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關(guān)于有機物定量分析第一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/51有機定量分析
pro是復(fù)雜的含氮有機化合物,它的溶液是典型的膠體分散體系,由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物,它主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。對于不同的pro,它的組成和結(jié)構(gòu)不同,但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的pro的元素組成百分比。元素組成百分比:元素
C
H
O
N
S
P
百分比50
7
23
16
0-3
0-3一般來說,pro的平均含氮量為100/16,所以在用凱氏定氮法定量pro時,將測得的總氮%乘上pro的換稱參數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。但當測定的樣品其含氮的系數(shù)與上面100/16相差較大時,采用6.25將會引起顯著的偏差。一蛋白質(zhì)的定量分析方法
第二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/52有機定量分析
對于氮含量換算成pro含量的等數(shù),歷來采用6.25,這個數(shù)值是以pro平均含氮而導(dǎo)出的數(shù)值,但是食品中含氮的比例,因食品種類不同,差別是很大的,我們在測定pro時,應(yīng)該是不同的食品采用不同的換算等數(shù),一般手冊上列出了一部分換稱等數(shù):蛋=6.25,肉=6.25,牛乳=6.38,稻米=5.95,大麥=5.83,玉米=6.25,小麥=5.83,麩皮=6.31,面粉=5.70。如果手冊上查不到的樣品則可用6.25,一般在寫報告時要注明采用的換算等數(shù)以何物代替。近幾年,國際組織認為6.25的換算等數(shù)太高,特別是對蛋品、肉品及魚類,貝類等動物性食品,根據(jù)以氨基酸組成總量計算的比6.25要低的多。關(guān)于氮-pro換算等數(shù)第三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/53有機定量分析pro的測定方法分為兩大類:
一類是利用pro的共性,即含氮量,肽鏈和折射率測定pro含量.另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團和芳香基團測定pro含量。但是食品種類很多,食品中pro含量又不同,特別是其他成分,如碳水化合物,脂肪和維生素的干擾成分很多,因此pro的測定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾,用標準酸液吸收,用標準酸或堿液滴定,由樣品中含氮量計算出pro的含量。根據(jù)食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法,但它們的基本原理都是一樣的。第四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/54有機定量分析
這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明,當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣,來定量谷物中的pro,他只知用H2SO4分解試樣,而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程,所以只使用H2SO4分解試樣,需要較長時間,后來由Gunning加入改進,他改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升,這樣加快分解速度,因為溫度由原來硫酸沸點的330上升到400℃,所以速度也就加快了,凱氏定氮法至今仍在使用。我們在檢驗食品中pro時,往往只限于測定總氮量,然后乘以pro核算等數(shù),得到蛋白質(zhì)含量,實際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物,故稱為粗pro。(一)凱氏定氮法第五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/55有機定量分析首先第一個步驟是消化:(1)消化:樣品與硫酸一起加熱消化,硫酸使有機物脫水。并破壞有機物,使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出,而pro則分解氮,則與硫酸結(jié)合成硫酸銨,留在酸性溶液中。在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解,它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀,可提高反應(yīng)溫度,一般純硫酸加熱沸點330℃,而添加硫酸鉀后,溫度可達400℃,加速了整個反應(yīng)過程。此外,也可以加入硫酸鈉,氫化鉀鹽類來提高沸點。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解,水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大,沸點增加。加速了有機的分解。但硫酸鉀加入量不能太大,否則溫度太高,生成的硫酸氫銨也會分解,放出氨而造成損失。為了加速反應(yīng)過程,還加入硫酸銅,氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫,次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。
第六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/56有機定量分析(2)蒸餾:樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨,在這操作中,一是加入氫氧化鈉溶液要過量,二是要防止樣液中氨氣逸出。
(3)吸收與滴定:蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收,然后再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液,從而計算出總氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后,再用標準鹽酸直接滴定,硼酸呈微弱酸性,用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng),它有吸收氨的作用。
第七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/57有機定量分析MRMOMR(凱氏定氮法)NaOHHCl第八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/58有機定量分析凱氏定氮裝置1.安全管2.導(dǎo)管3.汽水分離器4.塞子5.進樣口6.冷凝管7.吸收瓶8.隔熱液套9.反應(yīng)管10.蒸汽發(fā)生器消化樣品濃H2SO4CuSO4·5H2OK2SO4樣品空白2.蒸NH3第九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/59有機定量分析計算:
N(V2-V1)14.01
總氮量%=
-----------------------------
×
100
W
pro%=總氮%×K
乳制品K=6.38(N=15.7%)
小麥粉K=5.79(N=17.6%)
動物膠K=5.6(N=18.0%)
冰蛋K=6.7(N=14.8%)
大豆制品K=6.0(16.7%)
K=6.25則(N=16%)
K-換稱等數(shù)第十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/510有機定量分析
(1)消化時間一般約4小時左右即可,消化時間過長會引起氨的損失。如樣品中含賴氨酸或組氨酸較多時,消化時間需延長1—2倍。因為這兩種氨基酸中的氮在短時間內(nèi)不易消化完全,往往導(dǎo)致總氮量偏低。注意事項
