3超臨界流體的性質(zhì)

物理密度70超臨界流體的主要特性

密度類似液體壓力和溫度的變化均可改變相變粘度,擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體SCF的介電常數(shù)，極化率和分子行為與氣液兩相均有著明顯的差別超臨界流體的主要特性

密度類似液體71溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨超臨界流體密度的增大而增大。2.超臨界流體的特征超臨界流體萃取正是利用這種性質(zhì)，在較高壓力下，將溶質(zhì)溶解于流體中，然后降低流體溶液的壓力或升高流體溶液的溫度，使溶解于超臨界流體中的溶質(zhì)因密度下降，溶解度降低而析出，從而實(shí)現(xiàn)特定溶質(zhì)的萃取。溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨超臨界流體密度的增大而增大。2.72可作為超臨界流體的物質(zhì)：二氧化碳、一氧化亞氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等?？勺鳛槌R界流體的物質(zhì)：73常用的流體介質(zhì)

二氧化碳：臨界溫度：31.1℃；臨界壓力：7.2MPa臨界條件容易達(dá)到、化學(xué)性質(zhì)不活潑、無色無味無毒、安全性好、價(jià)格便宜、純度高、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)常用的流體介質(zhì)

二氧化碳：743.超臨界流體萃取特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn))①萃取和分離合二為一②壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過程的參數(shù)③萃取溫度低④臨界CO2流體常態(tài)下是氣體，無毒⑤超臨界流體的極性可以改變3.超臨界流體萃取特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn))①萃取和分離合二為一754.萃取技術(shù)的應(yīng)用舉例

生物活性物質(zhì)和生物制品的提取

CO2萃取技術(shù)主要應(yīng)用于有害成分成分的脫除、有效成分的提取、食品原料的處理等幾個方面。例如：用SFE從咖啡、茶中脫咖啡因；啤酒花萃取；從植物中萃取風(fēng)味物質(zhì)；從各種動植物中萃取各種脂肪酸、提取色素；從奶油和雞蛋中去除膽固醇等。4.萃取技術(shù)的應(yīng)用舉例生物活性物質(zhì)和生物制品的提取76例1脫咖啡因超臨界流體萃取技術(shù)得到最早大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用的是天然咖啡豆的脫咖啡因。用SF-CO2法從咖啡豆中脫出咖啡因工藝流程

例1脫咖啡因用SF-CO2法從咖啡豆中脫出咖啡因工藝流程77例2.啤酒花萃取普通的有機(jī)溶劑萃取法制取的啤酒花萃取液為暗綠色膏狀（即啤酒花浸膏），含有許多不純物質(zhì)，而且還殘留有機(jī)溶劑。液體CO2和SC-CO2抽提的酒花萃取物顏色為微欖綠，在20～25MPa，40℃萃取4h，浸膏得率可14％，硬樹脂萃取率僅為5.2%，而且不萃取農(nóng)藥，芳香成分不氧化。例2.啤酒花萃取78例3.其他從工業(yè)性應(yīng)用的萃取分離角度，SC-CO2萃取技術(shù)在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)領(lǐng)域中有較寬的應(yīng)用面。①醫(yī)藥工業(yè)

酶、維生素等的精制回收動植物中藥效成分的萃取（生物堿、生育酚、EPA、DHA、鴉片、嗎啡、精油等）醫(yī)藥品原料的濃縮、精煉、脫溶劑酵母、菌體產(chǎn)物的萃取例3.其他79②食品工業(yè)

植物油脂的萃取動物油脂的萃取奶脂中脫除膽固醇等食品脫脂咖啡、紅茶脫咖啡因、酒花萃取香辛料萃取植物色素的萃取共沸混合物分離，含醇飲料的軟化脫色、脫臭，煙草脫尼古?、谑称饭I(yè)80③化妝品及香料工業(yè)天然香料萃取，合成香料的分離和精制化妝品原料萃取，精制（界面活性劑、脂肪酸脂、甘油單酯等）③化妝品及香料工業(yè)811896年Beijerinck觀察到當(dāng)把明膠與瓊脂或把明膠和可溶性淀粉的水溶液混合時(shí)，先得到一混濁不透明的溶液，隨后分成兩相，上相含有大部分明膠，下相含有大部分瓊脂(或可溶性淀粉)。再如下圖中，2.2％的葡聚糖水溶液與等體積的0.72％甲基纖維素鈉的水溶液相混合并靜置后，可得到兩個粘稠的液層。

