第四篇典型發(fā)酵工程(過(guò)程篇)

第四篇典型發(fā)酵工程

（過(guò)程篇）第27章抗生素生產(chǎn)工藝（青霉素）第28章氨基酸生產(chǎn)工藝（賴氨酸）第27章抗生素生產(chǎn)工藝27.1概述（視頻抗生素濫用之禍）27.1.1抗生素：微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）或動(dòng)植物在生命活動(dòng)中產(chǎn)生的，低濃度下選擇性地抑制或殺滅其他微生物或腫瘤細(xì)胞的具有生物活性的物質(zhì)?？咕?、抗腫瘤、抗病毒、抗原蟲、抗寄生蟲、抗血纖維蛋白溶酶作用。目前人們?cè)谏矬w內(nèi)發(fā)現(xiàn)的6000多種抗生素，約60％來(lái)自放線菌。27.1.2抗生素發(fā)展史抗生素是現(xiàn)代生物學(xué)史上最偉大的成就之一。是人們使用最多的藥物，也是制藥工業(yè)中利潤(rùn)最高的產(chǎn)品。世界各國(guó)由發(fā)酵法生產(chǎn)的抗生素約400種，廣泛應(yīng)用的僅120種?？股厣a(chǎn)為近代微生物技術(shù)中最大產(chǎn)業(yè)之一，世界產(chǎn)量超過(guò)35000噸，不但在經(jīng)濟(jì)上占有重要位置，且為人類健康作了出巨大貢獻(xiàn)。

青霉素：弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素是最早發(fā)現(xiàn)并用于臨床的一種抗生素。1928年英國(guó)人FIeming發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)40年代投入工業(yè)生產(chǎn)，它能有效地控制傷口的細(xì)菌感染，在二戰(zhàn)期間挽救了數(shù)百萬(wàn)戰(zhàn)爭(zhēng)中受傷者的性命。推動(dòng)抗生素發(fā)展：牛津大學(xué)病理學(xué)教授弗洛里、錢恩等優(yōu)秀的化學(xué)家。1952年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給塞爾曼·亞伯拉罕·瓦克斯曼（SelmanAbrahamWaksman

），他發(fā)現(xiàn)了鏈霉素，第一有效抗生素用于治療肺結(jié)核。

27.1.3抗生素的分類抗生素的分類27.2抗生素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程

1.生物合成法：

①傳統(tǒng)方法②“工程菌”制造法③細(xì)胞融合技術(shù)法

2.化學(xué)合成法；

3.生物合成+化學(xué)合成法生產(chǎn)方法27.2.1生物合成法：①傳統(tǒng)方法：多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產(chǎn)生

菌種從土壤中分離、篩選獲得，采用深層通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。由于傳統(tǒng)方法存在很多不足，人們采用基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)，對(duì)抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行了改造，可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，通過(guò)改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長(zhǎng)。②“工程菌”制造法

第一次由“工程菌”制造的全新抗生素—麥迪紫紅素A是美國(guó)報(bào)道的。將產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構(gòu)建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。

我國(guó)新構(gòu)建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把?；富蚩寺〉娇敲顾禺a(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌”生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對(duì)耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。③細(xì)胞融合技術(shù)法

對(duì)抗生素產(chǎn)生菌采用細(xì)胞融合技術(shù)的成果更為突出。橄欖色無(wú)孢小單孢菌細(xì)胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高100倍。目前DNA重組技術(shù)已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，不久將來(lái)會(huì)有更多的由“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問(wèn)世。27.2.2化學(xué)合成法