(2)若樣品中脂肪或糖較多時,消化時間要長些。還應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫,防止它溢出瓶外。須時時搖動,并減小火焰,甚至停止加熱半小時底再用小火消化。第十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/511有機定量分析
在消化過程中為了加速分解過程,縮短消化時間,常加入下列物質(zhì):樣品的分解條件功用是提高溶液的沸點。K2SO4
在消化過程中,隨著硫酸的不斷分解,水分的不斷蒸發(fā),K2SO4的濃度逐漸增大,則沸點升高,加速了對有機物的分解作用。
K2SO4與硫酸的用量比值不宜過大,因溫度過高,生成的硫酸氫銨也會分解,放出氨,使氮損失。第十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/512有機定量分析
Cu2SO4為紅色沉淀,當C完全消化后,反應(yīng)停止,紅色消失,變?yōu)樘m色,即為消化達到完全,蘭色為CuSO4的顏色催化劑CuSO4:氧化汞和汞:氧化汞和汞是良好的催化劑
氧化汞和汞都是劇毒物質(zhì),使用時必須有安全可靠的通風(fēng)設(shè)備,還會污染環(huán)境,而且價格昂貴。第十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/513有機定量分析硒粉催化效能可大大縮短消化時問。第十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/514有機定量分析
(1)次氯酸鉀和高錳酸鉀一般不宜使用這類強氧化劑。次氯酸鉀的催化作用強,由于其氧化性強,可將一部分氨進一步氧化成氮而損失。若試樣富含碳時,可使用高錳酸鉀。
(2)過氧化氫具有消化速度高,操作簡便的優(yōu)點,近常推薦采用這種氧化劑。但在使用時要特別注意,須待消化液完全冷卻后再加入數(shù)滴過氧化氫。氧化劑
添加氧化劑可幫助有機物消化,但要防止氨進一少氧化為氮。一般說來,若有足夠量的其他還原劑,如碳,則添加氧化則不致使測定結(jié)果偏低。第十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/515有機定量分析一、原理
考馬斯亮藍G-250以兩種不同顏色存在即紅色與藍色,當染色劑與蛋白質(zhì)結(jié)合時,紅色就轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色。這種蛋白質(zhì)染色劑復(fù)合物有較高的消光系數(shù)。因此,用這種方法測定蛋白質(zhì)含量靈敏度比較高,染色劑和蛋白質(zhì)的結(jié)合過程迅速,大約2分鐘,而且蛋白質(zhì)—染色劑復(fù)合物能在溶液中保持穩(wěn)定1小時之久。(二)可溶性蛋白質(zhì)的測定(考馬斯亮藍G-250法)第十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/516有機定量分析CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/517有機定量分析二、材料、儀器與試劑(一)材料:綠豆芽、馬鈴薯。(二)儀器:分光光度計,分析天平,容量瓶、移液管、具塞刻度試管。(三)試劑1.考馬斯亮藍G-250蛋白試劑:稱取100mg考馬斯亮藍G-250,溶于50ml90%乙醇中,加入85%正磷酸100ml,最后加蒸餾水至1000ml,此溶液可在常溫下放置一個月。
試劑2.蛋白質(zhì)標準液:稱取100mg牛血清蛋白,溶于100ml蒸餾水中,制成100μg·ml-1
貯備液。再按下表比例配制成每毫升分別含200μg,400μg,600μg,800μg,1000μg蛋白標準液及每毫升分別含20μg,40μg,60μg,80μg,100μg蛋白的標準液。表1高濃度蛋白質(zhì)標準液的配制蛋白濃度(μg·ml-1)2004006008001000加貯備液(ml)0.40.81.21.62.0加蒸餾水(ml)1.61.20.80.40
第十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/518有機定量分析表2低濃度蛋白質(zhì)標準液的配制蛋白濃度(μg·mL-1)20406080100加貯備液(mL)0.20.40.60.81.0加蒸餾水(mL)9.89.69.49.29.0
三、操作步驟(一)標準曲線的制作1.100~1000μg·ml-1
蛋白標準曲線:準確吸取含有200μg,400μg,600μg,800μg,1000μg的牛血清蛋白標準液0.1ml,分別放入10ml刻度試管中,加入5.0ml考馬斯亮藍G-250蛋白試劑,將溶液混勻,2分鐘后在595nm處測其消光值,空白以蒸餾水代替標準液,其它操作同上。第十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/519有機定量分析2.0~100μg·ml-1
蛋白標準曲線:準確吸取0.5ml含20μg,40μg,60μg,80μg,100μg牛血清蛋白標準液,分別放入10ml具塞刻度試管中,加入5.0ml考馬斯亮藍G-250蛋白試劑,其它操作同上。以消光值為縱坐標,蛋白含量為橫坐標,作標準曲線。(二)樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定:樣品中蛋白質(zhì)濃度的測定除加入標準溶液作為樣品液外,其余操作完全相同,通過標準曲線即可查得每毫升溶液中蛋白質(zhì)的含量。四、注意事項1在配制不同濃度蛋白質(zhì)溶液時,比色管一要事先干燥。
2在分別吸取蛋白質(zhì)溶液后應(yīng)立即蓋上塞子,避免水分蒸發(fā)影響測定的結(jié)果。
第二十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/520有機定量分析1原理:
pro及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基,在紫外區(qū)內(nèi)對某一波長具有一定的光選擇吸收,在280nm下,光吸收與pro濃度(3~8mg/ml)成直線關(guān)系,因此,通過測定pro溶液的吸光度,并參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品,從標準曲線查出蛋白質(zhì)的含量。(三)紫外分光光度法第二十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/521有機定量分析2
試劑:
(1)0.1mol/l檸檬酸水溶液。(2)8mol/l脲[(NH2)2CO]的2NNaOH溶液。脲的2N氫氧化物(3)
95%乙醇(4)無水乙醚3
儀器(1)
紫外分光光度計(2)
離心機4
操作方法(1)標準曲線的繪制:
準確稱取樣品.2.00g,置于50ml燒瓶中,加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml,攪拌30分鐘使其充分溶解,用四層紗布過濾于玻璃離心管中。第二十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/522有機定量分析
以每秒鐘3000~5000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘,分別吸出上清液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml于6個10ml容量瓶中,每個容量瓶,8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘(如果渾濁再次離心),取透明液于比色皿中,在280nm下測定其吸光度。(做參比值)以事先用K氏定氮法測定的樣品中蛋白質(zhì)的含量為橫坐標上面的吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。(2)樣品測定準確稱取試樣1.00g→于50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鐘→四層紗布過濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容,搖勻后于280nm下測吸光度,從標準曲線上查出pro的含量。說明:a.此法運用于糕點,牛乳和可溶性pro樣品,測定糕點時,應(yīng)把表皮顏色去掉。
b.溫度對pro水解有影響,操作溫度應(yīng)控制在20~30℃。第二十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/523有機定量分析
原理:
