細胞培養(yǎng)指南

第一節(jié)

培養(yǎng)細胞學

culturalcytology

指細胞在體外培養(yǎng)的特定條件下，通過對離體細胞的研究，獲取的研究結果與細胞生物學具有三個學科相似的信息。培養(yǎng)細胞學與細胞生物學何謂是培養(yǎng)細胞學？

細胞生理學：

研究細胞生命活動規(guī)律，如何從環(huán)境中攝取營養(yǎng)，經過代謝獲得能量，以促進生長、分裂及其表達功能的。分子細胞學：

從遺傳信息(DNA—RNA—蛋白)角度研究胞內遺傳物質的結構和表達的調控。細胞社會學：

研究整體和細胞群中細胞間的社會行為，包括識別、胞通訊和相互作用，研究整體和細胞群對細胞生長、分化和死亡等活動的調節(jié)控制。培養(yǎng)細胞學與細胞培養(yǎng)技術方向是:揭開生、老、病、死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老、防治疾病的手段或途徑，人為地誘導細胞遺傳性狀的改變，使其向更有利于人類和自然界的方向發(fā)展。培養(yǎng)細胞學與細胞培養(yǎng)技術方向細胞生物學和分子生物學的相互滲透，分子克隆技術與細胞培養(yǎng)技術結合:闡明基因的結構與功能、闡明基因在細胞生長和分化中的作用、闡明細胞癌變機制.

活細胞的研究：是當前生命科學研究中的重要核心問題之一。（一）病毒學（二）細胞生物學（三）細胞工程學（四）干細胞的培養(yǎng)培養(yǎng)細胞學的應用

（五）淋巴細胞培養(yǎng)（六）遺傳性疾病的產前檢查（七）毒性實驗及生物實驗的工具（八）在現代生物技術中應用

培養(yǎng)細胞學的應用

（一）病毒學培養(yǎng)細胞為病毒的增殖提供了場所。細胞是分離病毒最好和最方便的基質，體外培養(yǎng)的細胞存在以下特點：無抗體；不受到非特異拮抗物質的影響；對病毒的敏感性比體內細胞為高。培養(yǎng)細胞學的應用

利用細胞培養(yǎng)進行病毒定性和定量，測定50％組織培養(yǎng)感染量(50％tissuecultureinfectiousdose，FCID5o)；用于病毒感染及防治方面的研究：在制備減毒活疫苗和診斷用抗原時，細胞是病毒增殖的場所。科學家指出：細胞培養(yǎng)技術是伴隨著病毒學的發(fā)展而發(fā)展起來的。采用離心感染法或提取病毒核酸進行感染，細胞打孔器協(xié)助感染可擴大病毒感染的宿主范圍；病毒感染指標易觀察，光鏡下可見細胞病變效應(cytopathiceffect，cPE)、包涵體、細胞融合、血細胞吸附等現象，同時也便于用分子病毒學技術進行檢測。（二）細胞生物學

單個細胞克隆便于對細胞生物學的基礎理論進行研究，如形態(tài)、結構、細胞器及其功能、遺傳物質、核型、變異、細胞轉化、生長周期等。培養(yǎng)細胞學的應用

離體培養(yǎng)細胞便于進行環(huán)境因素、藥物等單因素及多因素影響的研究，探索作用機制。當今細胞生物學研究的熱點，通訊和信號轉導、增殖與細胞周期的調控、生長和分化、衰老和死亡以及干細胞的應用研究和細胞工程是以培養(yǎng)細胞學為基礎，以細胞培養(yǎng)技術為手段和工具。（三）細胞工程學利用細胞融合及雜交技術，進行細胞工程的研究與開發(fā)。如生物反應器的開發(fā)研究，將編碼某生物活性物質的基因導入動物受精卵，從這種受精卵發(fā)育的動物組織、體液分泌物中獲得外源基因的表達產物。培養(yǎng)細胞學的應用

（四）干細胞的培養(yǎng)機體最原始細胞，具有較強的再生能力，在一定條件下可分化、增殖出各類細胞。干細胞的數量極少，故需分離、保存并在體外大量培養(yǎng)，長成各種組織和器官。主要集中在造血干細胞、胚胎干細胞和神經干細胞上，已成為干細胞研究的首要課題。培養(yǎng)細胞學的應用

(五）淋巴細胞培養(yǎng)技術的應用在培養(yǎng)環(huán)境中，淋巴細胞受某些生長因子的刺激，出現旺盛的分裂、增殖。淋巴細胞培養(yǎng)的成功對反映機體免疫功能狀況起很大作用，如研究細胞標記，檢測T、B細胞數量及功能，檢測T細胞亞群(CD3、CD8、CD4．等細胞)的變化。培養(yǎng)細胞學的應用

（六）遺傳性疾病的產前檢查

羊膜穿刺術獲得羊水中的胎兒細胞進行培養(yǎng)，在妊娠早期診斷胎兒是否患有先天性遺傳病。少量胎兒脫落細胞是能分裂的，經2—4周生長，形成顯著單層上皮樣細胞，可按常規(guī)制備染色體。

培養(yǎng)細胞學的應用

檢測甲胎蛋白(alpha—fetoprotein，AFP)等，產前檢測出幾十種代謝病與遺傳病，較準確地指導優(yōu)生優(yōu)育。（七）毒性實驗及生物實驗的工具

培養(yǎng)細胞學對化學物質、放射線、激素、藥物等提供了最簡易而又可靠的方法，并對毒性機制研究提供了良好的實驗對象。對腫瘤細胞進行抗癌藥物的藥敏測試，以指導臨床抗癌藥物的使用及配伍。培養(yǎng)細胞學的應用

（八）在現代生物技術中應用基因分離、基因測序與表達、基因轉移與重組、癌基因研究等。首只轉基因猴“安迪”安迪于２０００年１０月２日出生于俄勒崗醫(yī)學大學。

培養(yǎng)細胞學的應用

第二節(jié)