根據(jù)某種抗生素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，通過(guò)化學(xué)合成的方法，可生產(chǎn)部分抗生素。如氯霉素、磷霉素等。經(jīng)過(guò)化學(xué)合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來(lái)越多的抗生素可用化學(xué)合成法生產(chǎn)。27.2.3生物合成加化學(xué)合成法許多細(xì)菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，證實(shí)某些抗藥性因子位于細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)粒在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移使抗性菌日益增多，抗生素療效就越來(lái)越低。為對(duì)付細(xì)菌的抗藥性，科學(xué)家對(duì)抗生素進(jìn)行了“整容手術(shù)”，細(xì)菌因再無(wú)法識(shí)別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死?，F(xiàn)在已能使用克隆了酰化酶基因的“工程菌”（大腸桿菌）高效率的生產(chǎn)半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類）、氨芐青霉素就是這類半合成抗生素類藥物。生產(chǎn)前期研究產(chǎn)生菌的篩選抗菌性試驗(yàn)提取、精制、鑒定毒性試驗(yàn)藥理和臨床試驗(yàn)Agardiffusionassayagarplate瓊脂培養(yǎng)基lawnoftestbacteria測(cè)試菌苔filterpaperssoakedwithtestcompounds含藥物濾紙zonesofinhibition(nogrowth)

抑菌圈微生物發(fā)酵生產(chǎn)抗生素的基本過(guò)程菌種→孢子制備→種子準(zhǔn)備→發(fā)酵→發(fā)酵液過(guò)濾與預(yù)處理→提取及精制→成品包裝Fleming分離的點(diǎn)青霉，只能產(chǎn)生2U/ml青霉素。目前全世界用于生產(chǎn)青霉素的高產(chǎn)菌株，大都由一種產(chǎn)黃青霉菌株經(jīng)不同改良途經(jīng)得到;20世紀(jì)70年代前育種：誘變和隨機(jī)篩選方法；現(xiàn)在原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因克隆技術(shù)青霉素工業(yè)發(fā)酵已達(dá)80000U/ml。生產(chǎn)菌株一般在真空冷凍干燥狀態(tài)下保存其分生孢子，也可用甘油或乳糖溶劑作懸浮劑，在-70℃冰箱或液氮中保存孢子懸浮液和營(yíng)養(yǎng)菌絲體。27.3青霉素生產(chǎn)工藝HNONSCH3CH3HCOO-Hβ-內(nèi)酰胺環(huán)R青霉素類的基本結(jié)構(gòu)：由母核6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanicacid,6-APA)及側(cè)鏈組成，側(cè)鏈不同形成不同青霉素，抗菌能力不同6-APA是由一個(gè)噻唑環(huán)(A)連結(jié)β-內(nèi)酰胺環(huán)(B)組成BA青霉素的分類青霉素G類:如青霉素G鉀、青霉素G鈉、長(zhǎng)效西林等.青霉素V類:(別名苯氧甲基青霉素、６Ｇ苯氧乙酰胺基青霉烷酸)如青霉素V鉀等.耐酶青霉素:如苯唑青霉素(新青Ⅱ號(hào))、氯唑青霉素等.廣譜青霉素:如氨芐西林、阿莫西林等.抗綠膿桿菌的廣譜青霉素:如羧芐西林、哌拉西林鈉、呋芐青霉素等.氮咪青霉素:如美西林及其酯匹美西林等,其特點(diǎn)為較耐酶,對(duì)某些陰性桿菌(如大腸桿菌、克雷伯菌和沙門菌)有效,但對(duì)綠膿桿菌效果差.青霉素生產(chǎn)流程冷凍干燥孢子→瓊脂斜面→米孢子→種子罐（一、二級(jí))→發(fā)酵罐→預(yù)處理→過(guò)濾→乙酸丁酯萃取→蒸發(fā)（脫水脫色）→結(jié)晶→工業(yè)鹽→綜合利用27.3.1菌種：產(chǎn)黃青霉（(Penicillium

chrysogenum)產(chǎn)綠色、黃色孢子）生長(zhǎng)發(fā)育分7個(gè)階段：Ⅰ期：分生孢子萌發(fā)；Ⅱ期：菌絲繁殖；Ⅲ期：脂肪粒形成；Ⅳ期：脂肪粒減少，中、小空孢Ⅴ期：形成大空孢，脂肪粒消失；Ⅵ~Ⅶ期：細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有顆粒，菌絲體自溶。Ⅰ—Ⅳ期：菌絲生長(zhǎng)期，Ⅲ期適宜做發(fā)酵種子；Ⅳ—Ⅴ期：青霉素分泌期；Ⅵ期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵種子制備階段以生產(chǎn)豐富的孢子（斜面和米孢子培養(yǎng)）或大量健壯的菌絲體(種子罐培養(yǎng))為目的所以，要在培養(yǎng)基中加入豐富的、容易代謝的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米漿）、緩沖pH的碳酸鈣以及生長(zhǎng)所必需的無(wú)機(jī)鹽，并保持最適生長(zhǎng)溫度（25~26℃）和充分通氣、攪拌。種子制備的培養(yǎng)條件及原材料質(zhì)量均應(yīng)嚴(yán)格控制以保持種子質(zhì)量的穩(wěn)定性。27.3.2培養(yǎng)基：

碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等；淀粉水解糖。通常采用葡萄糖和乳糖。發(fā)酵初期，利用葡萄糖使菌絲快速生長(zhǎng)；當(dāng)葡萄糖耗竭后，利用乳糖，分泌青霉素。氮源：玉米漿、花生餅、棉籽餅、麩皮粉，氯化銨、硫酸銨、硝酸銨。前體：苯乙酸或苯乙酰胺；多次流加，每次﹤0.1％無(wú)機(jī)鹽：S、P、Ga、Mg、K等。

鐵離子有害，控制在﹤30μg/ml。27.3.3發(fā)酵工藝過(guò)程（1）生產(chǎn)孢子的制備保藏的孢子→活化（25~26℃，6~8d）→獲得單菌落（25~26℃，7d）→獲得斜面孢子→制得小米或大米孢子（優(yōu)質(zhì)小米或大米固體培養(yǎng)基25℃，7d）每批孢子必須進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況.（2）種子罐和發(fā)酵罐培養(yǎng)工藝青霉素生產(chǎn)采用三級(jí)發(fā)酵。一級(jí)種子培養(yǎng)：接種小米孢子→萌發(fā)形成菌絲。培養(yǎng)基成分為葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米漿、碳酸鈣、玉米油、消沫劑等。通無(wú)菌空氣，空氣流量1:3(V/V)，300~350r/min;培養(yǎng)時(shí)間40~50h;pH自然，溫度,27℃±1℃。二級(jí)種子培養(yǎng)：菌絲體大量繁殖。培養(yǎng)基成分為玉米漿、葡萄糖等。通無(wú)菌空氣，空氣流量1:(1~1.5)(V/V)，250~280r/min、pH自然，25℃±1℃，培養(yǎng)時(shí)間10~14h。三級(jí)發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基為花生餅粉(高溫)、麩皮、玉米漿、葡萄糖、尿素、硫酸銨、硫酸鈉、硫代硫酸鈉、磷酸二氫鈉、苯乙酰胺、碳酸鈣及消泡劑等。接種量為12%~15%。青霉素的發(fā)酵對(duì)溶氧要求極高，通氣量偏大，通氣比控制1:(0.7~1.8)(V/V)，150~200r/min;100m3的發(fā)酵罐攪拌功率為200~300kW,罐壓控制0.04~0.05MPa,25~26℃下培養(yǎng)。前60h,pH5.7~6.3，溫度26℃，以后pH6.3~6.6;溫度24℃，發(fā)酵周期為200h左右。27.3.4發(fā)酵條件控制補(bǔ)糖：殘?zhí)墙抵?.6％、pH上升時(shí)開始加糖；補(bǔ)氮：發(fā)酵液氨態(tài)氮0.01~0.05％，補(bǔ)硫銨、氨水或尿素補(bǔ)前體：發(fā)酵液中殘存乙酰胺0.05~0.08%；pH控制：前期pH

5.7~6.3，中后期6.3~6.6,通過(guò)進(jìn)行調(diào)節(jié)通過(guò)加糖、加酸、加堿補(bǔ)加氨水調(diào)節(jié)；溫度控制：前期，25~26℃；后期，23℃；通風(fēng)比：1:0.8vvm(單位培養(yǎng)液體積在單位時(shí)間內(nèi)通入的空氣量)溶氧：發(fā)酵液中的溶氧≥氧飽和溶解度的30％；消沫劑：添加玉米油、豆油或化學(xué)消沫劑”泡敵”，少量多次。27.3.5青霉素的分離純化（1）預(yù)處理：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。（2）過(guò)濾：加入絮凝劑→轉(zhuǎn)鼓式真空：吸濾、洗滌、吸洗液、刮除濾餅。除掉菌絲體及部分蛋白質(zhì)。（3）萃?。喝苊捷腿》?，二級(jí)逆流工藝或二級(jí)順流工藝；青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。工業(yè)上通常用乙酸丁酯和戊酯，萃取2~3次，濃縮10倍，濃度幾乎達(dá)到結(jié)晶要求。