雙縮脲在堿性條件中,能與CuSO4結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似,也呈此反應(yīng)。本法直接用于測定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩(wěn)定劑,酒石酸鉀鈉比甘油好些。(四)雙縮脲法-皮尼克法
準確稱樣→0.5g→于80ml離心管→加1mlCCl4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑→蓋上蓋子離心10min(4000轉(zhuǎn)/分)→放置1小時→吸混合液15ml→于20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm處測定吸光度,從標準曲線上查出pro含量。
計算:蛋白質(zhì)%=C/W×100C----從標準曲線上查得得pro含量(mg)W----測定樣液時相當于樣品重量(mg)第二十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/524有機定量分析
pro經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的pro成分,如水解后的產(chǎn)物經(jīng)胨,肽等最后成為氨基酸,氨基酸是構(gòu)成pro最基本的物質(zhì)。水解后的pro和水解前的pro在物理特性,化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的,其差別與水解的程度有密切關(guān)系,分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度,也就可以評價食品的營養(yǎng)價值。二氨基酸總量測定
氨基酸不是單純的一種物質(zhì),用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴,不能普遍使用),對于食品來說有時有很多種氨基酸可以同時存在于一種食品中,所以需要測定總的氨基酸量,它們不能以氨基酸百分率來表示,只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸態(tài)氮)的百分率表示,當然,如果食品中只含有一種氨基酸,如味精中的谷氨酸,就可以從含氮量計算出氨基酸的含量。第二十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/525有機定量分析一、原理氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用,生成藍色化合物(除脯氨酸外均有此反應(yīng)),可用吸光光度法測定。該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比,其最大吸收波長為570nm,故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。茚三酮法測定氨基酸總量二、主要儀器分光光度計三、試劑2%茚三酮溶液:稱取茚三酮1g于盛有35mL熱水的燒杯中使其溶解,加入40mg氯化亞錫(SnCl2·H2O),攪拌過濾(作防腐劑)。濾液置冷暗處過夜,加水至50mL,搖勻備用。
pH8.04磷酸緩沖溶液:準確稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.5350g于燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,定量轉(zhuǎn)入500mL容量瓶中,用水稀釋至標線,搖勻備用。準確稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4)11.9380g于燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,定量轉(zhuǎn)入500mL容量瓶中,用水稀釋至標線,搖勻備用。取上述配好的磷酸二氫鉀溶液10.0mL與190mL磷酸氫二鈉溶液混合均勻即為pH8.04的磷酸緩沖溶液。第二十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/526有機定量分析3.氨基酸標準溶液:準確稱取干燥的氨基酸(如異亮氨酸)0.2000g于燒杯中,先用少量水溶解后,定量轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中,用水稀釋至標線,搖勻。準確吸取此液10.0mL于100mL容量瓶中,加水至標線,搖勻。此為200μg·mL-1氨基酸標準溶液。四、操作方法
1.標準曲線繪制準確吸取200μg·mL-1的氨基酸標準溶液0.0mL,0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,2.5mL,3.0mL(相當于0μg,100μg,200μg,300μg,400μg,500μg,600μg氨基酸),分別置于25mL容量瓶或比色管中,各加水補充至容積為4.0mL,然后加入茚三酮和磷酸緩沖溶液各1mL,混合均勻,于水浴上加熱15分鐘,取出迅速冷至室溫,加水至標線,搖勻。靜置15分鐘后,在5570nm波長下,以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克數(shù)為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線。第二十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/527有機定量分析2.樣品的測定吸取澄清的樣品溶液1~4mL,按標準曲線制作步驟,在相同條件下測定吸光度A值,用測得的A值在標準曲線上即可查得對應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。
說明及注意事項
1.通常采用樣品處理方法為:準確稱取粉碎樣品
5~10g或吸取液體樣品
5~10mL,置于燒杯中,加入50mL蒸餾水和5g左右活性炭,加熱煮沸,過濾,用30~40mL熱水洗滌活性炭,收集濾液于100mL容量瓶中,加水至標線,搖勻備測。2.茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色,使用前須進行純化,方法如下:取10g茚三酮溶于40mL熱水中,加入1g活性炭,搖動1分鐘,靜置30分鐘,過濾。將濾液放入冰箱中過夜,即出現(xiàn)藍色結(jié)晶,過濾,用2mL冷水洗滌結(jié)晶,置干燥器中干燥,裝瓶備用。
3.空氣中氧氣干擾顯色一步,抗壞血酸保護可以提高靈敏度。4.溫度超過80℃容易褪色;適當延長溫?zé)釙r間效果較好。第二十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/528有機定量分析碳水化合物的測定
碳水化合物是生物界三大物質(zhì)之一(Pro,Fat),是自然界最豐富的有機物質(zhì)。碳水化合物主要存在于植物界,如谷類食物和水果蔬菜的主要成分是(CH2O)n。碳水化合物統(tǒng)稱為糖類,它包含了單糖、低聚糖及多糖,是大多數(shù)食品中重要組成成分,也是人和動物體的重要能源。單糖、雙糖、淀粉能為人體所消化吸收,提供熱能,果膠、纖維素維持人體健康具有重要作用。第二十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/529有機定量分析常用的混合糖的分離純化方法一.提取常用溶劑有:水和乙醇,在提取糖類時,先將樣品磨碎浸泡成溶液,若有脂肪的樣品用石油醚提取,撤去其中的脂肪和葉綠素。1.
水作提取劑用水作提取劑,溫度控制在45-50℃,利用水作提取劑時,還有pro、氨基酸、多糖、色素干擾,影響過濾時間,所以用水作提取劑應(yīng)注意:1)溫度過高:是可溶性淀粉及糊精提取出來。2)酸性樣品:酸性使糖水解(轉(zhuǎn)化),所以酸性樣品用碳酸鈣中和,提取但應(yīng)控制在中性。3)萃取的液體:有酶活性時,同樣是使糖水解,加二氯化汞可防止(二氯化汞可抑制酶活性)2.乙醇(水溶液)作提取液乙醇作提取液適用于含酶多的樣品,這樣避免糖被水解。乙醇的濃度70-80%。濃度過高,糖溶在乙醇中,用乙醇的目的,降低酶的作用,避免糖被酶水解。第三十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/530有機定量分析二.澄清劑1.
作用:
沉淀一些干擾物質(zhì),使提取液清亮透明,達到準確的測量糖類。(常用澄清劑來澄清)2.
對澄清劑的要求:1)除干擾物質(zhì)完全,不吸附被測物質(zhì)糖2)過量澄清劑不影響糖的測量3)沉淀顆粒要小,操作簡便4)不改變糖類的比旋光度及理化性質(zhì)3.