體外培養(yǎng)

vitrocultural組織培養(yǎng)tissueculture細胞培養(yǎng)cellculture器官培養(yǎng)organculture培養(yǎng)細胞學的應用

一、培養(yǎng)分類

組織培養(yǎng)

從體內取出組織模擬體內生理環(huán)境，在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下生存和生長并維持其結構和功能的方法。組織培養(yǎng)

常用上皮組織:胚胎發(fā)育的內、中、外三個胚層均可分化成上皮組織。細胞形態(tài)較為規(guī)則，細胞間常以黏著物和特殊連接牢固相連。身體不同部位的上皮組織，所處的位置有著不同的功能，主要表現為保護、吸收、排泄和分泌等功能。分為被覆上皮、腺上皮、感覺上皮、生殖上皮和肌上皮等。上皮細胞濃度：（1～3）x105/ml成纖維細胞濃度：（2～6）x105/ml

接種

培養(yǎng)物是單個細胞或細胞群。細胞在培養(yǎng)時都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細胞的移動或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時間加長，傳代導致細胞出現單一化型。細胞培養(yǎng)器官培養(yǎng)：與組織培養(yǎng)條件相似，培養(yǎng)的是器官的原基，器官的一部分或整個器官，以便能夠在體外生存、生長和保持一定功能的方法。器官培養(yǎng)

根據是否附于支持物上生長的特性分為:

貼附型和懸浮型（一）貼附型

細胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependentcells)這種現象與細胞分化有關。二、細胞的特性

貼附型細胞的分型

1.成纖維型細胞：(fibroblast)來自中胚層特點：與體內成纖維細胞形態(tài)相似,胞體梭型或不規(guī)則三角形,中央有圓形核,胞質向外伸出2～3個長短不同的突起。細胞在生長時呈放射狀,漩渦或火焰狀走行。

貼附型細胞的分型

起源：細胞來自中胚層間充質組織。除真正的成纖維細胞、心肌、平滑肌、成骨細胞血管內皮細胞。注意：細胞在培養(yǎng)時成為成纖維型細胞是一種慣稱,與體內細胞不同。

2.上皮型細胞(epithliumcelltype)

來自外胚層

特點：扁平不規(guī)則多角型、圓形核、細胞緊密相連成細胞增殖數目增多時,整個上皮膜隨之移動。邊緣細胞很少脫離細胞群而單獨活動“

拉網”現象與起源內外胚層組織有關。

2.上皮型細胞(epithliumcelltype)

組織:皮膚表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。

3.游走型細胞(wanderingcelltype)特點：在支持物上散在生長,不連接成片,胞質伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運動,速度快不規(guī)則,密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細胞區(qū)別。

4.多形型細胞(polymorphiccelltype)

特點：無規(guī)律的形態(tài)，如神經細胞。

（二）懸浮型細胞(suspendedcelltype)特點：不貼附在支持物生長，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間的生長，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。S180肉瘤、K562、HL－60和白細胞。

分型的目的：方便描述細胞在培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時，細胞相對穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細胞生物學性狀指標。但一般形態(tài)并不是一項可靠指標要受各方面影響。如：反復開關溫箱、溫度、C02的濃度、培養(yǎng)基變堿、支原體、pH值。細胞在接種時呈三角型狀態(tài)，經培養(yǎng)一定時間后，細胞在傳代前已形成上皮型細胞。

三.細胞生長與增殖

培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器，生存空間及營養(yǎng)有限，當細胞增殖到一定密度后，分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，使細胞更好地生存，這一過程稱之為“傳代”(passage或subculture)。值得注意的是：每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

三.細胞生長與增殖

（一）細胞生命期(lifespanofculturecells)指細胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時間。一般根據細胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

例如：二倍體成纖維細胞，在不凍存和反復傳代條件下可傳30～50代，相當于150～300個細胞增殖周期，能維持一年左右的生命，細胞便開始凋亡(apoptosis)。細胞在生存過程中經歷以下三個階段

老化死亡接種培養(yǎng)第一次傳代傳代期初代培養(yǎng)細胞系連續(xù)細胞系轉化0246810121416周指數細胞數量正常培養(yǎng)細胞生命期1.原代培養(yǎng)期(primaryculture)組織到第一次傳代時間大約為1～4周特點：細胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。原代與體內原組織形態(tài)結構和功能活動基本相似。

各細胞的遺傳性狀互不相關，細胞相互依存性強，如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)細胞克隆的形成率(cloningefficiency)下降，表明細胞獨立生存性差。

2.傳代期(passage)初代培養(yǎng)細胞一經傳代便稱之為細胞系(cellline)特點：細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploidcellline)為了保存二倍體細胞性質，細胞應在初代或傳代早期凍存為好。

一般細胞在10代以內凍存。

凍存配方：向培養(yǎng)液加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。存于在液氮中溫度可達到－196℃，可長期儲存。如解凍后細胞復蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細胞性狀不受影響，成為保存細胞最主要的手段。

3.衰退期特點：細胞仍生存增殖減慢不增殖輪廓增強衰退凋亡注意：細胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化(spontaneoustransformation);

細胞可能獲得永生性(immortality)或稱為惡性(malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系(continuouscellline)。當細胞獲得不死性后,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

（二）培養(yǎng)細胞一代生存期

“一代”指細胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時間。與細胞倍增一代不是一個含義。在細胞一代中，細胞能倍增3～6次，經歷三個階段：指數增生期細胞數增大極限點細胞增殖率極限點潛伏期平頂期衰退死亡細胞增生數