（4）脫色：加活性碳150-200g/10億單位；（5）精制：乙酸丁酯萃取液用0.5mol/L氫氧化鈉萃取→調(diào)pH6.4~6.8→得青霉素鈉鹽濃縮液（5萬(wàn)單位/ml）→加3~4倍體積的丁醇，16~26℃,5~110mmHg下真空蒸餾，將水、丁醇共沸物蒸發(fā)出去→濃縮到青霉素鈉鹽濃縮液的體積、蒸出餾分中含水量為2~4%時(shí)，停止蒸餾→青霉素鈉鹽結(jié)晶析出→過(guò)濾→洗滌得到成品（6）溶媒回收：各種有機(jī)溶劑回收，以降低成本、減少環(huán)境污染第28章氨基酸生產(chǎn)工藝28.1概述氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，在自然界已發(fā)現(xiàn)組成各種蛋白質(zhì)的氨基酸有二十多種，其中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸八種氨基酸是人類本身不能合成的必需氨基酸，只能從食物中攝取。氨基酸在食品、醫(yī)藥、飼料、化工、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。氨基酸的生產(chǎn)方法主要有抽提法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶法四種。到目前為止，60％以上的氨基酸采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，其中產(chǎn)量最大的是谷氨酸，其次是賴氨酸。氨基酸的生產(chǎn)方法抽提法：將蛋白質(zhì)原料進(jìn)行水解，然后從水解液中抽提氨基酸，是生產(chǎn)氨基酸最早采用的方法。水解方法有酸法水解、堿法水解和酶法水解。目前胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用抽提法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法：用化學(xué)合成的方法制造氨基酸。目前用化學(xué)合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。微生物發(fā)酵法：是目前氨基酸生產(chǎn)最常用的方法。根據(jù)微生物本身具有合成氨基酸的能力的特點(diǎn)，通過(guò)菌株的篩選、誘變處理及代謝調(diào)節(jié)來(lái)達(dá)到合成某種氨基酸的目的。發(fā)酵法分為直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶進(jìn)行生物催化反應(yīng)制造氨基酸的方法。賴氨酸、色氨酸、天門冬氨酸、酪氨酸、丙氨酸等均可用酶法生產(chǎn)。采用固定化酶或細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)，其優(yōu)點(diǎn)更突出。28.2氨基酸發(fā)酵工藝控制28.2.1菌種：氨基酸發(fā)酵的菌種主要有谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、短芽孢桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌等。下頁(yè)為一些氨基酸生產(chǎn)菌種及用途。28.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基一般都包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水等成分。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與配比是決定氨基酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)、代謝的主要因素，與氨基酸的產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率及收率的關(guān)系密切。一些氨基酸的生產(chǎn)菌種及用途氨基酸生產(chǎn)菌種用途谷氨酸棒桿菌Asl.299、棒桿菌7338、鈍齒棒桿菌Asl.542、棒桿菌Dll0、棒桿菌S-914、黃色短桿菌T6-13、黃色短桿菌FM84-415等主要用作制造味精，也用于預(yù)防或治療肝昏迷，對(duì)于腦震蕩和腦神經(jīng)損傷也有一定的療效L-賴氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、短芽孢桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌它是人類和動(dòng)物發(fā)育必需的氨基酸，飼料添加劑，食品保鮮劑，制備復(fù)方氨基酸輸液等藥物L(fēng)-谷氨酰胺谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、嗜氨小桿菌等治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍等L-脯氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、粘質(zhì)賽氏桿菌配制氨基酸輸液，合成抗高血壓藥物和治療帕金森氏癥的多肽類藥物，食品工業(yè)的甜味劑L-精氨酸粘質(zhì)沙雷氏桿菌、鈍齒棒桿菌等合成蛋白質(zhì)和肌酸的重要原料L-天門冬氨酸黃色短桿菌、大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等生產(chǎn)甜味肽的主要原料L-蘇氨酸大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、黏質(zhì)賽氏桿菌等的基因工程菌飼料添加劑，氨基酸營(yíng)養(yǎng)液原料L-蛋氨酸主要為酶法，發(fā)酵法尚在研究中有抗脂肪肝和解毒作用，藥物或食品強(qiáng)化劑，飼料添加劑L-色氨酸枯草桿菌、黃桿菌、枯草桿菌、基因工程菌等食品強(qiáng)化劑，飼料添加劑L-苯丙氨酸大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌等的變異株生產(chǎn)甜味肽L-酪氨酸產(chǎn)氣克雷氏菌的重組株、草剩歐文氏菌合成L-多巴等L-絲氨酸嗜甘氨酸棒狀桿菌、基因工程菌食品、藥品、化妝品的添加劑L-半胱氨酸球形芽孢桿菌食品、藥品、化妝品的添加劑L-纈氨酸乙酸鈣不動(dòng)桿菌等藥物，食品強(qiáng)化劑L-亮氨酸谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌配制復(fù)合氨基酸輸液L-組氨酸基因工程菌生化試劑、藥物（1）碳源氨基酸發(fā)酵中可采用淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴等多種碳源。根據(jù)微生物菌種的性質(zhì)、氨基酸種類和發(fā)酵工藝方法，選擇碳源種類和濃度。最常采用的是淀粉水解糖液或糖蜜。（2）氮源

