生物化學(xué)教學(xué)課件：Chapte 14 基因工程和蛋白質(zhì)工程

第十四章基因工程和蛋白質(zhì)工程Chapter14Geneticengineeringand

proteinengineering主要內(nèi)容第一節(jié)生物工程概述（OverviewofBiotechnology）第二節(jié)基因工程（GeneticEngineering）第三節(jié)蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）“Dolly”(多莉)HowwasDollymade?WhydidDollydie?你吃過轉(zhuǎn)基因食品嗎？轉(zhuǎn)基因食品不管您愿不愿意，您己經(jīng)或正在把轉(zhuǎn)基因食品吃進(jìn)肚里。轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)走進(jìn)我國百姓的生活。國內(nèi)尚沒有轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模生產(chǎn)近幾年我國大量從美國、阿根廷等國進(jìn)口大豆，其中大部分是轉(zhuǎn)基因大豆。我國有一半以上的大豆色拉油含有轉(zhuǎn)基因成分。究竟什么是轉(zhuǎn)基因食品？轉(zhuǎn)基因食品是否安全？它是否存在長期的隱患？第一節(jié)生物工程概述生物工程（生物技術(shù)）是已逐漸經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新動力第一次技術(shù)革命 工業(yè)革命 解放人的雙手第二次技術(shù)革命 信息技術(shù) 擴(kuò)展人的大腦第三次技術(shù)革命 生物技術(shù) 改造生命本身生物工程產(chǎn)業(yè)全球生物科技公司前10名（1999年）公司名稱市值（億美元）98年收入（億美元）Amgen41627遺傳技術(shù)研究公司18510生物遺傳研究公司1185Elan894Immunex712Medimmune562希龍506Alza436Centocor423Genzyme387生物工程產(chǎn)業(yè)基因工程試劑的高回報(bào)：堿性成纖維細(xì)胞生長因子231元/ug紅細(xì)胞生成素1072元/ug白細(xì)胞介素-2410元/ug巨細(xì)胞粒細(xì)胞集落刺激因子1960元/ug胰島素10.2元/mg生物工程產(chǎn)業(yè)Mullis發(fā)明PCR，公司獎勵10,000美元獎金專利賣給Hoffmann-LaRoche公司賣了3億美元1993年諾貝爾化學(xué)獎生物工程產(chǎn)業(yè)Rockfeller大學(xué)將人肥胖基因出售0.2億美元（1995年3月）Amgen公司將FKBP神經(jīng)免疫因子配體轉(zhuǎn)讓達(dá)3.29億美元（1997年）Millennium公司以4.65億美元向Bayer公司轉(zhuǎn)讓225種基因的開發(fā)權(quán)（1998年9月）生物工程產(chǎn)業(yè)生物工程產(chǎn)業(yè)據(jù)有關(guān)人士預(yù)測，到本世紀(jì)初期（2050年？）：全世界將有三分之二的人在生物企業(yè)中工作；生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值將逐漸超過其他行業(yè)而躍居首位。繼電腦信息產(chǎn)業(yè)的浪潮之后，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的大潮正洶涌而來。一、生物工程的概念及研究技術(shù)遺傳工程（geneticengineering）：用人工手段把一種生物的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一種生物的細(xì)胞中去，并使后者表現(xiàn)出新的生理與遺傳特征。既包括一般的選擇育種，也包括復(fù)雜的基因克隆等不同的技術(shù)層次。廣義的遺傳工程包括細(xì)胞水平上的遺傳操作（細(xì)胞工程）和分子水平上的遺傳操作，即重組DNA技術(shù)（又稱之為基因工程）。狹義的遺傳工程則專指后者。生物工程的概念及研究技術(shù)基因工程(geneengineering)：是20世紀(jì)70年代以后興起的一門新技術(shù)。它是指在分子水平上進(jìn)行遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，以改變生物機(jī)能或創(chuàng)造新的生物機(jī)能。它是分子水平上的遺傳工程?；虿僮?genemanipulation)DNA重組技術(shù)(DNArecombinationtechnique)基因克?。