024487296120時培養(yǎng)細胞一代增殖生長過程貼附現象是復雜和受多種因素的影響。細胞不貼附：底物表面不干凈，影響細胞貼附。利于細胞貼附：底物表面帶有陽性物質與特殊物質:纖粘連蛋白(fibronectinFN)、細胞表面蛋白(cellsurfaceproteinCSP)這些物質有的存在與細胞表面,有的來自血清。1.潛伏期(latentphase)：接種經過懸浮期(細胞質回縮,胞體呈圓球形)貼壁。初代培養(yǎng)細胞經過10～24小時或更多時間。連續(xù)細胞系和癌細胞系經過10～30分鐘貼附。

潛伏期特點：長短與細胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質有關。(1)細胞貼附后進入潛伏期,細胞無增殖。少見分裂相，細胞有運動活動。(2)初代培養(yǎng)細胞潛伏期約為24～96小時或更長，

連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期約6～24小時。(3)細胞接種密度大潛伏期短。(4)細胞出現分裂相增多時，標志細胞進入指數增生期。

2．指數增生期(logarithmicgrowthphase)：特點：細胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。細胞分裂指數(mitotieindexMI)：表示每1000個細胞中的分裂相數。條件：分裂相數與細胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關。

細胞分裂指數：初代細胞：在0.1％～0.5％之間％,連續(xù)分裂細胞和腫瘤細胞：3～5％。指數增生期是作為細胞一代活力最好的時期,是進行實驗最好和最主要的階段。指數增生期持續(xù)3～5天，細胞數量增多后生長空間變小，細胞相互接觸可連接成片。

正常細胞：細胞相互接觸能抑制細胞運動，這種現象稱為接觸抑制(contactinhibition)。腫瘤細胞：沒有這種現象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細胞的標志之一。當腫瘤細胞達到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細胞發(fā)生堆積(piledup)。

由于細胞不斷增殖分裂，細胞數量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多，細胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Densityinhibition),導致細胞分裂停止。

3.停滯期(stagnatephase)細胞量和密度達到飽和，細胞停滯增殖。表明細胞進入到停滯期,細胞數量持平，也稱為平頂期(plateau）。

特點：細胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產物積累增多,pH降低，此時需要傳代,否則細胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細胞會從底物脫落死亡。

注意：傳代過晚將影響下一代細胞的生長,至少要再傳

1～2代。通過換液淘汰死細胞和受損較輕的細胞。待細胞全部恢復后再用。在這一點上操作時一定要特別注意。

分散生長接觸抑制消失接觸抑制何種細胞？

細胞？G1期特點：細胞進入增殖狀態(tài)。細胞持續(xù)時間的長短取決與營養(yǎng)物質的獲得和生長因子的作用短則4～6小時，長可達幾天；此期細胞內蛋白質合成、RNA合成、核糖核蛋白體合成增多，胞體增大，是鏡下唯一可見的變化。

四.培養(yǎng)細胞的增殖過程

G1期的細胞是接收外界因子影響的特定階段稱為調節(jié)點(reguluationpointRP)如細胞獲取營養(yǎng)不足或因子的缺乏在R點作用下,細胞在G1期發(fā)生受阻,G1期時間延長。

S期特點：細胞發(fā)生DNA合成，約為6～8小時，DNA合成一經開始，能持續(xù)進行，獨立性較大，并對環(huán)境不利因素有一定耐受能力。由于DNA在進行合成時，多核苷酸雙鏈發(fā)生分離，細胞易受到突變或致癌因素作用的影響。值得注意：

S期是遺傳物質易受突變物損傷的時期。

G2期特點：DNA含量加倍，具有4倍量的DNA。細胞持續(xù)時間較短平均為2～5小時。細胞發(fā)生與細胞分裂有關的RNA合成和染色質螺旋化。細胞對外界環(huán)境敏感，易受溫度、pH及各種其他因素的影響而受阻，不能進入M期。當不利因素消除后,細胞能很快恢復。

M期特點：是研究細胞有絲分裂過程理想的對象，細胞分裂相形態(tài)和分裂過程，在相差顯微鏡下可清晰觀察到。

細胞分裂過程分期：

前期：細胞質逐漸回縮，細胞體變園與底面附著面減少，脫落入培養(yǎng)液中，染色體由分散狀態(tài)開始向細胞中央部移動，突然“凍結”于赤道平面，前期持續(xù)時間為20～30分鐘。

中期：正在發(fā)生的變化：復制后的染色體任意地排在紡錘體的中央(稱赤道板)。

后期:染色體分成兩組分別向兩極移動,整個細胞由圓球形變成橢圓形,胞體呈啞鈴形,后期時兩組染色體相互分離。細胞分裂過程最快持續(xù)時間5～7分鐘，在鏡下可直接觀察到。

末期：兩組染色體達到兩極,胞體中部變細染色體變成染色質,核仁核膜再現、胞體逐漸分離、形成兩個子細胞,有細絲相連,經過較長時間兩個子細胞各自獨立。

細胞質延展于底物變扁。末期持續(xù)時間為20～30分鐘。

細胞分裂全程持續(xù)時間一般為30～60分鐘。因細胞種類不同和溫度變動,分裂時間將有一定差別。

一定條件下：單個細胞表現獨立性，生存和增殖,但不能長久生存。有活力的細胞需要繁殖形成群體細胞，是培養(yǎng)細胞的基本存在形式。與體內細胞相似,細胞與細胞之間具有形態(tài)和機能上相互依存關系。

結構:上皮細胞可見橋粒,說明細胞間有擴散的能力。五.細胞和細胞、細胞和基質的相互關系

生理活動四個要點:單個細胞生存能力不如群體細胞強,說明細胞之間能相互溝通信息。正常細胞一旦兩相鄰細胞發(fā)生接觸，出現接觸抑制現象,導致運動停止。

生理活動四個要點:正常細胞群體依賴性（populationdependencePD）比惡性細胞PD小。單細胞培養(yǎng)和軟瓊脂培養(yǎng)是檢測細胞PD的常用方法。