實驗室常用的澄清劑1)中性醋酸鉛:適用于植物性的萃取液,它可除去蛋白質(zhì)、丹寧、有機酸、果膠。缺點:脫色力差,不能用于深色糖液的澄清,否則加活性炭處理。
2)堿性醋酸鉛適用深色的蔗糖溶液,可除色素,有機酸,蛋白質(zhì)缺點:沉淀顆粒大,可帶走果糖。(3)醋酸鋅和亞鐵氰化鉀
用于富含蛋白質(zhì)的提取液,常用于沉淀蛋白質(zhì),對乳制品最理想。主要是生成的亞鐵氰酸鋅(白色沉淀)與蛋白質(zhì)共同沉淀。所以使動物性樣品的沉淀劑。(4)Al(OH)3乳劑是輔助澄清劑。(5)CuSO4-NaOH這種澄清劑用于牛乳等樣品。第三十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日314.澄清劑的用量在一般操作時,加澄清劑量多少一定要恰當,用量太少,達不到澄清的目的,用量太多使分析結(jié)果產(chǎn)生誤差,不同的物質(zhì),因干擾物質(zhì)種類和含量的不同,所以添加量也不同。過量以后,糖液中有Zn2+,
Pb2+,等。過量的Pb2+還原糖生成鉛糖。這樣使測得糖量降低。所以要加除鉛劑,防止生成鉛糖,降低糖的濃度。三.常用的除鉛劑
K2CrO4(苯酸鉀);Na2CrO4(苯酸鈉);Na2HPO4(磷酸氫二鈉);Na2SO4(硫酸鈉);[使用時可加少量固體即可]第三十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/532有機定量分析糖的測定方法對于糖的測定方法有很多,大致可分為三類1.物理法,(1.旋光法,
2.折光法,
3.比重法,)2.物理化學(xué)法,(1.點位法,2極普法,3.光度法,4.色譜法)3.化學(xué)方法,(1.斐林氏法.2.高錳酸鉀法.3.碘量法.4.鐵氰化鉀法.5.蒽銅比色法.6.咔唑比色法)共計三大種,在測定其他碳水化合物時,往往是使其水解為糖再進行測定。第三十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/533有機定量分析
還原糖是指具有還原性的糖類。葡萄糖分子中含有游離醛基、果糖分子中含有游離酮基,乳糖和麥芽糖分子中含有游離的潛醛基,它們都是還原糖。其他雙糖(如蔗糖)、三糖乃至多糖(如糊精、淀粉等),其本身不具還原性,屬于非還原性糖,但都可以通過水解而生成相應(yīng)的還原性單糖,測定水解液的還原糖含量就可以求得樣品中相應(yīng)糖類的含量。因此,還原糖的測定是一般糖類定量的基礎(chǔ)。還原糖的測定方法很多,其中最常用的有直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、薩氏法、碘量法等。(一)還原糖的測定第三十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/534有機定量分析一.原理將一定量的堿性酒石酸銅甲、乙液等量混合,立即生成天藍色的氫氧化銅沉淀,這種沉淀很快與酒石酸鉀鈉反應(yīng),生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物。在加熱條件下,以次甲基藍作為指示劑,用樣液滴定,樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng),生成紅色的氧化亞銅沉淀,待二價銅全部被還原后,稍過量的還原糖把次甲基藍還原,溶液由藍色變?yōu)闊o色,即為滴定終點。根據(jù)樣液消耗量可計算出還原糖含量。各步反應(yīng)式(以葡萄糖為例)如下:直接滴定法第三十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/535有機定量分析
從上述反應(yīng)式可知,1mol葡萄糖可以將6molCu(2+)還原為Cu(+1)。實際上兩者之間的反應(yīng)并非那么簡單,實驗結(jié)果表明.1mol葡萄糖只能還原5mol多點的Cu(2+),且隨反應(yīng)條件而變化。因此,不能據(jù)上述反應(yīng)式直接計算出還原糖含量,而是用已知濃度的葡萄糖標準溶液標定的方法,或利用通過實驗編制出的還原糖檢索表來計算。第三十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/536有機定量分析二、試劑
1.堿性酒石酸銅甲液:稱取15g硫酸銅(CuSO4·5H2O)及0.05g次甲基藍,溶于水中并稀釋到1000mL。
2.堿性酒石酸銅乙液:稱取50g酒石酸鉀鈉及75g氫氧化鈉,溶于水中,再加入4g亞鐵氰化鉀,完全溶解后,用水稀釋至1000mL,貯存于橡皮塞玻璃瓶中。
3.乙酸鋅溶液:稱取21.9乙酸鋅(Zn(CH3COO)2·2H2O),加3mL冰醋酸,加水溶解并稀釋到100mL。
4.10.6%亞鐵氰化鉀溶液:稱取10.6g亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O],溶于水中,稀釋至100mL。5.0.1%葡萄糖標準溶液:
準確稱取1.0000g經(jīng)過98-100℃干燥至恒重的無水葡萄糖,加水溶解后移入1000mL容量瓶中,加入5mL鹽酸(防止微生物生長),用水稀釋到1000mL。第三十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/537有機定量分析三、測定方法
1.樣品處理
取適量樣品研細,加水提取樣品中的還原糖,提取液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中,慢慢加入5ml乙酸鋅溶液和5ml亞鐵氰化鉀溶液,加水至刻度,搖勻后靜置30分鐘。用干燥濾紙過濾,棄去初濾液,收集濾液備用。
2.堿性酒石酸銅溶液的標定
準確稱取堿性酒石酸銅甲液和乙液各5ml,置于250ml錐形瓶中,加水10ml,加玻璃珠3粒。加熱使溶液沸騰后,從滴定管滴加約9ml葡萄糖標準溶液,趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加葡萄糖標準溶液,直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄消耗葡萄糖溶液的總體積。平行測定3次,取其平均值,按下式計算。
F=C×V式中:F——10ml堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖的質(zhì)量,mg;
C——葡萄糖標準溶液的濃度,mg/ml;
V——標定時消耗葡萄糖標準溶液的總體積,ml。
第三十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/538有機定量分析3.樣品溶液預(yù)測
吸取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00mL,置于250mL錐形瓶中,加水10mL,加玻璃珠3粒,加熱使其在2分鐘內(nèi)至沸,準確沸騰30秒鐘,趁熱以先快后慢的速度從滴定管中滴加樣品溶液,滴定時要始終保持溶液呈沸騰狀態(tài)。待溶液藍色變淺時,以每2秒1滴的速度滴定,直至溶液藍色剛好褪去為終點。記錄樣品液消耗的體積。