╣enecloning）分子克?。╩olecularcloning）等。生物工程的概念及研究技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)近代生物技術(shù)以基因工程為首要標(biāo)志生物技術(shù)技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)生物工程（bioengineering或biologicalengineering），也稱生物技術(shù)（biotechnology），是20世紀(jì)70年代初開始興起的一門新興的綜合性應(yīng)用學(xué)科。生物工程就是應(yīng)用生命科學(xué)及工程學(xué)的原理，借助生物體作為反應(yīng)器或用生物的成分作工具以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的生物技術(shù)。技術(shù)特征是釀造技術(shù)。醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶一般認(rèn)為，生物工程是以生物學(xué)（特別是其中的微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)）的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合化工、機(jī)械、電子計(jì)算機(jī)等現(xiàn)代工程技術(shù)，充分運(yùn)用分子生物學(xué)的最新成就，自覺地操縱遺傳物質(zhì)，定向地改造生物或其功能，短期內(nèi)創(chuàng)造出新物種，，以生產(chǎn)大量有用代謝產(chǎn)物或發(fā)再通過合適的生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)揮它們獨(dú)特生理功能的一門新興技術(shù)。它與微電子技術(shù)、新材料技術(shù)和新能源技術(shù)并列為影響未來國計(jì)民生的四大科學(xué)技術(shù)支柱，被認(rèn)為是21世紀(jì)世界知識經(jīng)濟(jì)的核心。生物工程的概念及研究技術(shù)17生物工程遺傳工程基因工程>>>>生物工程的概念及研究技術(shù)生物工程的構(gòu)成體系生物工程基因工程細(xì)胞工程酶工程生化工程DNA重組技術(shù)細(xì)胞融合與組織培養(yǎng)技術(shù)酶的改造與設(shè)計(jì)技術(shù)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)等（發(fā)酵工程）生物工程技術(shù)相互關(guān)系1.基因工程多少年來，人們對于一切與生命有關(guān)的現(xiàn)象總是認(rèn)為：種瓜得瓜，種豆得豆有其父必有其子基因工程基因工程(geneengineering)是生物工程的主體和核心。其主要原理是用人工的方法，把生物的遺傳物質(zhì)，通常是脫氧核糖核酸(DNA)分離出來，在體外進(jìn)行基因“剪切”、“組合”和“拼接”，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（微生物質(zhì)粒、噬菌體、病毒），轉(zhuǎn)入微生物或高等生物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖（克隆，clone），并使所需要的基因（目的基因）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的新產(chǎn)品，或創(chuàng)造出新的生物類型?；虻霓D(zhuǎn)移已經(jīng)不再限于同一類物種之間，動物、植物和微生物之間都可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，改變宿主遺傳特性，創(chuàng)造新品種(系)或新的生物材料?？寺。╟lone）：就是指無性繁殖?？寺∫辉~常用于分子、細(xì)胞水平的描述。分子克隆(molecularcloning)即基因克隆(genecloning)：含有某目的DNA片段的重組DNA分子或含有該重組分子的無性繁殖?？寺〖夹g(shù)（cloning）：是指從眾多的基因或細(xì)胞群體中通過無性繁殖和選擇目的基因或特定類型細(xì)胞的技術(shù)的操作?？寺。╟lone）克隆（clone）分子水平的克隆細(xì)胞水平的克隆個體水平的克?。康模┗蚩寺　CR技術(shù)植物細(xì)胞克隆動物細(xì)胞的克隆植物組織培養(yǎng)動物克?。ê艘浦布夹g(shù)）動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體的制備克隆組培獲得愈份組織