體內細胞：細胞的分化與細胞外基質(extracellularmatrixECM)有密切關系。離體培養(yǎng)細胞：細胞對ECM也仍有依存性。應用適應的ECM（如上皮細胞對膠原）能誘導細胞特性表達；ECM對細胞貼附、分化、生長和增殖等都起到重要作用。

小結--細胞生存狀態(tài)體外培養(yǎng)的細胞與體內細胞相同,體外細胞具有兩種生存狀態(tài):增殖態(tài):通過分裂增殖,細胞數量增加;分化態(tài):向特定方向分化,完成細胞特定功能活動,如保護、分泌、吸收和排泄等。細胞兩種功能狀態(tài)是相對的，交替發(fā)生并相互依存。

培養(yǎng)細胞生存途徑和物質代謝與體內細胞基本相同，隨生存環(huán)境改變出現一定差異。（一）環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證培養(yǎng)細胞生存的首要條件。保證細胞生存環(huán)境無任何污染、代謝物及時清除，是維持細胞生存的基本條件。

六.細胞生存環(huán)境、條件和代謝

(二)溫度：人哺乳動物：36.5℃±0.5℃;鳥類：38.5℃;培養(yǎng)細胞對低溫耐受力比高溫強；溫度上升不超過39℃時,細胞代謝強度與溫度成正比。39～40℃1小時,受損傷的細胞可能恢復；41～42℃1小時,嚴重損傷,個別細胞恢復；43℃以上1小時，細胞全部死亡。溫度不低于0℃時,細胞代謝有影響,無傷害作用;置于25～35℃，細胞能生存，但生長速度減慢；放在4℃數小時,再放回37℃細胞仍繼續(xù)生長。細胞代謝隨溫度降低而緩慢，溫度降至冰點以下時,細胞因胞質結冰受損而死亡。

(三)氣體環(huán)境和氫離子濃度氣體：氧氣和二氧化碳

氧氣:參與三羧酸循環(huán)產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種所需成分。開放式培養(yǎng)(碟皿或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng))細胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環(huán)境中。

CO2:

細胞代謝產物,是細胞所需成分。主要作用:維持培養(yǎng)基的pH值。大多數細胞的適宜pH7.2~7.4，偏離此范圍對細胞將產生有害的影響。有些細胞存在差異。如羊水細胞培養(yǎng)檢測染色體時pH為7.6。

細胞耐酸比耐堿性大一些,在偏酸性環(huán)境中更有利于細胞生長。為了維持培養(yǎng)液恒定的pH，最常用磷酸緩沖劑方法。磷酸緩沖劑中NaHco3,可供給CO2但容易逸出，適用：封閉式培養(yǎng)的細胞。（無CO2培養(yǎng)箱）

Hanks平衡液:

含有低濃度的NaHCO3,當打開含有Hank液培養(yǎng)瓶時，CO2迅速逸出而導致酚紅指示劑變紅，表明培養(yǎng)液pH變堿，細胞在堿性的環(huán)境中時間過長可使細胞堿中毒。

羥乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid縮寫HEPES)HEPES：

對細胞無毒性也不起緩沖作用，主要作用是：防止pH迅速變動，在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持恒定的pH。（四）細胞生存所需基本物質與體內基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂類三大類營養(yǎng)物質外，一定量的無機鹽、維生素和微量元素等，但需要的量以及代謝方式與體內細胞不盡相同。糖：六碳糖是主要的能源通過糖酵解形成乳酸和通過檸檬酸形成CO2。胚胎細胞和一些轉化細胞的培養(yǎng)基中常見到乳酸堆積現象。糖是合成某些氨基酸的原料；經過乙酰輔酶A（CoA）合成脂肪；經過糖解磷酸通路能合成核酸。各種糖的吸收取決于它們進入細胞的能力,其中葡萄糖最強,半乳糖最低。2.氨基酸：

12種氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、異亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)是細胞蛋白質合成的原料。

所有細胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促進各種氨基酸進入細胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的來源；是合成3，2和一磷酸腺苷時所需物;是能源和碳的來源。如沒有谷胺酰胺細胞生長不良而發(fā)生細胞死亡。所以要求各種培養(yǎng)液中都含有較大量的谷胺酰胺。

谷胺酰胺在溶液中不穩(wěn)定，應放置在－20℃冰箱保存，用前加入培養(yǎng)液內。已含有谷胺酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱內可放置兩周以上時重新加入原來量的谷胺酰胺。需要維生素、生物素、葉酸、胭酰胺、核黃素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。這些維生素在常用培養(yǎng)基中已成為固定組成分。脂溶性維生素對細胞生長也有作用,一般從血清中得到補充。3.促生長因子：培養(yǎng)液除營養(yǎng)成分外，也需要激素類物質起到促進細胞增殖生長作用。胰島素(1-10單位)促進細胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松(10-8-10-7M)促進表皮上皮細胞和乳腺上皮細胞增殖生長的作用，提高神經膠質細胞和成纖維細胞的克隆形成率；

雌激素和雄激素，或使用黃體酮和氫化可的松對乳腺上皮細胞培養(yǎng)效果則更好。血清是提供生長因子和其細胞所需物質的來源。目前血清、各種組織和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。

4.