葡聚糖與甲基纖維素鈉的雙水相體系

五、雙水相萃取葡聚糖與甲基纖維素鈉的雙水相體系五、雙水相萃取82有機(jī)溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑；蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相中，水分都占大比例（85～95％），蛋白質(zhì)在兩相中不會失活，且以一定比例分配于兩相中。雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)使固液分離和純化兩個步驟同時(shí)進(jìn)行，一步完成；適合熱敏物質(zhì)的提取，主要是胞內(nèi)酶；有機(jī)溶劑萃取的不足：親水性聚合物加入水中，形成兩相，在這兩相83（一）、雙水相體系的組成雙聚物：聚合物-低相對分子質(zhì)量的化合物：PEG/DEX、聚乙二醇/聚乙烯醇、聚乙烯醇/甲基纖維素、聚丙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/甲氧基乙二醇等PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸胺、PEG/硫酸鈉、PEG/葡萄糖等、常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－無機(jī)鹽系統(tǒng)無毒原則（一）、雙水相體系的組成雙聚物：聚合物-低相對分子質(zhì)量的化合84（二）、雙水相體系形成的原因雙水相體系的成因是聚合物之間的不相溶性，即聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，從而分為兩相。一般認(rèn)為，只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時(shí)就可發(fā)生相分離，并且水溶性差別越大，相分離的傾向越大。2.

加入鹽分，由于鹽析作用，聚合物與鹽類溶液也能形成兩相。（二）、雙水相體系形成的原因雙水相體系的成因是聚合物之間的不85水溶液中聚合物的疏水性依下列次序遞增：

葡萄糖硫酸鹽＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羥丙基葡聚糖＜甲基纖維素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙三醇，這種疏水性的差別對目的產(chǎn)物與相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性隨分子量增加而增加。（三）、影響雙水相萃取的因素聚合物及其相對分子量水溶液中聚合物的疏水性依下列次序遞增：（三）、影響雙水相萃取86pH會影響蛋白質(zhì)中可離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)；另外，pH還影響系統(tǒng)緩沖物質(zhì)磷酸鹽的離解程度，從而影響分配系數(shù)。體系pH與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。2.pH的影響pH會影響蛋白質(zhì)中可離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷87在PEG/Dex中，無機(jī)鹽離子在兩相中也有不同的分配，因此在兩相間形成電位差。由于各相要保持電中性，這對帶電生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等的分配，產(chǎn)生很大的影響。一些無機(jī)離子的分配系數(shù)正離子分配系數(shù)K＋負(fù)離子分配系數(shù)K－K＋

0.824I－

1.42Na＋

0.889Br－

1.21NH4＋

0.92Cl－

1.12Li＋

0.996F－

0.9123.離子環(huán)境對蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響3.離子環(huán)境對蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響88由于親水聚合物的多元醇或多糖結(jié)構(gòu)保護(hù)了蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在雙水相中的穩(wěn)定性增加，所以一般都可在室溫下操作。而且室溫時(shí)粘度較冷卻時(shí)低，有助于相的分離并節(jié)約了能源開支。4.溫度的影響由于親水聚合物的多元醇或多糖結(jié)構(gòu)保護(hù)了蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在雙水相89雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以及酶的進(jìn)一步精制。1.雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取。（四）、雙水相萃取的應(yīng)用雙水相系統(tǒng)可用于細(xì)胞碎片以及酶的進(jìn)一步精制。1.雙水相萃取90在兩水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。這實(shí)際上是一種反應(yīng)和分離耦合的過程，有時(shí)也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化；如果發(fā)生的是一種發(fā)酵過程，則也稱為萃取發(fā)酵，因而此時(shí)也可以把兩水相系統(tǒng)稱為兩水相反應(yīng)器。2.兩水相反應(yīng)器在兩水相系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另91

第二章蛋白質(zhì)的制備

---細(xì)胞破碎與萃取第二章蛋白質(zhì)的制備

---細(xì)胞破碎92第一節(jié)蛋白質(zhì)制備總則

來源、胞內(nèi)（胞外）、可溶性、分子大小、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性（對溫度、pH、蛋白酶、金屬離子的耐受性）等二、方法選擇依據(jù)：

根據(jù)不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)和研究目的一、目標(biāo)：高效率、高收率、高純度、高活性1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)：第一節(jié)蛋白質(zhì)制備總則來源、二、方法選擇依據(jù)：一、目93