多利羊之父伊恩威爾穆特（IanWilmut）教授

—英國愛丁堡羅斯林研究所，

蘇格蘭胚胎學(xué)家?？寺。╟lone）

1998年克隆批量化

美國克隆出50多只老鼠。

日本克隆出8只完全一樣的小牛。克?。╟lone）

2000年·人類的近親被克隆

美國俄勒岡州

沃爾小組成功克隆兩只

恒河猴?？寺。╟lone）克隆豬

同年，幫助培育出多利羊的生物技術(shù)公司克隆出5只小豬仔，并宣稱克隆豬終將成為人類移植器官的“加工廠”，生產(chǎn)器官包括角膜、皮膚、腎、肝、肺、心臟等。珍稀瀕危動物的繁殖克隆大熊貓的實(shí)驗(yàn)已開始報(bào)道。

克隆（clone）2001年—至今關(guān)于克隆人關(guān)于克隆人的問題爭論的很激烈，在理論上，利用同樣方法，人可以克隆人，但各國至今還不允許克隆人。

2001年，美、意科學(xué)家聯(lián)手展開克隆人體胚胎的工作。11月，美國科學(xué)家宣布首次克隆成功了處于早期階段的人類胚胎，稱其目標(biāo)是為病人“定制”出不會誘發(fā)排異反應(yīng)的人體細(xì)胞用于移植。2004年8月11日英國頒發(fā)全球首張“克隆人類胚胎”執(zhí)照，合法執(zhí)照有效期為一年，胚胎14天后必須毀壞，培育克隆嬰兒仍屬非法行為。研究目的①增加人類對自身胚胎發(fā)育的理解；②增加人類對高危疾病的認(rèn)識和高危疾病治療方法的研究。克?。╟lone）預(yù)想的克隆人技術(shù)路線轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因動植物(Transgenicanimalandplants)：就是利用重組DNA技術(shù)，將動物植物或微生物中經(jīng)過鑒定和分離的基因，經(jīng)過精心設(shè)計(jì)后轉(zhuǎn)移到動植物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)定向改造而獲得新品種或產(chǎn)生新的功能。轉(zhuǎn)基因植物TransgenicplantsORgeneticallymodifiedplants轉(zhuǎn)基因動物TransgenicanimalORgeneticallymodifiedanimal轉(zhuǎn)基因食品TransgenicfoodORgeneticallymodifiedfoods——轉(zhuǎn)基因動植物制得的食品稱為轉(zhuǎn)基因食品。Whatdoyouthinkabouteatinggeneticallymodifiedfoods?轉(zhuǎn)基因食品有利又有弊

轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類帶來的益處已為人們所認(rèn)識：提高作物產(chǎn)量，幫助人們解決饑餓問題；培育出能在惡劣環(huán)境下生長并可抗御病蟲害的作物新品種等。一些科學(xué)家轉(zhuǎn)基因作物可能對環(huán)境和野生動植物產(chǎn)生的影響表示擔(dān)憂，因此對轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行了嚴(yán)格的檢驗(yàn)。只有在對它們的安全性作出正確判斷后，轉(zhuǎn)基因作物才有可能投入商業(yè)種植。

2.細(xì)胞工程細(xì)胞工程（Cellengineering）：包括細(xì)胞融合、核移植、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)、細(xì)胞克隆技術(shù)。重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。是細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平的生物工程。細(xì)胞融合：不同種類的細(xì)胞融合在一起核移植：一種細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞器移植到另一個細(xì)胞中細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：以工業(yè)生產(chǎn)為目的，從大量培養(yǎng)的細(xì)胞中獲取有用物質(zhì)?？焖俜敝臣夹g(shù)：動植物細(xì)胞或組織進(jìn)行快速的無性繁殖（細(xì)胞克隆技術(shù)）。