其它物質：

在細胞生長過程中,需要鉀、鈉、鈣、鎂氮和磷以外，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒銅、錳、鉬釩等。需要促細胞粘附物質其作用是：有助于促細胞貼附在各種底物或支持物上組織生長。

5.人工培養(yǎng)基：細胞在體外的生存環(huán)境是人工模擬的，除注意到無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養(yǎng)基，是供給細胞營養(yǎng)和保證細胞生長組織的物質。培養(yǎng)基種類:半固體和液體培養(yǎng)基兩類。

液體培養(yǎng)基：分為合成、天然和無血清培養(yǎng)基三種。

A．合成培養(yǎng)基：成分清楚,通過調節(jié)各種成分的數量和種類,再借觀察細胞生物狀況反應性變化,測定細胞與外界環(huán)境的適應能力。借以了解細胞生存條件,誘導細胞進行定向分化的等。

合成培養(yǎng)基在應用上廣泛。B．天然培養(yǎng)基：

用人或動物血清、血漿和胎汁等。常用牛血清。血清含有多種促生長因子、貼附因子及其它活性物質等。加入5％血清：維持細胞不死或緩慢生長；加入10％～20％血清：細胞增殖生長。血清的主要作用提供細胞生存、生長和增殖所必需的生長調節(jié)因子。補充培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。含有生長基質成分使細胞易貼附在培養(yǎng)器皿上。血清的主要作用提供載體蛋白，可結合維生素、脂質、金屬離子等。有中和毒性物質保護細胞不受傷害。提供蛋白酶抑制劑，保護細胞不受死細胞釋放的蛋白酶的損害。血清存在的問題存在有害于細胞生長和繁殖的物質。如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子。成分不明確，影響對結果的分析。不同動物、不同批次的血清和活性差別較大，使培養(yǎng)的結果不穩(wěn)定。C.無血清培養(yǎng)基(serumfreemediumSFM)：條件培養(yǎng)液其成分已知；排除含血清培養(yǎng)基的未知成分的干擾，實驗結果可靠。主要應用：蛋白質組和生物工程的研究。在無血清培養(yǎng)基中，可以加入其他來源的蛋白質，如：白蛋白、牛腦垂體提取物、植物提取液。具有促進細胞生長增殖的作用。

6.附著底物:除少數懸浮型細胞外,絕大多數體外培養(yǎng)細胞需附著在適宜的底物上生長。不同細胞對底物要求不同，底物不適對細胞生長不良。常用的底物：A.玻璃：如用NaOH處理，性質能受到一定影響;酸中和以后再用（新的鹽酸泡）易碎。B.一次性塑料：聚苯乙烯:多為一次使用。聚四氟乙烯包括：

充電荷：親水性，適用單層培養(yǎng)不充電荷：疏水性，適用巨噬細胞、轉化細胞的培養(yǎng)。聚四氟乙烯透氣性好可制成薄膜，剪成小塊后放入各種瓶皿中，適于細胞貼附生長，也便于取出，可進行染色和做電鏡切片。7.抑制細胞生長因素1.培養(yǎng)液消毒2.操作不慎使有毒物質混在細胞生存的環(huán)境中，抑制細胞生長。3.血清滅活處理可除去補體和降低免疫球蛋白的毒性,并不損傷多肽生長因子，但可能消滅另一些更有用的營養(yǎng)成分，因此有人提出，滅活血清不一定比不滅活血清更好。第三節(jié)

培養(yǎng)細胞的分類

正常細胞

腫瘤細胞

正常細胞培養(yǎng)

人或動物體外培養(yǎng)都不易，建立細胞系更難。原因：是分化細胞；生存條件嚴格；目前沒有模擬與體內完全一樣的方法；只要一切條件適當時,仍有培養(yǎng)成功的可能；初代比傳代容易。體外培養(yǎng)的上皮組織基本特點

來源：外、內、中三個胚層。特征：1.細胞排列密集，易形成膜狀呈貼壁性生長。細胞常相互粘附，具有生長的接觸性抑制現象。2.上皮組織細胞的結構和功能同樣表現出極性。3.細胞的增殖和分化依賴于促細胞生長因子的作用。3.上皮細胞的特殊結構，如微絨毛、緊密連接、橋粒等，在培養(yǎng)細胞中也可見到。細胞極性（Cellpolarity）:A.是指細胞在形態(tài)和功能上的方向性和不對稱B.形成的中樞位于中心體。

中心體是細胞的中心。間期細胞的中心體只有一個，從中放射出微管系統(tǒng)。中心體只能位于細胞核的一側，這便有了“上下”之分。C.細胞內許多細胞器的定位、物質的運輸和分揀等，均與微管運輸的向著正極或向著負極方向有關。定向轉運體系:該體系能夠確保哪些物質被運送到上皮細胞的質膜頂區(qū)，哪些被運送到細胞的側面或底面。例如，從內質網到高爾基體再到胞內體和分泌囊泡的定向轉運體系就是通過與微管系統(tǒng)的偶聯(lián)實現其方向性的，

細胞表面:由細胞表面提供的方向信息也可以通過信號轉導和細胞骨架系統(tǒng)傳遞到細胞內部。細胞皮質:細胞皮質可以選擇性地吸附不同種類的mRNA，使細胞內形成蛋白質合成的濃度梯度，從而提供極性參照物質。上皮組織的細胞培養(yǎng)條件要求比較高，常需生長在特殊的生長基質，極易失去在體內巳有的分化特征，如細胞極性等。注意：保證上皮細胞在體外的生長和繁殖；應盡可能地恢復和誘導上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的分化。這是上皮組織體外培養(yǎng)成功與否的關鍵。上皮細胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染：根據上皮組織分布的特性，位于體表或襯貼消化道、呼吸道內等處的上皮組織，直接暴露或同外環(huán)境相接觸，組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機會較多。要求在組織取材時就嚴格滅菌；分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設法消除可能會出現的微生物污染。培養(yǎng)中所使用的各種液體，包括細胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素，抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。(2)生長基質的支持：上皮細胞依賴貼附于某種支持物上才能生長，即所謂的貼壁依賴性細胞。在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質，如膠原或其它細胞外基質成分等，模擬體內的基膜結構，不僅特別有利于上皮細胞的貼附和生長，也有利于培養(yǎng)細胞的分化．使細胞極性表現更為明顯。(3)特殊的培養(yǎng)基：培養(yǎng)基有M199、RPMl1640、DMEM和HamFl2。其中以M199和RPMl1640較為常用。M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存，對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。M199和RPMl1640DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用?？纱龠M上皮細胞的貼附；維持上皮細胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。DMEM和HamFl2特別適用原代上皮細胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機離子，更加利于細胞的生長和代謝。在實際培養(yǎng)時，將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。加入血清，但出廠血清成分復雜，含有一定量的有毒物和抑制物。HamFl2培養(yǎng)基的特殊性(4)去除成纖維細胞：上皮組織借薄層基膜和結締組織相連。取材分離細胞時會帶入少量結締組織成分，常常造成成纖維細胞與上皮細胞混和生長。由于成纖維細胞具有增殖能力和粘附能力強的特點，很容易“瘋長”為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細胞群，從而干擾或抑制上皮細胞的生長，成為上皮細胞的“細胞污染源”。