4.樣品溶液測定
取堿性酒石酸銅甲液及乙液各5.00mL,置于250mL錐形瓶中,加玻璃珠3粒,加熱至溶液沸騰后,從滴定管中加入比預(yù)測時樣品溶液消耗總體積少1mL的樣品溶液,趁熱以每2秒1滴的速度繼續(xù)滴加樣液,直至藍色剛好褪去為終點。記錄消耗樣品溶液的總體積。同法平行測定3次,取平均值。第三十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/539有機定量分析四、結(jié)果計算還原糖(葡萄糖計%)=F×100/[m×(V/100)×1000]式中:m——樣品質(zhì)量,g;F——10ml堿性酒石酸銅溶液相當于葡萄糖的質(zhì)量,mg;V——測定時平均消耗樣品溶液的體積,mL;100——樣品溶液的總體積,mL。適用范圍及特點本法又稱快速法,它是在藍一愛農(nóng)容量法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,其特點是試劑用量少,操作和計算都比較簡便、快速,滴定終點明顯。適用于各類食品中還原糖的測定。但測定醬油、深色果汁等樣品時,因色深干擾,滴定終點常常模糊不清,影響準確性。本法是國家標準分析方法。第四十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/540有機定量分析
高錳酸鉀滴定法
1.原理將一定量的樣液與一定量過量的堿性酒石酸銅溶液反應(yīng),還原糖將二價銅還原為氧化亞銅,經(jīng)過濾,得到氧化亞銅沉淀,加入過量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解,而三價鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽,用高錳酸鉀標準溶液標定所生成的亞鐵鹽,根據(jù)高錳酸鉀溶液消耗量可計算出氧化亞銅的量,再從檢索表中查出與氧化亞銅量相當?shù)倪€原糖量,即可計算出樣品中還原糖含量。各步反應(yīng)式如下:
由反應(yīng)式可見,5molCuSO4相當于2摩爾KMnO4故根據(jù)高錳酸鉀標準溶液的消耗量可計算出氧化亞銅量。再由氧化亞銅量查檢索表得出相當?shù)倪€原糖量。第四十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/541有機定量分析
2.測定方法
(1)樣品處理取適量樣品,根據(jù)樣品的組成、性狀按前述原則進行提取,提取液移入250ml容量瓶中,慢慢加入10ml堿性酒石酸銅甲液和4m11mol氫氧化鈉溶液,加水至刻度,混勻,靜置30分鐘、用干燥濾紙過濾,棄去初濾液.濾液供測定用。(此步驟目的是沉淀蛋白)
(2)測定吸取50m1處理后的樣品溶液于400m1燒杯中,加堿性灑石酸銅甲、乙液各25m1,蓋上表面皿,置電爐上加熱,使其在4分鐘內(nèi)沸騰,再準確沸騰2分鐘,趁熱用鋪好石棉的坩堝抽濾,并用60℃熱水洗滌燒杯及沉淀,至洗液不呈堿性反應(yīng)為止。將坩堝放回原400mI燒杯中,加25ml硫酸鐵溶液及25m1水,用玻璃棒攪拌使氧化亞銅完全溶解,以高錳酸鉀標準溶液滴定至微紅色為終點。記錄高錳酸鉀標準溶液消耗量。同時吸取50m1水代替樣液,按上述方法做試劑空白試驗。記錄空白試驗消耗高錳酸鉀溶液的量。第四十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/542有機定量分析結(jié)果計算
3.適用范圍及特點本法是國家標準分析方法,適用于各類食品中還原糖的測定,有色樣液也不受限制。方法的準確度高,準確度和重現(xiàn)性都優(yōu)于直接滴定法。但操作復(fù)雜、費時,需使用特制的高錳酸鉀法糖類檢索表。第四十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/543有機定量分析一、原理淀粉是食品中主要的組成部分,也是植物種子中重要的貯藏性多糖。由于淀粉顆??膳c碘生成深藍色的絡(luò)合物,故可根據(jù)生成絡(luò)合物顏色的深淺,用分光光度計測定消光度而計算出淀粉的含量。
二、材料、儀器與試劑
材料:馬鈴薯、栗子、山藥等。儀器:分光光度計、小臺秤、分析天平、燒杯(100mL)、研缽、容量瓶(100mL)、洗瓶、漏斗、濾紙、具塞刻度試管(15mL)、恒溫水浴、移液管(1mL,2mL)。
試劑:1.碘液:稱取20.00g碘化鉀,加50mL蒸餾水溶解,再用小臺秤迅速稱取碘2.0g,置燒杯中,將溶解的KI溶液倒入其中,用玻棒攪拌,直到碘完全溶解,若碘不能完全溶解時,可再加少許固體碘化鉀即能溶解,碘液貯存在棕色小滴瓶中待用,用時稀釋50倍。
2.乙醚A.R。
3.10%乙醇A.R。淀粉含量的測定(碘量法)第四十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/544有機定量分析三、操作步驟
(一)標準曲線的制作:用分析天平準確稱取1.000g精制馬鈴薯淀粉,加入5.0mL蒸餾水制成勻漿,逐漸倒入90mL左右沸騰的蒸餾水中,邊倒邊攪拌,即得澄清透明的糊化淀粉溶液,置100mL容量瓶中,用少量蒸餾水沖洗燒杯。定容,此淀粉溶液濃度為10mg/mL(A液)。吸取A液2.0mL置100mL容量瓶,定容,此時淀粉濃度為200μg/mL(B液)。取具塞刻度試管8支,按下表加入淀粉及碘液,再加蒸餾水使每支試管溶液補足到10mL,搖勻,待藍色溶液穩(wěn)定10min后,用分光光度計于660nm波長處測其消光值。以消光值為縱坐標,已知淀粉溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線。試管編號12345678
標準淀粉溶液
(μg·mL-1)/mL
00.51.01.52.02.53.04.0
碘液/mL0.20.20.20.20.20.20.20.2蒸餾水/mL9.89.38.88.37.87.36.85.8
淀粉含量
/μg·mL-10100200300400500600800第四十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/545有機定量分析(二)樣品處理:馬鈴薯洗凈,去皮,用擦子擦成碎絲,迅速稱取馬鈴薯碎絲300g,置研缽中磨成勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)移到漏斗中,用乙醚50mL分5次洗滌,再用10%乙醇洗滌3次,以除去樣品中的色素,可溶性糖及其它非淀粉物質(zhì),然后將濾紙上的殘留物轉(zhuǎn)移到100mL燒杯中,用蒸餾水分次將濾紙上的殘留物全部洗入燒杯,將燒杯置沸水浴中邊攪拌邊加熱,直到淀粉全部糊化成澄清透明。將此糊化淀粉轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,定容,混勻(C液)。