“多莉”的誕生意味著人類可以利用動物的一個組織細(xì)胞“復(fù)印”出大量相同的生命體。植物細(xì)胞工程干細(xì)胞工程干細(xì)胞(stemcell)：是一種未充分分化、尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。受精卵是一個最初始的干細(xì)胞。干細(xì)胞全能干細(xì)胞多能干細(xì)胞專能干細(xì)胞具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化干細(xì)胞工程(stemcellsengineering)：是利用干細(xì)胞的增殖特性，多分化潛能及其增殖分化的高度有序性，通過體外培養(yǎng)干細(xì)胞、誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化或利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)處理干細(xì)胞以改變其特性的方法。干細(xì)胞工程是在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新的細(xì)胞工程。人類胚胎干細(xì)胞技術(shù)的研究在許多國家都受到限制?！翱寺∪恕弊屓朔艘乃?；將人類的干細(xì)胞加到動物的早期發(fā)育胚胎中，導(dǎo)致豬體內(nèi)流人血，老鼠長著人類腦細(xì)胞，小鼠背上長人耳……干細(xì)胞工程(stemcellsengineering)細(xì)胞工程與其他學(xué)科技術(shù)關(guān)系38酶工程(enzymeengineering)：又稱酶技術(shù)，主要包括酶的開發(fā)與生產(chǎn)、酶的固定化、酶的分子改造與修飾技術(shù)、新酶研制等技術(shù)?！粼诠I(yè)生產(chǎn)上，酶工程就是利用酶所特有的生化催化特性，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)變?yōu)樗璧漠a(chǎn)品。概括地說，酶工程是由酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成的。酶工程的重點(diǎn)在于對已存酶的合理充分利用，而蛋白質(zhì)工程的重點(diǎn)則在于對已存在的蛋白質(zhì)分子的改造。當(dāng)然，隨著蛋白質(zhì)工程的發(fā)展，其成果也會應(yīng)用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程的一部分。隨著科學(xué)的發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的日趨完善，為酶工程賦予了新的內(nèi)容。3.酶工程4.生化工程生化工程（Biochemistryengineering）：包括生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、傳感器的研制和產(chǎn)品的分離、精制技術(shù)。是由生物科學(xué)與化學(xué)工程相結(jié)合的交叉學(xué)科，主要研究將生物技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力過程中的帶有共性的工程技術(shù)問題。共性問題：生物反應(yīng)器、生物反應(yīng)過程、檢測與控制、分離與純化等。生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)是生物技術(shù)開發(fā)中的一個關(guān)鍵設(shè)備。此反應(yīng)體系用于微生物發(fā)酵，就是發(fā)酵工程。發(fā)酵工程(fermentationengineering)：包括菌種選育、菌體生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的發(fā)酵以及微生物機(jī)能的利用等。二、生物工程在現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用21世紀(jì)是生命科學(xué)與生物技術(shù)的世紀(jì)，生物技術(shù)被世界各國視為一項(xiàng)高新技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、化工能源等各行各業(yè)，正在對人類社會生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。化工及冶金工業(yè)輕工與食品工業(yè)醫(yī)療和醫(yī)藥工業(yè)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)環(huán)保與能源工業(yè)生物工程的應(yīng)用（自學(xué)為主）中國基因工程制藥：200多家生物技術(shù)公司生物技術(shù)藥品產(chǎn)值：1996-18億元；1997-30億元；2000-72億元可生產(chǎn)藥物品種：約20種生物工程的應(yīng)用

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂國內(nèi)產(chǎn)業(yè)化生物藥品概況產(chǎn)品種類臨床I臨床II臨床III批準(zhǔn)上市凝血因子VIIIXVIII細(xì)胞刺激因子SCFTPOG-CSF,M-CSF,EPO生長因子骨形成因子肌營養(yǎng)因子FGF，GM-CSF

胰島素類似物血小板衍生因子HGH干擾素IFN,α1b,α1b,α2a,αn3,β,β1b,γ,γ1b白介素1α,1β3,6,2,4,1211激素人促卵泡素甲狀旁腺素胰高血糖素胰島素，心鈉素降鈣素促黃體生成素IGF-1

甲狀腺刺激素疫苗CEAHSV,流感病毒LymeHBV，HCV其他水蛭素松弛素,HB,SODTNF，tPA，

白蛋白,殺菌蛋白單克隆抗體生物工程的應(yīng)用世界轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況(1987.1-1998.4)轉(zhuǎn)基因作物特性批準(zhǔn)項(xiàng)數(shù)所占比例抗除草劑129729.6%抗蟲104623.8%提高產(chǎn)品質(zhì)量88620.2%抗病毒4369.9%改善農(nóng)學(xué)性狀2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%總計(jì)4387100%生物工程的應(yīng)用中國已獲準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物（1998.3)轉(zhuǎn)基因植物總項(xiàng)數(shù)48轉(zhuǎn)基因植物種類15抗除草劑3抗蟲16抗病16提高品質(zhì)2改善農(nóng)學(xué)性狀1其他10生物工程的應(yīng)用43geneproductsfromanimalandplantwereauthenticated——43種動、植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品通過FDA認(rèn)證Morethan60%processedfoodcontainedtransferredgenecomponents——超過60%的加工食品含有轉(zhuǎn)基因成分Thesaleofgenefoodwasmorethan$10,000million——轉(zhuǎn)基因食品的銷售額超過100億美元Morethan50%soybeansweretransferredgene——超過50%的大豆為轉(zhuǎn)基因大豆Morethan40%cornandwheatweretransferredgene——超過40%的玉米、小麥為轉(zhuǎn)基因玉米和小麥Thereare7000genefood,includinginfantfood,chocolate,frozen,margarin,bread,sausage,meatanditsreplaement——與轉(zhuǎn)基因有關(guān)的食品達(dá)七千種，包括：嬰兒食品、巧克力、冷凍甜品、面包、人造奶油、香腸、肉類及代肉類產(chǎn)品。ThesituationofgeneticengineeringinAmerica美國基因工程應(yīng)用第二節(jié)基因工程GeneticEngineering