氨基酸發(fā)酵培養(yǎng)基常選用銨鹽、尿素、氨水等為無(wú)機(jī)氮源。幾乎所有的氨基酸產(chǎn)生菌都是生物素缺陷型，同時(shí)也是一些氨基酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，而且大多數(shù)氨基酸產(chǎn)生菌都不能分泌胞外水解蛋白酶。因此需要添加適量的有機(jī)氮源如玉米槳及精制棉籽餅、麩皮、豆餅等蛋白質(zhì)原料的水解液。（3）碳氮比

氨基酸發(fā)酵時(shí)，不僅菌體生長(zhǎng)和氨基酸合成需要氮源，而且氮源還用來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值。例如谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:(15~21)，當(dāng)碳氮比為100:11時(shí)才開始積累谷氨酸，因此發(fā)酵培養(yǎng)基氮源的需要量比一般發(fā)酵多。谷氨酸發(fā)酵消耗的氮源中，合成菌體用的氮源占總氮的3~6％，合成谷氨酸的氮源占30~80％。實(shí)際生產(chǎn)中，以尿素或氨水為氮源時(shí)，除了一部分用于調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值外，還有一部分隨空氣逸出，為此氮源的用量更大。谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中當(dāng)糖濃度為12.5％、總尿素量為3％時(shí)，碳氮比為100:28。氮源的用量對(duì)氨基酸生物合成產(chǎn)生顯著的影響，如谷氨酸發(fā)酵中，適量的NH4+可減少α-酮戊二酸的積累，促進(jìn)谷氨酸的合成；過(guò)量的NH4+會(huì)使生成的谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺。（4）無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中通常需要加入硫、磷、鈣、鎂、鉀等無(wú)機(jī)鹽類。磷酸鹽濃度對(duì)于氨基酸發(fā)酵的影響極為顯著。而鎂、鉀等離子是許多酶的激活劑，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和氨基酸的積累有重要的作用。（5）生長(zhǎng)因子