工業(yè)化應(yīng)用：經(jīng)濟(jì)性（高收率，純度次要）一般研究：80%-90%純度結(jié)構(gòu)研究：95%以上純度醫(yī)療：全面分析2、研究目的：

越到后面的純化越困難，增加成本，延長操作時(shí)間，收率低

考慮產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量和經(jīng)濟(jì)性工業(yè)化應(yīng)用：經(jīng)濟(jì)性（高收率，純度次要）2、研究目的：94三、確立有效成分的測定方法1、蛋白質(zhì)初步提取和濃縮

吸附法超濾法沉淀法（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀）透析三、確立有效成分的測定方法1、蛋白質(zhì)初步提取和濃縮吸95三、確立有效成分的測定方法2、蛋白質(zhì)高效分離純化

色譜法（凝膠過濾、離子交換、親和色譜等）電泳法

（聚丙烯酰胺凝膠、等電聚焦、毛細(xì)管電泳等）三、確立有效成分的測定方法2、蛋白質(zhì)高效分離純化色譜963、根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)確立分離方法溶解度不同：等電點(diǎn)，有機(jī)溶劑，鹽析電荷不同：電泳，離子交換分子形狀大小不同：離心，透析，凝膠過濾3、根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)確立分離方法溶解度不同：等電點(diǎn)，有機(jī)溶劑，97四、蛋白質(zhì)的制備流程：原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎碎片分離清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超過濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超過濾)濃縮(超過濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性四、蛋白質(zhì)的制備流程：原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)98首先：材料的選擇和預(yù)處理細(xì)胞的破碎和細(xì)胞組分分離有效成分的萃取首先：材料的選擇和預(yù)處理99第二節(jié)材料的選擇、預(yù)處理與保存一、原料選擇原則：有效成分含量高、原料來源豐富，易得；原料中雜質(zhì)含量少；原料成本低等；植物采收具有季節(jié)性微生物生長的對數(shù)期注意動物的年齡與性別第二節(jié)材料的選擇、預(yù)處理與保存一、原料選擇原則：有效成100微生物：及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。二、原料的預(yù)處理：動物原料：采集后要立即處理，去除結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存。植物原料：要擇時(shí)采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鮮處理。微生物：及時(shí)將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。二、原料的預(yù)101（3）防腐劑保鮮：常用乙醇、苯酚等。適用于液體原料，如發(fā)酵液、提取液等。三、原料的保存方法（1）冷凍法：適用于所有生物原料。常用-40℃速凍。（2）有機(jī)溶劑脫水法：丙酮，該法適用于原料少而價(jià)值高、有機(jī)溶劑對活性物質(zhì)沒有破壞作用的原料，如腦垂體等。（3）防腐劑保鮮：常用乙醇、苯酚等。適用于液體原三、原料的保102第三節(jié)細(xì)胞破碎一、破碎方法的原則和依據(jù)

原則：最大提取、不易變性、減少干擾具體須從材料特性和目的物特性綜合考慮。第三節(jié)細(xì)胞破碎一、破碎方法的原則和依據(jù)原則：最大提取1031、材料細(xì)胞的特性

動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，易破碎，只需用溫和方法植物細(xì)胞有細(xì)胞壁難破碎，須用中等或強(qiáng)度大的方法微生物細(xì)胞較復(fù)雜，一般用較強(qiáng)的方法1、材料細(xì)胞的特性動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，易破碎，只需用溫和方1042、目的物的特性⑶.處理量

有些處理量大，如組織搗碎機(jī)等。有些處理量少，如超聲波破碎等。

⑴．細(xì)胞中的位置游離狀：只需溫和破碎，除去不溶部分。結(jié)合狀：結(jié)合在膜或細(xì)胞器內(nèi)，先收集膜或細(xì)胞器，再破碎⑵．敏感性

溫度、pH、氧、剪切力、雜酶等影響2、目的物的特性⑶.處理量⑴．細(xì)胞中的位置⑵．敏感性105㈠機(jī)械法1.組織搗碎機(jī)：

適用：動植物組織二、破碎方法原理：機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生剪切力的作用破細(xì)胞具體方法：2.勻漿器