1）1972年美國Berg,Jackson等人將猿猴病基因組SV40DNA,噬菌體基因，大腸桿菌半乳糖操縱子，體外重組獲得成功。

2）1973年美國斯坦福大學(xué)Cohen,Boyer等，在體外構(gòu)建含有四環(huán)素，鏈霉素兩個抗性基因的重組質(zhì)粒分子,導(dǎo)入大腸桿菌后穩(wěn)定復(fù)制，賦予受體細(xì)胞相應(yīng)抗生素抗性。------（宣告基因工程誕生）

3）1978年美國Genentech公司利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進(jìn)生產(chǎn)工藝----（揭開基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕）4）1983年，攜帶有細(xì)菌新霉素抗性基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得成功-------（高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世）基因工程的發(fā)展歷史5）1990年，美國科學(xué)家對一名因腺苷脫氨酶基因缺陷患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功。-------（分子醫(yī)學(xué)新紀(jì)元）

6）1991年，美國倡導(dǎo)在全球?qū)嵤┤祟惢蚪M計(jì)劃，用15年時間斥資30億美元，完成12萬5000個人類基因的全部測序工作。

7）1997年，英國科學(xué)家利用體細(xì)胞克隆技術(shù)復(fù)制出“多利”綿羊。-------（人類可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)制自身的嘗試）

2005年，鄧宏魁、丁明孝教授克隆小白鼠在中國屬首例。基因工程的發(fā)展歷史1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等人的基因重組轉(zhuǎn)化的成功標(biāo)志著基因工程的誕生。

DNA重組技術(shù)(DNArecombinationtechnique)基因工程包括DNA重組技術(shù)和其他使基因結(jié)構(gòu)得以定向改造的技術(shù)。這里所指的基因工程就是DNA重組技術(shù)，其包括以下步驟：帶有目的基因的DNA片段的獲得；DNA片段與載體DNA分子相連接（體外重組）；重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；從受體細(xì)胞中篩選和鑒定接受了重組體DNA分子的細(xì)胞；外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。52DNA重組技術(shù)示意圖一、目的基因的獲得目的基因從已有的生物基因組中分離。主要方法。從DNA分子鏈中切割所需的基因（目的基因）的手術(shù)刀——一種核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶。人工合成1.限制酶——特異切割DNA的手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)，簡稱限制酶（restrictionenzymes）：識別DNA的特異核苷酸序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA、產(chǎn)生獨(dú)特DNA片段的一類內(nèi)切酶。是一類水解DNA的磷酸二酯酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠHamiltonSmith,DanielNathans(USA)andWernerArber(Switzerland)－－1978NobelprizePrizeinPhysiologyorMedicine"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics”限制酶（restrictionenzymes）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制酶的命名按限制酶的結(jié)構(gòu)、功能等的不同，限制酶可分為三類：Ⅰ類：由3種不同亞基構(gòu)成，它能識別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，但切割電通常在識別位點(diǎn)以外至少1000bp。這類酶的作用需要Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸及ATP。Ⅱ類：只由一條肽鏈構(gòu)成，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制酶主要指Ⅱ類酶而言。僅需Mg2+為輔因子。Ⅲ類：是多亞蛋白質(zhì)，切斷位點(diǎn)不在識別序列內(nèi)；酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。限制酶的分類Ⅱ類酶識別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindromestructure)限制酶EcoRI識別位點(diǎn)的堿基順序是GAATTC，得到具有粘性末端（stickyend）的DNA片段。