生物素是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中重要的生長(zhǎng)因子。影響細(xì)胞膜的通透性和代謝途徑，它的濃度與微生物菌體的生長(zhǎng)和氨基酸的合成關(guān)系密切。以淀粉水解糖為原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，必須控制生物素的濃度為亞適量，以2~5μg/L為宜（實(shí)際上是控制玉米漿的濃度），保證菌體細(xì)胞膜的通透性良好，谷氨酸才能大量分泌。在天門冬氨酸族氨基酸（如賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸等）的發(fā)酵中期望菌體細(xì)胞膜完整，要求控制生物素過(guò)量，如賴氨酸發(fā)酵中添加過(guò)量的生物素（200~500μg/L），賴氨酸合成顯著增加。氨基酸發(fā)酵一般以玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作為生物素的來(lái)源。28.2.3發(fā)酵條件控制（1）pH值對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及控制

pH值影響酶的活性和菌的代謝；谷氨酸發(fā)酵中，在中性和微堿性條件下（pH7.0~8.0）積累谷氨酸，在酸性條件下（pH5.0~5.8），則易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。發(fā)酵前期pH值偏高對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，糖耗慢、發(fā)酵周期延長(zhǎng)；反之，pH值偏低則菌體生長(zhǎng)旺盛，糖耗快，不利于谷氨酸合成。但發(fā)酵前期pH值偏高（pH7.5~8.0）對(duì)抑制雜菌有利，故控制發(fā)酵前期的pH值以7.5左右為宜。由于谷氨酸脫氫酶的最適pH值為7.0~7.2，氨基轉(zhuǎn)移酶的最適pH值為7.2~7.4，因此控制發(fā)酵中后期的pH值為7.2左右。生產(chǎn)上控制pH值的方法一般有兩種，流加尿素和流加氨水（少量多次，可使pH值較穩(wěn)定）。流加尿素的數(shù)量和時(shí)間主要根據(jù)pH值變化、菌體生長(zhǎng)、糖耗情況和發(fā)酵時(shí)期等因素來(lái)決定。如當(dāng)菌體生長(zhǎng)和糖耗均緩慢時(shí)，要少量多次地流加尿素、避免pH值過(guò)高而影響菌體生長(zhǎng)；菌體生長(zhǎng)和糖耗均較快時(shí)，流加尿素可多些，使pH值適當(dāng)高些，以抑制生長(zhǎng)；發(fā)酵后期殘?zhí)呛苌?，接近放罐時(shí)應(yīng)盡量少加或不加尿素，以免造成浪費(fèi)和增加氨基酸提取難度。不同的氨基酸發(fā)酵對(duì)pH的要求見(jiàn)下頁(yè)表不同氨基酸發(fā)酵的最適pH和溶解氧分壓氨基酸最適pH溶解氧分壓（105Pa）谷氨酰胺6.50≥0.01脯氨酸7.00≥0.01精氨酸7.00≥0.01谷氨酸7.80≥0.01賴氨酸7.00≥0.01蘇氨酸7.00≥0.01異亮氨酸7.00≥0.01亮氨酸6.25≈0纈氨酸6.50≈0苯丙氨酸7.25≈0（2）溫度對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及控制氨基酸發(fā)酵的最適溫度因菌種和所生產(chǎn)的氨基酸種類不同而異。氨基酸發(fā)酵一般屬于Gaden分類的Ⅱ型即生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型發(fā)酵，菌體生長(zhǎng)到一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸。菌體生長(zhǎng)最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。如谷氨酸發(fā)酵，菌體生長(zhǎng)最適溫度為30~32℃，谷氨酸合成的最適溫度為34~37℃。如果菌體生長(zhǎng)階段溫度過(guò)高，則菌體易衰老；在發(fā)酵中后期，菌體生長(zhǎng)已基本停止，需要維持最適的產(chǎn)酸溫度，以利谷氨酸的合成。（3）溶氧對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及控制不同的氨基酸發(fā)酵對(duì)溶氧的要求不同多數(shù)氨基酸發(fā)酵是在供氧充足的條件下進(jìn)行的，如谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸等；也有一些氨基酸的發(fā)酵過(guò)程需要限制供氧，如亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸等發(fā)酵適宜在缺氧條件下進(jìn)行，只有當(dāng)菌體呼吸在一定程度上受阻時(shí)才最適合這些氨基酸的生產(chǎn)；而賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸等的發(fā)酵需氧量介于上述兩者之間。