適用：較柔軟、易分散的組織細(xì)胞3.研缽

適用：微生物（細(xì)菌）與植物細(xì)胞㈠機(jī)械法1.組織搗碎機(jī)：適用：動植物組織二、破碎方法106㈡物理法1．超聲波破碎2．滲透壓沖擊法：適用：處理胞壁較脆弱的微生物。細(xì)胞放在高滲溶液中，由于滲透壓作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂㈡物理法1．超聲波破碎2．滲透壓沖擊法：適用：處理胞壁較脆1073．反復(fù)凍融法：-15℃～-20℃，適用：動物材料將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。4．急熱驟冷法：

85～90℃數(shù)分鐘，冰浴冷卻適用：細(xì)菌及病毒中對熱不太敏感的物質(zhì)3．反復(fù)凍融法：-15℃～-20℃，適用：動物材料4．急108㈢．化學(xué)法2．

表面活性劑法

破壞細(xì)胞膜，釋放目的物（需與其它方法結(jié)合應(yīng)用）。

1．

溶劑處理法：

丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂質(zhì)化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。㈢．化學(xué)法2．

表面活性劑法1．

溶劑處理法：丙酮、氯109（四）酶解法2．

外加酶法

將細(xì)胞壁分解，使內(nèi)含物釋放出來。細(xì)菌：加溶菌酶（結(jié)合反復(fù)凍融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加幾丁質(zhì)酶植物材料：加纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等。1．

自溶法保溫一定時(shí)間，通過細(xì)胞本身的酶將細(xì)胞破壞。（四）酶解法2．

外加酶法1．

自溶法110例：外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包含體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包含體凝乳酶原形成包含體牛生長激素>30%形成包含體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包含體人胰島素原5%~26%形成包含體三、包含體及其純化例：外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白0產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源111包涵體（inclusionbodies），或包含體，是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包涵體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。包涵體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。包涵體（inclusionbodies），或包含體，是無定112包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包涵體后，溶解包涵體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生化工程師生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為生物化學(xué)家的蛋白質(zhì)折疊（proteinfolding）機(jī)理研究提出了新的課題。包涵體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。這些基因表達(dá)113重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的新紀(jì)元。但是，人們在分離純化基因工程表達(dá)產(chǎn)物時(shí)遇到了意想不到的困難，很多利用大腸桿菌為宿主細(xì)胞的外源基因表達(dá)產(chǎn)物（如尿激酶、人胰島素、人生長激素、白細(xì)胞介素－６、人γ－干擾素等）不僅不能分泌到細(xì)胞外、而且在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有生物活性的固體顆粒－包涵體（inclusionbodiesIBs)。重組DNA技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)提供了嶄新的途徑，開辟了1142、包含體的構(gòu)成基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，所以沒有生物活性。分離包含體后，需使目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。（蛋白質(zhì)折疊）

包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達(dá)產(chǎn)物。2、包含體的構(gòu)成基因表達(dá)產(chǎn)物的一級結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是1153、包含體特點(diǎn):是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。包含體難溶于水，易溶于變性劑（如鹽酸胍、脲）。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，離心（5000-20000g15min）就可以沉淀。3、包含體特點(diǎn):是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。包116幾種常見的工藝路線（一）機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）差速離心提取出包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（一）機(jī)械破碎差速離心提取出包含體加變性劑117路線1的特點(diǎn)

特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡單。

缺點(diǎn):要經(jīng)過幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長?；蚬こ贪w的純化方法路線1的特點(diǎn)特點(diǎn):用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性118幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離除可溶性蛋白加變性劑溶119路線2的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染?；蚬こ贪w的純化方法缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開；而且膜的堵塞和濃差極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。路線2的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白120幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性基因工程包含體的純化方法幾種常見的工藝路線（三）化學(xué)破碎離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性基121