58（互補(bǔ)）stickyend限制酶的作用方式BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口限制酶的作用方式三類特殊性質(zhì)的Ⅱ型限制酶同裂酶(isoschizomer)：或稱異源同工酶。來源不同的Ⅱ型酶，但有相同的識別序列。切割位點(diǎn)可以相同，也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)。同切點(diǎn)酶：不僅識別序列相同，而且切點(diǎn)也相同。同尾酶(isocaudarmer)：酶的識別序列不完全相同，但切出的粘性末端相同，例如：BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA2.取得目的基因的方法——分類法和合成法取得目的基因的方法DNA片段的直接提取用噬菌體（phage）或質(zhì)粒（plasmid）直接從宿主細(xì)胞中將目的基因攜出合成目的基因限制酶切割DNA分子，然后分離、篩選，得到含目的基因的DNA片段。噬菌體或質(zhì)粒離開染色體時，可將其插入位點(diǎn)附近的連鎖基因一起帶出（方法的局限性較大）（簡單，較常用）通過逆轉(zhuǎn)錄，從mRNA出發(fā)合成相應(yīng)的染色體DNA基因（cDNA）；也可采用分子雜交技術(shù)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)（較難）二、基因載體載體(vector)作為是指將外源DNA片段運(yùn)送進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的運(yùn)載工具。目的基因得到后，要將其轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，通常采用基因載體(genevector)作為工具來完成這一任務(wù)?；蜉d體需滿足：能自主復(fù)制或隨受體細(xì)胞染色質(zhì)DNA一起復(fù)制；易于篩選和鑒定；限制酶對其作用的切點(diǎn)少（外源DNA插入位點(diǎn)少）；易于引入受體細(xì)胞。基因載體基因載體

(genevector)質(zhì)粒(plasmid)噬菌體(phage)病毒(virus)

嚴(yán)謹(jǐn)型控制質(zhì)粒松弛型控制質(zhì)?！?/p>

1.質(zhì)粒——染色體以外的遺傳單元質(zhì)粒（plasmid）：是某些細(xì)菌中獨(dú)立于染色體外的能夠獨(dú)立復(fù)制的遺傳單元，為雙鏈閉合環(huán)狀DNA。質(zhì)粒具有復(fù)制能力，它的存在與否一般對細(xì)菌的生存沒有決定性影響。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒——其復(fù)制受染色體復(fù)制的嚴(yán)格控制。松弛型質(zhì)粒——自我復(fù)制時不受染色體復(fù)制的嚴(yán)格控制?；蚬こ坛Ｓ么祟愘|(zhì)粒。選擇基因載體時，應(yīng)選擇那些表達(dá)形狀清楚、容易鑒別的質(zhì)粒常用的質(zhì)粒有：pBR322、pSC101、ColE1、pMB9等。一般說來，一種質(zhì)粒只能在某一種宿主中復(fù)制。穿梭質(zhì)粒：有兩個復(fù)制起點(diǎn)，可在兩種宿主中復(fù)制。抗四環(huán)素基因抗氨芐霉素基因EcoRI、PstI、PvuⅡ、BamHI、HindⅢ、SalI等限制酶都只有一個切點(diǎn)，且位置不同。pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)pMB9質(zhì)粒質(zhì)粒與目的基因的結(jié)合：重組后的質(zhì)粒目的基因2.噬菌體——感染細(xì)菌的病毒以噬菌體(phage)和病毒(virus)為載體，將所需基因或含有此基因的DNA片段轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞的過程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。噬菌體（phage）是感染細(xì)菌的一類病毒。在基因工程中常用作載體的噬菌體有λ噬菌體及其衍生物、柯斯質(zhì)粒(cosmid)、及小分子的M13單鏈?zhǔn)删w等。噬菌體對細(xì)菌的感染方式有兩種：裂解：噬菌體首先吸附到細(xì)菌細(xì)胞壁的受體位點(diǎn)上，通過尾部將其核酸注入細(xì)菌細(xì)胞，然后病毒基因表達(dá)，復(fù)制DNA，合成其本身的各種成分，形成新的噬菌體，并使得宿主細(xì)胞破裂，釋放出新繁殖的噬菌體顆粒。溶原：進(jìn)入細(xì)菌的病毒DNA并不馬上復(fù)制和表達(dá)，而是嵌入到細(xì)菌的染色體中和宿主染色體構(gòu)成一個整體，并隨細(xì)菌染色體DNA一起復(fù)制。只有在一定的條件下，病毒DNA才復(fù)制與表達(dá)。這種方式稱為溶原。這個穩(wěn)定潛伏在細(xì)菌染色體中的噬菌體DNA稱為原噬菌體，含有原噬菌體的細(xì)菌稱為溶原菌。溫和噬菌體：同時具有溶原和裂解作用。常用作基因工程載體。烈性噬菌體：只有裂解作用而無溶原作用。