成纖維細胞>上皮細胞

因在上皮細胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中，要特別注意上皮細胞的純化，去除和抑制成纖維細胞的生長。

內皮細胞：來源：人臍帶臍靜脈，動物動脈消化：用膠原酶比胰蛋白酶消化好。但要注意掌握消化時間和雜細胞（成纖維細胞和平滑肌細胞）。內皮細胞的鑒定用免疫組化染色檢測VIII因子相關抗原和CD34抗原,鑒定內皮細胞。觀察細胞是否呈單層貼壁生長,細胞形態(tài)，如長梭形、多角形三角形、四邊形為主,呈典型的“鋪路石”樣征象；觀察第三代細胞純度是否達95%以上。如消化時間過長或操作不慎、刮取過重時，會造成血管內皮下層與外膜成纖維細胞以及中膜平滑肌細胞污染。由于這些雜細胞生長較快，隨著傳代次數越多，其污染的程度越重，從而使培養(yǎng)失敗。介紹排除雜細胞的方法：1、使用含肝素的培養(yǎng)液：在培養(yǎng)液中加入90U／ml的肝素，可使內皮細胞純度提高；2、在相差顯微鏡下刮去明顯的雜細胞群。排除雜細胞的方法

表皮細胞:來源：小兒包皮、全皮細胞不易與成纖維細胞混合生長區(qū)分。以膠原為底物；pHCa2+

溫度低易生長；在培養(yǎng)基中加入氫化可的松(10g/ml〕；或10-6異丙腎上腺素；或10-10霍亂毒素；或10ng/ml表皮生長因子；上述任何一種物質細胞易生長。

巨噬細胞：特點：保持原有形態(tài)和吞噬物功能，易于分離不易建立傳代細胞系，生存2～3周無刺激：小鼠/只2～3106個/只刺激物：牛血清、礦物油、硫羥乙酸鹽，刺激1ml/只20～30106個/只,但刺激物難消化掉，殘留在細胞內，干擾細胞生長。用40ugPHA注射腹腔中6～18106個/只，效果好。PHA:植物凝集素乳腺細胞：來源：腺上皮細胞消化：膠原酶注意：接種底物加膠原使用1640培養(yǎng)基加10％小牛血清,補加氫化可的松、胰島素；乳腺細胞易生長。心肌細胞：來源：心室肌,1～3ｄ齡,

剪成0.5～1ｍｍ3大小組織塊,放入錐形瓶中。消化：加入(0.8ｇ/Ｌ)膠原酶Ⅰ,在37℃水浴,磁力攪拌器轉速為100ｒ/ｍｉｎ,消化10分鐘。消化:膠原酶Ⅰ,0.25%胰蛋白酶易于生長：50ｍｇ/Ｌ多聚賴氨酸涂在培養(yǎng)瓶內.注意：分次消化可減輕膠原酶或胰蛋白酶對單細胞的破壞作用。消化溫度在35～37℃左右,過高溫度會增加膠原酶或胰蛋白酶的毒性,溫度過低會降低膠原酶或胰蛋白酶的活性。心肌細胞質量評價：

純度鑒定:鏡下觀察、計數純化后的細胞；觀察：心肌細胞成圓型成纖維細胞成梭形,計算：心肌細胞純度=心肌細胞數/(心肌細胞數+成纖維細胞數)×100%。神經細胞：消化：0.1%胰蛋白酶10－5M阿糖胞苷去除膠質細胞。成纖維細胞建立細胞株系的最常用來源：以人胚皮膚、幼兒包皮為好消化；胰蛋白酶注意：1.從細胞生長到第一次傳代需1～2個月左右時間2.以后傳代7～10天傳1次，3～4天/次（換液〕3.無菌操作減少霉菌的污染;二性霉素抑制霉菌生長，但也能抑制細胞生長4.如組織塊，絕對避免翻動和振動，否則組織塊不易附著或附著后脫落.干細胞的培養(yǎng)干細胞(stemcells)是指來自胚胎、胎兒或成體未分化的具有無限或長期自我維持和自我更新能力的細胞。兩個基本性質：即能夠自我更新和能產生許多分化的后裔。根據組織來源不同，干細胞分為：1、胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)2、成體干細胞(adultstemcell，AS)。細胞在體外特定的培養(yǎng)條件下，能連續(xù)傳代，分化為外胚層、中胚層和內胚層多種譜系細胞，保持了正常細胞的核型和極高的端粒酶活性。

胚胎干細胞的培養(yǎng)：1、胚胎干細胞（ES）來自胚胎期桑椹胚的卵裂球或胚泡的內細胞團(innercellmass，ICM)。2、胚胎生殖干細胞(embryonicgermcell，EG；germstemcell,GSC)，是負責產生配子的一群具有自我復制能力的細胞。與ES相似，具有發(fā)育、分化的潛能和特征，但組織來源不同于ES。成體干細胞的培養(yǎng)成體干細胞(adultstemcell，As)，是一種存在于不同組織中的未分化的細胞，并長期保持自我更新的能力，具有分化為該組織特定形態(tài)特征和功能的各種類型細胞。