路線3特點(diǎn)：基因工程包含體的純化方法優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。缺點(diǎn)：所有的可溶性雜質(zhì)都沒有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來困難。路線3特點(diǎn)：基因工程包含體的純化方法優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法破碎，所122一、概述第四節(jié)萃取1、基本概念及分類概念：萃取是利用溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的技術(shù)。一、概述第四節(jié)萃取1、基本概念及分類123液-固萃取液-液萃取化學(xué)萃取物理萃取雙水相萃取超臨界萃取萃取原理參與溶質(zhì)分配的兩相不同分類：液-固萃取液-液萃取化學(xué)萃取物理萃取雙水相萃取超臨界萃取萃取124概念：用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程稱為固-液萃取，也稱浸取或浸出。應(yīng)用：用溫水從甜菜中提取糖，用有機(jī)溶劑從大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有機(jī)溶劑從植物中提取藥物、香料或色素等。液-固萃取概念：用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過程稱為125用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)叫液-液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液-液萃取指的是有機(jī)溶劑萃取液-液萃取有機(jī)溶劑萃取法廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模的提取上。應(yīng)用比化學(xué)沉淀法分離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低；生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、易實(shí)現(xiàn)自動化控制優(yōu)點(diǎn)用溶劑從溶液中抽提物質(zhì)叫液-液萃取，也稱溶劑萃取。經(jīng)典的液-126溶劑萃取法和其他新型分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了一系列新型分離技術(shù)：超臨界流體萃取（Supercriticalfluidextraction）反膠團(tuán)萃?。≧eversedmicelleextraction）雙水相萃取技術(shù)（Partitionoftwoaqueousphasesystem）液-液萃取用于高品質(zhì)的天然物質(zhì)、胞內(nèi)物質(zhì)（胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等）的分離提取上。溶劑萃取法和其他新型分離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生液-液萃取用于高品質(zhì)127根據(jù)萃取原理分類的基本概念化學(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與溶質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成脂溶性復(fù)合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相分配的過程。物理萃取溶質(zhì)根據(jù)相似相溶的原理在兩相間達(dá)到分配平衡而進(jìn)行萃取的分離過程。根據(jù)萃取原理分類的基本概念化學(xué)萃取利用脂溶性萃取劑與1282、萃取技術(shù)的操作特點(diǎn)①萃取過程具有選擇性②能與其他純化步驟相配合③適用于各種不同的規(guī)模④傳質(zhì)速度快，生產(chǎn)周期短，便于連續(xù)操作

2、萃取技術(shù)的操作特點(diǎn)①萃取過程具有選擇性1293、萃取需要考慮下列問題①生物系統(tǒng)的錯綜復(fù)雜和多組分特性②產(chǎn)物的不穩(wěn)定性③相分離性能3、萃取需要考慮下列問題①生物系統(tǒng)的錯綜復(fù)雜和多組分特性②130把目標(biāo)物質(zhì)從第一個液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個液相中。物質(zhì)的溶解和相似相溶原理。萃取是通過溶質(zhì)在兩個液相之間的竟?fàn)幮匀芙猓ǚ峙洌┒鴮?shí)現(xiàn)的。二、溶劑萃取技術(shù)（液-液萃?。┌涯繕?biāo)物質(zhì)從第一個液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個液相中131影響萃取操作的因素：溫度pH值鹽分溫度↑互溶性增大；溫度↓產(chǎn)物穩(wěn)定性提高，粘度增加，擴(kuò)散性能減小。影響分配系數(shù)，影響物質(zhì)解離情況無機(jī)鹽類如硫酸銨、氯化鈉等一般可降低產(chǎn)物在水中的溶解度而使其更易于轉(zhuǎn)入有機(jī)溶劑相中，另一方面還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。鹽分↑分配系數(shù)↑影響萃取操作的因素：溫度溫度↑互溶性增大；影響分配系數(shù)，影響132d．乳化分散非均相一種另一種乳劑均相（溶液）

乳化即水或有機(jī)溶劑以微小液滴分散在有機(jī)相或水相中的現(xiàn)象。d．乳化分散非均相一種另一種乳劑均相（溶液）乳化即水或有機(jī)133乳化劑類型

乳狀液可分為兩大類型水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/O，水分散在油中O/W(水包油型)W/O(油包水型)乳化劑類型乳狀液水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/134

（親憎平衡值）HLBHLB數(shù)即親水與親油平衡程度，HLB數(shù)越大，親水性越強(qiáng)，形成O/W型乳濁液，HLB數(shù)越小，親油性越強(qiáng)，形成W/O型乳濁液。（親憎平衡值）HLBHLB數(shù)即親水與親油平衡程度，135乳化與去乳化在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物質(zhì)。

由蛋白質(zhì)引起的乳化多為水包油型（O/W）。乳化帶來的問題：有機(jī)相和水相分相困難，出現(xiàn)夾帶。乳化與去乳化在發(fā)酵液中，蛋白質(zhì)是引起乳化的最重要的表面活性物136破乳的方法：1.加熱破乳