(三)測定:吸取C液2.0mL,置1,000mL容量瓶中,用蒸餾水定容,混勻。準確吸取2mL樣品溶液(吸取量依樣品中淀粉濃度而變),置15mL具塞刻度試管,加入碘液0.2mL,直至溶液呈現(xiàn)透明藍色,用蒸餾水補足到10mL,混勻,靜置10min,于660nm波長處測定消光值。由標準曲線查出樣品中淀粉含量(g/100g鮮重)。第四十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/546有機定量分析淀粉含量的測定一、原理
淀粉測定可先除去樣品中的脂肪及其中的可溶性糖、再在一定酸度下,將淀粉水解為具有還原性的葡萄糖。通過對還原糖含量的測定,乘上一換算系數(shù)0.9,即為淀粉含量,反應(yīng)式如下:(C6H10O5)n+nH2O→nC6H12O6
n×162.1n×180.2根據(jù)反應(yīng)公式,淀粉與葡萄糖之比為:162.1∶180.12=0.9∶1,即0.9g淀粉水解后可得1g葡萄糖。
二、材料、儀器與試劑
材料:馬鈴薯、蘋果、葡萄等。儀器:滴定管(15mL)、移液管(5mL)、燒杯、三角瓶(150mL)、容量瓶(500mL,250mL,100mL)漏斗、研缽、酒精燈、鐵架臺、滴定管夾、水浴鍋、分析天平。第四十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/547有機定量分析試劑:硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉A.R、鹽酸A.R、次甲基藍A.R、醋酸鉛A.R、硫酸鈉A.R、酚酞A.R。1.菲林試劑甲A.R:稱取硫酸銅34.639g加入蒸餾水溶解后,置于500mL容量瓶中,加水稀釋到刻度,混勻。
2.菲林試劑乙A.R:稱取酒石酸鉀鈉173g及氫氧化鈉50g,加蒸餾水溶解后置于500mL容量瓶中,加水稀釋到刻度,混勻,過濾后待用。
3.蔗糖標準液的配制A.R:用分析天平準確稱取1g蔗糖,溶解后移入250mL容量瓶中定容,混勻后吸取50mL放入100mL容量瓶中,加2.5mL12mol/LHCL,在沸水中煮10min,取出迅速用冷水沖洗冷卻至室溫,加1%酚酞2-3滴,加6mol/LNaOH中和至微紅,定容,混勻,用此標準液滴定菲林試劑,求出標準蔗糖液1mL中糖含量。第四十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/548有機定量分析三、操作步驟
(一)樣品處理:稱去皮切碎的蘋果肉2g,置研缽中磨成勻漿,用蒸餾水沖洗轉(zhuǎn)移入100mL容量瓶中,加2.5mL12mol/LHCl在沸水浴中煮10min,取出2冷卻,此時樣品中的蔗糖水解成還原糖。對含蛋白質(zhì)較多的樣品,可滴加10%Pb(Ac)2到溶液不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時為止,加飽和Na2SO4除去多余的鉛離子,然后加1%酚酞2-3滴,加6mol/LNaOH中和至微紅,定容到100mL,搖勻后過濾待測。(二)測定:吸取5mL菲林試劑甲和5ml菲林試劑乙,放入150mL的三角瓶中。加入1-2滴次甲基藍,置酒精燈上加熱至沸騰,用竹制試管夾夾住三角瓶,邊搖動邊滴定,真至樣品提取液將菲林試劑滴定至上清液變?yōu)闊o色(同時出現(xiàn)紅棕色的氧化亞銅沉淀)記錄下樣品滴定用量的毫升數(shù),重復(fù)一次,求兩次讀數(shù)的平均值為樣品滴定用量四、計算
淀粉(%)=
標準蔗糖1mL中含糖量×滴定用量———————————×稀釋倍數(shù)×100×0.9
樣品重量×1000
第四十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/549有機定量分析五、注意事項
(一)如樣品含糖量高時需適當加大稀釋倍數(shù)。(二)掌握滴定終點標準時,需用白色做背景,便于觀察溶液從藍色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色,且必須在沸騰時觀察,否則易氧化成藍色不易判別終點。(三)總糖的測定亦可用此法,但需用HCl將多糖水解,轉(zhuǎn)化成還原糖并適當稀釋后測定。(四)樣品中含有可溶性糖時,可先用乙醇溶解除去可溶性糖再測淀粉含量。第五十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/550有機定量分析四植物葉子葉綠素含量的測定原理:綠色植物色素主要是葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素。在用丙酮提取的植物色素中選擇葉綠素a、b單色光波長的最大吸收峰633nm和645nm的波長測吸光度。又知葉綠素a、葉綠素b分別在633nm的吸收系數(shù)為82.04和9.27在645nm波長下的吸收系數(shù)為16.75和45.60。根據(jù)吸光度加和性原理有:A663=82.04Ca+9.27
CbA645=16.75Ca+45.60Cb求出葉綠素a、b的含量就可以求出葉綠素總量CT。
CT=Ca+Cb。注意:不同溶劑的提取物最大吸收波長和吸收系數(shù)不同。
第五十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/551有機定量分析材料、儀器設(shè)備儀器:分光光度計,電子天平,研缽、小漏斗、棕色容量瓶,定量濾紙,吸水紙,檫鏡紙,滴管。試劑:80%的丙酮,石英沙,碳酸鈣粉末。取新鮮綠色葉片,檫凈葉片表面污物,(去掉中脈)剪碎,混均勻。試驗步驟稱取碎葉片3份,每份0.2克。分別放入研缽中,加入少量石英沙和碳酸鈣粉末及2.5毫升80%丙酮,研成勻漿,再加10毫升丙酮繼續(xù)研磨直至組織變白。靜置3—5分鐘。過濾,用少量丙酮淋洗殘渣和玻璃棒數(shù)次,直至殘渣無色為止。洗液一起轉(zhuǎn)入25毫升棕色容量瓶,搖勻,定容。用1cm比色皿,80%丙酮為空白,在663nm和645nm處測吸光度。注意:為了避免葉綠素在強光下分解,試驗應(yīng)該在弱光下操作。葉綠素提取液不能渾濁,可在710或750nm處測量其吸光度,其值應(yīng)小于波長為葉綠素a吸收峰處的5%,否則應(yīng)該重新過濾。對波長要求精確度高,否則誤差大。第五十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/552有機定量分析一、原理
β-胡蘿卜素為脂溶性維生素A的前體,存在各種動植物體中,所以可直接用有機溶劑提取后進行檢測。利用反相色譜法分析。
二、材料、儀器與試劑
(一)材料:胡蘿卜、綠色蔬菜等。(二)儀器:高效液相色譜儀、記錄儀或積分儀、分析天平、組織搗碎機、研缽、抽濾瓶、布氏漏斗、分液漏斗(250mL2個)、容量瓶(100mL)、漏斗、移液管(2mL)小試管、濾紙等。(三)試劑:正已烷、甲醇、無水硫酸鈉、乙酸乙酯、BHT(叔丁基羥基甲苯)(以上均為分析純試劑)、氮氣。
20%氫氧化鉀的甲醇溶液:稱20g氫氧化鉀溶于100mL甲醇溶液中。