噬菌體λ噬菌體λ噬菌體常用作基因工程的載體，原因有：λ噬菌體及其宿主大腸桿菌的遺傳結(jié)構(gòu)個功能了解得比較清楚，其遺傳程序搞清；易于使細(xì)胞感染，易于導(dǎo)入宿主細(xì)胞。λ噬菌體作為基因載體的突出缺點(diǎn)是λDNA存在過多的限制酶切位點(diǎn)。因此，采用點(diǎn)突變等方法將λDNA進(jìn)行改造，產(chǎn)生一系列λ噬菌體衍生物載體，可分為：插入型載體(insertionvectors)：只有一個可供外源DNA插入的酶切位點(diǎn)。替換型載體(replacementvectors)：有兩個酶切位點(diǎn)，兩個位點(diǎn)間的DNA片段可被外源DNA取代。三、重組DNA的篩選及表達(dá)重組DNA操作的主要步驟：目的基因的獲取載體的選擇和構(gòu)建目的基因的表達(dá)限制酶限制酶外源目的基因與載體的連接連接酶外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化含重組體細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)錄和翻譯1.轉(zhuǎn)化——帶有目的基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞外源目的基因和質(zhì)粒載體形成重組體后，需要將重組體引入受體細(xì)胞。以質(zhì)粒為載體的外源DNA引入受體細(xì)胞并使之獲得新遺傳特性的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。轉(zhuǎn)化過程成功與否，主要取決于：受體細(xì)胞是否處于感受態(tài)。易于吸收和容納外源DNA分子的狀態(tài)，就稱為感受態(tài)。引入的重組DNA必須避免受體細(xì)胞核酸酶的降解。2.篩選——從大量受體細(xì)胞中選出帶有重組體的細(xì)胞目的基因與載體DNA正確連接的效率、重組體導(dǎo)入細(xì)胞的效率都不是百分之百的，因而最后生長繁殖出來的細(xì)胞并不都帶有目的基因。最后培養(yǎng)出來的細(xì)胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的基因的重組體。從大量受體細(xì)胞中選出帶有重組體（目的基因）的細(xì)胞的過程稱為篩選。篩選的方法有兩種：直接法和間接法。篩選的方法篩選直接法(遺傳性方法)間接法插入失活法分子雜交法放射性探針檢測法R-環(huán)檢測法免疫測定法放射性抗體測定法免疫沉淀測定法測定含有目的基因的核苷酸序列或基因表達(dá)產(chǎn)物外源DNA表達(dá)后進(jìn)行測定對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。插入失活法3.表達(dá)——外源DNA在受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯重組DNA技術(shù)的目的：目的基因在受體細(xì)胞中得以表達(dá)，產(chǎn)生具有功能性的蛋白質(zhì)或肽。外源基因在受體細(xì)胞中要能表達(dá)，須滿足一定的條件，特別是真核基因在細(xì)菌中的表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄上，在克隆的目的基因的上游接一個原核生物細(xì)胞的啟動子，作為強(qiáng)啟動子，啟動真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)；在翻譯上，采用載體上的核糖體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行真核細(xì)胞蛋白的翻譯；目的基因的插入方向與載體DNA方向一致，并保持目的基因的翻譯不會產(chǎn)生錯位。GreenFluorescentProtein(GFP)ExpressGeneforyourfavoriteproteinGeneforGFPYourfavoriteproteinThesearemadebylinkingthegenesforGFPandtheproteinusingrecombinantDNAtechnology（重組DNA技術(shù)）.YourproteincannowbevisualizedusingfluorescencemicroscopyOutputsMostcommonoutputisGreenFluorescentProtein(GFP)Outputs...ofcourse,thereisnowafullspectrumtochoosefrom...錢永健美籍華裔第三節(jié)蛋白質(zhì)工程ProteinEngineering一、蛋白質(zhì)工程的概念