升溫加速乳狀液液珠的布朗運(yùn)動使絮凝速率加快，同時(shí)使界面粘度迅速降低，使聚結(jié)速率加快，有利于膜的破裂。2.高壓電破乳

高壓電場的破乳較復(fù)雜不能只看作擴(kuò)散雙電層的破壞，在電場下液珠質(zhì)點(diǎn)可排成一行，呈珍珠項(xiàng)鏈?zhǔn)?，?dāng)電壓升到某一值時(shí)，聚結(jié)過程在瞬間完成。破乳的方法：1.加熱破乳升溫加速乳狀液液珠的1373.過濾破乳

當(dāng)乳狀液經(jīng)過一個多孔性介質(zhì)時(shí)，由于油和水對固體潤濕性的差別，也可引起破乳。4.化學(xué)破乳

化學(xué)破乳的原則是破壞吸附在界面上的乳化劑，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳劑。破乳劑也是一種表面活性劑，有很高的表面活性，能將界面上原來存在的乳化劑頂替走；但破乳劑分子一般具有分支結(jié)構(gòu)，不能在界面上緊密排列成牢固的界面膜，從而使乳狀液的穩(wěn)定性大大降低。3.過濾破乳當(dāng)乳狀液經(jīng)過一個多孔性介質(zhì)時(shí)，由1385.電解質(zhì)破乳

對于稀的乳狀液，起穩(wěn)定作用的是擴(kuò)散雙電層，加入電解質(zhì)可破壞雙電層，也能使乳狀液聚沉5.電解質(zhì)破乳對于稀的乳狀液，起穩(wěn)定作用的是139三反膠束萃取

（反膠團(tuán)萃?。┤茨z束萃取

（反膠團(tuán)萃?。?401、基本術(shù)語膠束(micelles):

向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨[S]增大而下降。當(dāng)[S]達(dá)到一定值后，溶液的表面張力不再隨表面活性劑濃度的增大而降低。臨界膠束濃度(criticalmicelleconcentration,CMC):

S在水溶劑中形成膠束的最低濃度。1、基本術(shù)語膠束(micelles):向水中加入表面活性劑141反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中加入一定濃度S和水，在有機(jī)溶劑中所會形成內(nèi)部含少量水的膠束。微水相或“水池”(waterpool)：反膠束內(nèi)溶解的水。反膠束(reversemicelles):若向有機(jī)溶劑中142細(xì)胞破碎與提取要點(diǎn)課件1432 反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用：

反膠團(tuán)的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.因此,反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。2 反膠束的溶解作用1442 反膠束的溶解作用溶解推動力A 靜電作用：

理論上,當(dāng)溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時(shí),由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團(tuán),溶解率或分配系數(shù)較大,反之,則不能溶解到反膠團(tuán)相中,左圖為pH值對不同蛋白質(zhì)的溶解率急劇變化,當(dāng)pH<7,即在帶正電荷的pH范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對蛋白質(zhì)的反膠團(tuán)萃取起決定性作用。2 反膠束的溶解作用溶解推動力1452、反膠束的溶解作用B 空間相互作用

鹽濃度增大對反膠團(tuán)相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團(tuán)直徑減小,空間排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與I-0.5成正比。圖還示：AOT/異辛烷系統(tǒng)的含水率與AOT濃度無關(guān),這是多數(shù)反膠團(tuán)系統(tǒng)的共性.2、反膠束的溶解作用B 空間相互作用1463、反膠束萃取的影響因素1)pHvalueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸鈉。3、反膠束萃取的影響因素1)pHvalue1472)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性2)鹽濃度鹽濃度W0S&ProZ選擇性1483)、鹽離子的種類3)、鹽離子的種類1494)蛋白質(zhì)分子量M4)蛋白質(zhì)分子量M1505)、表面活性劑SA 種類B [S]5)、表面活性劑S1516)助表面活性劑6)助表面活性劑1524、應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離4、應(yīng)用1)蛋白質(zhì)分離1532)胞內(nèi)酶的提取2)胞內(nèi)酶的提取154四、超臨界流體萃取

SupercriticalFluidExtraction四、超臨界流體萃取

SupercriticalFluid155簡介：超臨界流體萃取(SCF)是20世紀(jì)70年代后期迅速發(fā)展起來的一種新興的萃取分離技術(shù)，是利用超臨界流體作為萃取劑，對物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程。超臨界流體具有氣體和液體之間的性質(zhì)，且對許多物質(zhì)均具有很強(qiáng)的溶解能力，分離速率遠(yuǎn)比液體萃取快，可以實(shí)現(xiàn)高效的分離過程。簡介：超臨界流體萃取(SCF)是20世紀(jì)70年代后期迅速發(fā)展156超臨界流體的發(fā)展