β-胡蘿卜素標準液:準確稱取標樣5.000mg,乙酸乙酯溶解并定容50mL。冰箱中保存,上機前再稀釋50倍。五β-胡蘿卜素含量的測定(HPLC法)第五十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/553有機定量分析三、操作步驟
(一)樣品處理:取樣品的可食部分洗凈切碎,置組織搗碎機中搗碎成漿狀,于天平上稱5-10g樣品,放入研缽中,同時加少量甲醇、已烷研磨.然后倒入布氏漏斗抽濾,并不斷用甲醇、已烷沖洗研缽及殘渣,直至殘渣為白色。將含有樣品的溶液倒入事先裝有50mL已烷的分液漏斗中,用蒸餾水沖洗抽濾瓶2-3次,洗液并入分液漏斗,振搖分液漏斗后靜止分層,將下層溶液放入裝有30mL正已烷的另一分液漏斗中,向第一分液漏斗中加10mL20%氫氧化鉀的甲醇溶液,振搖后分層,上層為黃色溶液。將下層放入另一分液漏斗中,處理同上。合并二次正已烷提取液,用蒸餾水洗至中性,pH試紙測試為6左右,然后用無水硫酸鈉脫水,提取液轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中,加0.1gBHT,并用正已烷沖洗分液漏斗數(shù)次,最后定容至刻度。上機前取1-2mL提取液于小試管中,氮氣吹干,用1.0mL乙酸乙酯溶解后上機。第五十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/554有機定量分析(二)色譜條件:色譜柱:μ-BondapakC-18(300×3.9mm);流動相:100%甲醇;流速:1.2mL/min;檢測器:可見光450nm;衰減:0.08AT;紙速:0.4cm/min;柱溫:室溫:進樣量:20μL。四、計算根據(jù)標準樣品的保留時間定性,根據(jù)標準樣品的峰高或峰面積與樣品峰的比較而定量。五、注意事項
β-胡蘿卜素遇光和氧都會迅速破壞,所以樣品應(yīng)避光保存,所有標準β-胡蘿卜素必須臨時配制。第五十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/555有機定量分析一、原理
脂肪的測定可用有機溶劑提取樣品中的脂肪,蒸發(fā)溶劑后得到的剩余物稱為脂肪,除脂肪外,還含有色素、蠟質(zhì)、揮發(fā)油、磷脂等,所以又稱粗脂肪,在大多數(shù)食品中,這些雜質(zhì)含量極少,可以忽略。二、材料、儀器與試劑(一)材料:谷物、豆類等。(二)儀器:索氏提取器(如圖)、燒瓶(150mL)、恒溫水浴(三)試劑:(1)無水乙醚;(2)海砂。所用試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。六粗脂肪的測定(索氏抽提法)第五十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/556有機定量分析三、操作步驟精確稱取充分研碎的干燥樣品,在105℃烘箱中烘干,置于已稱重的濾紙筒內(nèi)(半固體或液體樣品取于蒸發(fā)皿中,加入海砂20g,于水浴上蒸干,在100-150℃烘干,研細,全部移入濾紙筒內(nèi),蒸發(fā)皿及附有樣品的玻璃棒用蘸有乙醚的棉花擦凈,棉花也放進濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒封好后小心放入索氏提取器的提取筒內(nèi),應(yīng)使濾紙筒高度低于虹吸管上端彎曲部位。連接已恒重的蒸發(fā)燒瓶。加入無水乙醚至燒瓶中,乙醚量為瓶的2/3體積,于水浴上加熱,乙醚開始回流后,仔細調(diào)整水浴溫度,使虹吸回流速度控制在8-12次/h,一般抽提6-12h。(如乙醚揮發(fā)過多,可從冷凝管上端補充)。取下接收瓶?;厥找颐阎疗績?nèi)剩1-2ml時,在水浴上蒸干,再于100-105℃干燥40-60min,取出于干燥器中冷卻30min,稱提取瓶及內(nèi)容物的重量,所增加的重量即脂肪的重量。四、計算粗脂肪%=
W1—W0×100
W式中:W——樣品重(g)
W0——接收瓶重(g)
W1——接收瓶和脂肪重(g)第五十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/557有機定量分析
二氮氧喹喔啉類化合物是研究較早的具有抗菌活性的物質(zhì)。二氮氧喹喔啉甲醛—酰腙類化合物不但具有抗菌活性,而且可以作為除草劑使用。但是由于腙類化合物極難溶于一般溶劑,故未見有關(guān)該類酰腙化合物定量分析的報道。二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙是黃色固體,但由于極難溶解,其DMSO的飽和溶液只顯淡黃色,且隨著濃度降低迅速趨于無色;用KOH與之反應(yīng)后顯出鮮明的橙黃色。利用這一性質(zhì)建立了該化合物的分光光度測定法。七二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙定量分析第五十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/558有機定量分析水楊酰腙鈉鹽?;由系臍湓佑兴嵝?,可以與烯醇式形成平衡。KOH在非水溶劑DMSO中的堿性比在水溶液中大約強104倍,而且濃度比酰腙的烯醇式大得多,故可以將酰腙全部轉(zhuǎn)變成烯醇式負離子而顯色。二氮氧喹噁啉甲醛—水楊酰腙是二元酸,首先酚羥基與氫氧化鉀反應(yīng)生成鈉鹽。顯色機理如下:第五十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/559有機定量分析儀器與試劑722分光光度計;
高效液相色譜儀檢測純度為99.5%);恒溫油浴鍋;所用玻璃儀器均需無水;1,4—二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙(自合成,DMSO中三次重結(jié)晶至熔點不變;KOH的DMSO溶液(將分析純的KOH溶于DMSO中配稱成飽和溶液,濃度約4%)。
第六十頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/560有機定量分析分析方法二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙的標準溶液吸光度的測定稱取純度為99.5%的二氮氧喹喔啉甲醛—水楊酰腙20mg置于150mL具塞瓶中,加入約90mL的DMSO,塞好塞子(注意,DMSO極易吸潮?。?0℃恒溫油浴溶解。然后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶,用8mLDMSO分兩次洗滌具塞瓶,洗液轉(zhuǎn)入容量瓶,搖勻,DMSO定容后作為標準樣品溶液(0.2mg/mL)。取8個10mL容量瓶,每個容量瓶中用移液管分別加入5mL飽和KOH的DMSO溶液,再依次加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5mL標準溶液,搖勻,DMSO定容。5min顯色,用試劑空白對照,1cm比色皿在波長440nm處測其吸光度。平行實驗三次,取其平均值作定量分析。第六十一頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/561有機定量分析結(jié)果與討論用最小二乘法處理表1的數(shù)據(jù)得如下回歸方程:A=0.0563C-0.019,r=0.999;在1.00—30.0×10-4mg/mL的濃度范圍內(nèi)符合朗伯—比耳定律。顯色劑濃度