成體干細胞具有可塑性，在特定培養(yǎng)條件下可從一種組織類型分化為另一種組織類型，如造血干細胞能分化為神經干細胞，盡管其機制不明，但提示特定的培養(yǎng)細胞生長的微環(huán)境(niche)對細胞的分化起著至關重要的作用。人成體肝臟干細胞體外分離、培養(yǎng)及鑒定

肝癌旁組織剪小,4℃Hank’s液反復沖洗。離心,加入0.05%Ⅳ型膠原酶溶液,37℃恒溫水浴振蕩消化(1h),過200目網濾,離心。用4℃無血清DMEM/F12培養(yǎng)液漂洗細胞沉淀,離心。細胞在含15%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液,接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶中,可加入25μg·L-1生長因子濃度,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周以上。

以細胞長滿瓶底為準.。生長因子作用:肝細胞生長因子(HGF)、α-成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)及白血病抑制因子(LIF)對肝癌癌旁組織細胞的原代培養(yǎng)非常重要,可獲得比較穩(wěn)定的細胞以便傳代。

人成體肝臟干細胞鑒定免疫磁珠篩選加抗人C2-kit抗體,4℃,30min。加免疫磁珠20μL,4℃放置15min。加Buffer.安裝免疫磁株架,向磁柱中加入Buffer500μL,清洗磁柱。將細胞混勻加入磁柱中,磁柱中液體滴入底面放置的無菌試管中;所滴出的細胞為C2kit-,留在磁柱上的為C2kit+。取下磁柱,將磁柱中的細胞液(C2kit+)壓入試管中,離心,加入到培養(yǎng)瓶中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。人成體肝臟干細胞鑒定C2kit+細胞免疫熒光染色:將多聚賴氨酸包被無菌蓋玻片置于24孔板內,細胞爬片,PBS沖洗,固定。第一抗體:加入1:50兔抗人特異性一抗AFP及1:50鼠抗人特異性一抗CK19,過夜。第二抗體:PBS液漂洗。滴加熒光二抗:1:50FITC標記羊抗鼠IgG及1∶100CY3標記羊抗兔IgG,37℃孵育30min.漂洗后,熒光顯微鏡下觀察。CY3標記的AFP呈紅色顆粒。FITC標記的CK19呈綠色顆粒。二者均在胞質內表達。CK19及AFP在胞質內有部分重疊,呈黃色熒光。

肝細胞的標志物:AFP、白蛋白,表達膽管上皮的標志物如角蛋白CK7、CK19等,白血病抑制因子(LIF)抑制細胞分化的目的。二、腫瘤細胞培養(yǎng)

特性：1.與非腫瘤細胞相比能在某些環(huán)境內優(yōu)勢生長。2.形成有缺陷的多細胞結構。3.體內的腫瘤與體外培養(yǎng)的腫瘤差異小。4.具有自我保持“

干細胞”繁殖無限的代數。5.腫瘤部位含有非癌細胞即：間質細胞、被腫瘤侵入的正常組織的殘余細胞。

1.特點：光鏡：細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。EM：微絨毛、細密，微絲走形不規(guī)則。

增殖：癌細胞在低血清中(2%~5%)仍能生長表明有自泌或內泌性產生促增殖因子的能力,形成集落克隆能力,增殖數量,細胞重疊形成堆積物。浸潤性：是腫瘤細胞擴張性增殖行為,與正常組織混合培養(yǎng)時能浸潤入其它組織細胞中。

異質性：同一腫瘤內細胞的活力有差別。周邊細胞：血液供應增殖干細胞(stemcells)是支持腫瘤生長的成分易于繁殖。中心處細胞：細胞衰老退化，有的處于停滯期。遺傳性：失去二倍體核型，呈異倍體或多倍體。

2、腫瘤細胞在體外不易生長原因(1)依賴性：雖有較強克隆生長能力，仍有一定的群體性或與其細胞相依存關系。(2)分散培養(yǎng)細胞量影響細胞增殖的活性。(3)腫瘤干細胞數量(4)有些腫瘤細胞可能需要與體內相似的特殊生存條件。

3、如何培養(yǎng)好腫瘤細胞取材、成纖維細胞排除，培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物。(1)取材：盡量避免取退變組織，癌性轉移淋巴結、胸腹水是好的培養(yǎng)材料，組織盡快培養(yǎng)，如不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃，不宜超過24小時。(2)培養(yǎng)基的選擇：RPMI1640、DMEM、mc-coy5A有些腫瘤細胞需要生長因子，如乳腺癌細胞。注意：含有血清和相關生長因子更易培養(yǎng)成功。(3)成纖維細胞的排除成纖維細胞>腫瘤細胞的生長。機械刮除法：標記腫瘤細胞生長的范圍（畫圈），刮除直至完全刮除掉為止。反復貼壁法：不加血清培養(yǎng)液，把含有兩類細胞的懸液反復貼壁使兩類細胞相互分離。4、腫瘤細胞初代接種可能出現幾種現象完全沒有細胞移動;有細胞移動,但無增殖,長時間處于停滯狀態(tài),有增殖，傳代后停止生長或衰退死亡;

傳了幾代后細胞緩慢增殖經過一段停滯,又旺盛生長，形成穩(wěn)定生長的腫瘤細胞傳代系;說明：腫瘤細胞對體外生存條件要求高,不能局限一般培養(yǎng)法可采用一些特殊的措施。

選擇適應底物：純化細胞接種不同底物,如鼠尾膠底層，飼細胞層。生長因子：加一種或幾種促細胞生長因子或促生長物、胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。動物體媒介培養(yǎng)：癌瘤嫁動物體內取出培養(yǎng)裸鼠最好，瘤塊長大再培養(yǎng)。