1822年，首次報(bào)道1879年，發(fā)現(xiàn)超臨界流體對固體有溶解能力1970年從咖啡豆提取咖啡因1992年，首先報(bào)道了超臨界聚合反應(yīng)超臨界流體的發(fā)展

1822年，首次報(bào)道157（一）、超臨界流體的萃取的原理1.流體的臨界特征氣相、液相、固相三相成平衡態(tài)共存的點(diǎn)叫三相點(diǎn)。液、氣兩相成平衡狀態(tài)的點(diǎn)叫臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)是所要求的溫度和壓力分別稱為臨界溫度（Tc）和臨界壓力（pc）。穩(wěn)定的純物質(zhì)及由其組成的固定組分混合物具有固有的臨界狀態(tài)點(diǎn)。（一）、超臨界流體的萃取的原理1.流體的臨界特征158超臨界流體(SCF)超臨界流體(SCF)1592.超臨界流體的特征超臨界流體(SCF)是處于臨界溫度和臨界壓力以上的非凝縮性的高密度流體。超臨界流體沒有明顯的氣-液界面，既不是氣體，也不是液體，是一種氣-液不分的狀態(tài)，性質(zhì)介于氣體和液體之間。流體處于超臨界狀態(tài)時(shí)，其密度接近液體密度，并且隨流體壓力和溫度的變化發(fā)生十分明顯的變化。2.超臨界流體的特征超臨界流體(SCF)是處于臨界溫度和臨160超臨界流體的性質(zhì)

物理特征

密度（g/cm3）

粘度（g/cm/s）

擴(kuò)散系數(shù)（cm2/s）

氣體（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2

液體0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3超臨界流體的性質(zhì)

物理密度161超臨界流體的主要特性

密度類似液體壓力和溫度的變化均可改變相變粘度,擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體SCF的介電常數(shù)，極化率和分子行為與氣液兩相均有著明顯的差別超臨界流體的主要特性

密度類似液體162溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨超臨界流體密度的增大而增大。2.超臨界流體的特征超臨界流體萃取正是利用這種性質(zhì)，在較高壓力下，將溶質(zhì)溶解于流體中，然后降低流體溶液的壓力或升高流體溶液的溫度，使溶解于超臨界流體中的溶質(zhì)因密度下降，溶解度降低而析出，從而實(shí)現(xiàn)特定溶質(zhì)的萃取。溶質(zhì)在超臨界流體中的溶解度隨超臨界流體密度的增大而增大。2.163可作為超臨界流體的物質(zhì)：二氧化碳、一氧化亞氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等?？勺鳛槌R界流體的物質(zhì)：164常用的流體介質(zhì)

二氧化碳：臨界溫度：31.1℃；臨界壓力：7.2MPa臨界條件容易達(dá)到、化學(xué)性質(zhì)不活潑、無色無味無毒、安全性好、價(jià)格便宜、純度高、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)常用的流體介質(zhì)

二氧化碳：1653.超臨界流體萃取特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn))①萃取和分離合二為一②壓力和溫度都可以成為調(diào)節(jié)萃取過程的參數(shù)③萃取溫度低④臨界CO2流體常態(tài)下是氣體，無毒⑤超臨界流體的極性可以改變3.超臨界流體萃取特點(diǎn)(優(yōu)點(diǎn))①萃取和分離合二為一1664.萃取技術(shù)的應(yīng)用舉例

生物活性物質(zhì)和生物制品的提取

CO2萃取技術(shù)主要應(yīng)用于有害成分成分的脫除、有效成分的提取、食品原料的處理等幾個方面。例如：用SFE從咖啡、茶中脫咖啡因；啤酒花萃取；從植物中萃取風(fēng)味物質(zhì)；從各種動植物中萃取各種脂肪酸、提取色素；從奶油和雞蛋中去除膽固醇等。4.萃取技術(shù)的應(yīng)用舉例生物活性物質(zhì)和生物制品的提取167例1脫咖啡因超臨界流體萃取技術(shù)得到最早大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用的是天然咖啡豆的脫咖啡因。用SF-CO2法從咖啡豆中脫出咖啡因工藝流程

例1脫咖啡因用SF-CO2法從咖啡豆中脫出咖啡因工藝流程168例2.啤酒花萃取普通的有機(jī)溶劑萃取法制取