用氫氧化鉀顯色,由于KOH在DMSO中溶解度有限,濃度選擇范圍不大。在顯色液中氫氧化鉀濃度為0.5%時,較高濃度的酰腙(20—40×10-4mg/mL)能夠較好的服朗伯—比耳定律;KOH濃度接近于4%時,較低濃度的酰腙(0.5—20×10-4mg/mL)能夠較好的服從朗伯—比耳定律。取KOH濃度為1~2%時比較適宜。顯色溫度和時間
用氫氧化鉀顯色,溫度越高色度越深,顯色越快,但是吸光度波動性也越大。在室溫下化合物可以5min內(nèi)充分顯色,故無須升溫。但是DMSO的凝固點較高(19℃)故分析溫度不能低于20℃。顯色液在室溫時4h內(nèi)吸光度穩(wěn)定
用1~2%氫氧化鉀溶液顯色,在1.00—30.0×10-4
mg/mL濃度范圍內(nèi)服從朗伯—比耳定律,濃度太高或太低都會偏離朗伯—比耳定律。本試驗必須在無水的條件下操作,如大量水分進入DMSO溶液,會大大降低樣品的溶解性和KOH的堿性,使樣品析出或不能很好的轉(zhuǎn)變成烯醇式負離子。第六十二頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/562有機定量分析八:藥物普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪
分離與鑒定原理:普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪都屬于吩噻嗪類藥物,與氯化鈀反應(yīng)生成藍色絡(luò)合物。三者混合液用乙酸乙酯萃取,普馬嗪不轉(zhuǎn)入乙酸乙酯中。故可用分光光度法測定普馬嗪、氯丙嗪和異丙嗪。又異丙嗪與硫酸汞生成紅色物質(zhì),普馬嗪和氯丙嗪呈負反應(yīng),故可以測定異丙嗪。試劑PH=2的緩沖溶液,10g三水合醋酸鈉溶于50mL水,加入80mL1N的鹽酸,加水至200毫升。氯化鈀溶液:5克氯化鈀溶解于50毫升1N的鹽酸中;硫酸汞溶液:5克氧化汞溶于80毫升和20毫升水中。第六十三頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/563有機定量分析普馬嗪、氯丙嗪、異丙嗪的測定操作:取含有樣品50—150ug的水溶液1毫升,加入5毫升緩沖溶液和0.5毫升氯化鈀溶液,加水成7毫升混勻,顯色15分鐘。以試劑為空白,在500nm波長處測吸光度。用同樣方法測試標準溶液的吸光度,并繪制標準曲線。折算樣品含量。氯丙嗪和異丙嗪的測定與50毫升漏斗中加入5毫升緩沖溶液,0.5毫升氯化鈀溶液,加入含有500微克/毫升氯丙嗪和異丙嗪的樣品,加水1毫升混勻。加入10毫升乙酸乙酯,萃取。用1N的鹽酸5毫升洗滌乙酸乙酯,5分鐘后在440nm波長處測吸光度用同樣方法測試標準溶液的吸光度,并繪制標準曲線。折算樣品含量第六十四頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/564有機定量分析異丙嗪的測定取含50—100毫克的樣品1毫升加入1毫升硫酸汞溶液,水浴加熱10分鐘,冷卻;加水至50毫升,10分鐘后顯色。以1毫升試劑加4毫升水為空白對照,在500nm波長處測吸光度。用同樣方法測試標準溶液的吸光度,并繪制標準曲線。折算樣品含量。吩噻嗪基本結(jié)構(gòu)式:第六十五頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/565有機定量分析農(nóng)藥有效成分含量分析農(nóng)藥有效成分含量分析一般用氣相色譜或液相色譜分析法。如殺蟲劑久效磷的含量分析用液相色譜法。如右旋反式烯丙菊酯的含量用氣相色譜法。第六十六頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/566有機定量分析久效磷分析方法提要:試樣用甲醇溶解。以甲醇/水為流動相,在LichrosorbRP18柱上對式樣中的久效磷進行分析。紫外檢測器檢測,外標法定量。分析條件色譜柱:250mm×4.6mm不銹鋼柱,填充LichrosorbRP18;保護柱20mm×2.0mm不銹鋼柱,PellicularODS;流動相:甲醇+乙腈+水=80+10+10(V/V);已脫氣。流速:1.5mL/
min監(jiān)測器靈敏度:0.1AUFS;檢測波長:230nm
溫度:室溫;進樣體積:10uL;保留時間:5.8nim。第六十七頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/567有機定量分析右旋反式烯丙菊酯的含量分析方法提要試樣用丙酮溶解,一鄰苯二甲酸二丁酯為內(nèi)標物;在OV—101/chromosorbW-HP色譜柱上分離。用帶有氫火焰離子化檢測器的氣象色譜儀對試樣中的右旋反式烯丙菊酯進行測定。分析條件色譜柱:1.2m×4mm,內(nèi)填5%OV—101/chromosorbW-HP(150—200um);溫度:柱室160,氣化室230,檢測室230;載氣(氮氣)流速:125mL/min;進樣體積:3uL右旋反式烯丙菊酯保留時間7min,內(nèi)標物保留時間4min。第六十八頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/568有機定量分析九:有機物中水分的檢驗和測定
水分雖然不是有機化合物,但是在分析有機物時,經(jīng)常要檢測有機物中的水分。這是因為水分是有機物中經(jīng)常存在的雜質(zhì)之一。由于水的存在:一,影響有機物的純度、品質(zhì)及性質(zhì);二,影響有機反應(yīng)的正常進行。有機合成反應(yīng)中的F—C烷基化反應(yīng),要在無水的條件下.以三氯化鋁作催化劑,才能使烷基化順利進行。又如,格氏試劑的制備,必須在無水乙醚介質(zhì)中進行。水分的存在,將直接影響反應(yīng)的效率,甚至使反應(yīng)失??;三,影響有機分析結(jié)果的正確性和靈敏度。例如,在非水溶劑中,測定弱酸或弱堿的含量時,水分的存在,將使測定終點不夠敏銳。又如,在有機功能團的測定中,有時是根據(jù)測定反應(yīng)中所消耗的水分或生成的水分的含量來進行定量分析的,有機物中水分的存在必然影響分析結(jié)果。綜上所述,有必要檢驗有機物中的水分。第六十九頁,共七十八頁,2022年,8月28日2023/1/569有機定量分析水分的檢驗
在有機化合物中檢出水分,目前還沒有一種簡便通用的方法,應(yīng)根據(jù)試樣的性質(zhì)選擇適當?shù)姆椒ā?/p>
水分的檢出:化學(xué)方法:氯化鈷、四乙酸鉛、二苦胺、硫化鋁、乙醇鎂、碳
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