第四節(jié)培養(yǎng)細胞成功與失敗綜合分析

一、材料選擇：細胞供給年齡：幼年>老年容易培養(yǎng)同一個體細胞：分化低>分化高同一個培養(yǎng)物細胞成分不一,存在異質性,分化程度,生物性狀增殖能力,對體外培養(yǎng)適應性不同。如皮膚成纖維細胞大多先生長,干細胞比非干細胞易生長增殖。

二、培養(yǎng)條件：細胞對培養(yǎng)基需求不同,沒有一種培養(yǎng)基是萬能的。應選相適應的培養(yǎng)基。注意：要想培養(yǎng)穩(wěn)定的細胞,應了解細胞生物學性狀和特殊需要。三、選擇不同貼附的底物四、消化酶選擇膠原纖維多的組織：膠原酶消化上皮組織細胞：胰蛋白酶五、培養(yǎng)過程污染與排除1、污染

空氣：操作凈化工作臺,工作不帶口罩,外界氣流過強,溫度大,含菌

消毒：殘留污物操作：馬虎不準確，觀念不強

血清：檢測不嚴，支原體和病毒組織：原代組織有污染，手術中污染，本身是污染組織（潰爛的腫瘤，碘酒消毒后，擦試不凈?？赡芑烊胛廴荆?、污染對細胞的影響污染時間短、輕，及時排除，細胞可能恢復。輕：細胞生長緩慢、分裂相，細胞變粗糙，細胞輪廓增強。重：停止增殖,分裂相消失,胞質中出現大量堆積物，細胞變圓,崩潰并從瓶壁脫落。3、微生物：支原體：無致死毒性，可與細胞長期共存，對細胞影響潛在。霉菌：

細菌：增殖快，短時間在數量上壓過細胞產生毒素殺死細胞。病毒：真菌：種類繁多，形態(tài)各異，呈白色或淺黃色小點，飄浮于培養(yǎng)液面，肉眼可見。鏡下：呈絲狀或管狀、樹枝狀絲，縱橫交錯穿行于細胞間。支原體：介于細菌與病毒之間，能獨立生活的最小微生物無細胞壁，形態(tài)多樣，0.2um，可通過濾器圓形絲狀或梨形，在光鏡下很難看清結構。對青霉素普遍有抗藥性。細胞受到支原體污染后出現以下情況：

嚴重：細胞增殖緩慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。輕：無明顯變化，或有微細變化由于傳代和換液而緩解觀察不夠細心或缺乏經驗，檢查不出。

支原體檢測：相差：油浸下觀察，暗色微小顆粒，有類似布朗運動，分布細胞表面和細胞之間。值注：支原體與線粒體相似，需加以區(qū)別支原體染色Carnoy固定。低張?zhí)幚淼匾兰t：地依紅2g冰醋酸60ml加水至100ml染色15分鐘脫水封固。光鏡:支原體為暗紫色小體,附細胞外或散在細胞之間。Hoechst33258:為DNA特異結合的熒光探針，支原體DNA能被著色，是檢測支原體最方便、有效的一種方法。醋酸:甲醇（1:3）固定，33258(50g/ml)染色10分鐘，漂洗后觀察。細胞DNA支原體

常用抗生素用量和效應

抗生素

濃度(量/毫升)對象和效應

范圍實用細菌支原體青霉素10～1000U100U/ml+++鏈酶素10~1000g100g/ml+++#慶大霉素10~200g50g/ml+++#卡那霉素10~1000g100g/ml++#+紅霉素10~100g50g/ml++四環(huán)素5~50g10g/ml++++多粘菌素10~1000g50g/ml++#兩性霉素B1~50g3g/ml++制霉菌素 1~500U50U/ml++截耳素衍10g/ml+++生物(BM-1)四環(huán)素衍生物(BM-2)5g/ml+++4－氟，2－羥基喹啉(CIP)10g/ml+++

工具：微孔濾膜：

能濾除支原體在內的粒子，處理受支原體污染的培養(yǎng)液或血清，但不能去掉附于細胞表面的支原體。藥物：溴尿嘧啶(Bromouracil)支原體的DNA也攝取溴尿嘧啶，用光照射，通過光敏效應殺滅支原體。第五節(jié)細胞觀察活細胞觀察活性染料固定染色法

一.活細胞觀察鏡下觀察：細胞無色透明，倒置顯微鏡或相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)結構：細胞膜和細胞質。生長狀態(tài)好:胞內無顆粒,不見空氣,胞膜清晰,上清液透明，無懸浮細胞和碎片。生長狀態(tài)不好：胞質出現空氣脂滴和顆粒狀物，細胞之間的空隙加大細胞形態(tài)不規(guī)則。1

活性染料：原理：能進入活細胞,一些無毒或毒性很小的染料,電性吸引而堆積在細胞中某些特定的結構從而顯色,不引起物理和化學變化,對細胞生命活動不會產生影響或影響很少。包括：中性紅、結晶紫、健那綠、次甲基藍、甲苯胺藍、亮焦油紫。特點：它們解離后帶正電荷，屬堿性染料與胞內構造有一些結合。

二．固定染色方法1．固定：迅速殺死細胞再染色進行觀察。目的：使細胞內的蛋白質、脂肪、核酸及糖等轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|，避免自溶腐敗。固定的細胞保持原有結構，保存時間長。由于固定劑性能不同，如一種固定劑對某種結構保存效果好，但對別的結構就不一定適合，染色劑對細胞內的各種化學成分有不同的親和力，所以每種組織通常有一些特定的固定染色方法。一.常用固定劑包括:1.75％酒精、2.4％多聚甲醛（多聚甲醛為粉末狀，緩慢加入在60℃水浴中溶化），3.甲醛/冰醋酸（冰醋酸1份：甲醛3份），4.FAA（80％乙醇90ml、冰醋酸5ml、中性福爾馬林5ml）5.中性福爾馬林：福爾馬林10ml、Na2HPO4(無水)0.78g、NaH2PO4(無水)0.42g加0.85%NaCl至100ml