發(fā)酵的不同階段氧分壓的要求也是不同的，因此在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)根據(jù)具體情況對(duì)供氧進(jìn)行控制。（4）泡沫的控制發(fā)酵過(guò)程中通常產(chǎn)生大量的泡沫，可采用豆油、玉米油等天然油脂或環(huán)氧丙烯、環(huán)氧乙烯、聚醚類等化學(xué)消泡劑進(jìn)行消泡。并控制消泡劑的用量和加入的時(shí)間與方法，否則影響菌體的代謝和產(chǎn)物的提取。28.3氨基酸分離純化氨基酸的分離和純化又稱為氨基酸發(fā)酵液的后處理或下游工程（downstreamprocessing），是氨基酸工業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)重要組成部分。發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸的發(fā)酵液是極其復(fù)雜的多相體系，含有微生物菌體細(xì)胞、代謝產(chǎn)物、未消耗盡的培養(yǎng)基等，因此要提取高純度的氨基酸。氨基酸的分離純化：對(duì)氨基酸發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理→菌體分離→初步純化→高度純化等步驟。前三步驟稱為分離（或提?。禾幚淼捏w積較大，著重于分離和濃縮；高度純化稱為純化（或精制）：精細(xì)的分離操作，著重于純化。菌體分離(離心分離、過(guò)濾、壓濾、超濾等)預(yù)處理（加熱、調(diào)pH、絮凝等）發(fā)酵液初步純化（沉淀、吸附、離子交換、萃取等）高度純化(超濾、吸附、結(jié)晶、重結(jié)晶等)成品加工氨基酸的分離純化工藝流程28.4賴氨酸生產(chǎn)工藝賴氨酸是人體必需的8種氨基酸之一，人和高等動(dòng)物體內(nèi)不能合成。自1960年日本用谷氨酸棒狀桿菌的高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸獲得成功后，微生物發(fā)酵法成為生產(chǎn)賴氨酸的主要方法。賴氨酸有L型和D型２種構(gòu)型。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的均為L(zhǎng)型。28.4.1賴氨酸的生產(chǎn)菌種與生物合成途徑（1）細(xì)菌：如短桿菌屬（黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌）和棒狀桿菌屬（谷氨酸棒狀桿菌）。它們多以谷氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，通過(guò)人工誘變獲得各種突變株（高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型兼AEC抗性突變株）。（2）酵母菌：如產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母。酵母菌賴氨酸的生物合成產(chǎn)率要低于細(xì)菌的，目前賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)都是以細(xì)菌為生產(chǎn)菌種。賴氨酸合成途徑（1）二氨基庚二酸途徑：存在于細(xì)菌、綠藻、原生動(dòng)物和高等植物中；P329圖28-2（2）α-氨基己二酸途徑：存在于酵母、霉菌中。P329圖28-328.4.2賴氨酸的發(fā)酵條件控制賴氨酸生產(chǎn)菌多以谷氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株，通過(guò)選育高絲氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗賴氨酸結(jié)構(gòu)類似物(AECr)、抗蘇氨酸結(jié)構(gòu)類似物(AHVr)的突變株，以解除自身的代謝調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。賴氨酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵?？刂婆囵B(yǎng)物中的生物素、L-氨酸和L-甲硫氨酸的含量、溫度、pH、溶解氧（通風(fēng)量、攪拌速度）等條件，賴氨酸大量積累。賴氨酸發(fā)酵時(shí)間以16~20h為界，分為前、后兩個(gè)時(shí)期。前期（生長(zhǎng)期）：菌體增殖迅速，有少量賴氨酸生成，糖和氮的消耗主要是用于合成細(xì)胞物質(zhì)及供給菌體的能量代謝；后期（賴氨酸合成期），菌體生長(zhǎng)速度明顯減慢，L-賴氨酸大量積累，糖和氮消耗主要用于L-賴氨酸的合成。兩個(gè)階段在工藝控制上是不同的。（1）溫度對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響及控制在低于20℃時(shí)，氨基酸合成途徑的終產(chǎn)物對(duì)第一步反應(yīng)的酶的反饋抑制作用比在正常生長(zhǎng)溫度下更大。發(fā)酵前期，溫度控制在30~32℃，如果溫度過(guò)高，菌體容易衰老，發(fā)酵液的OD值增長(zhǎng)緩慢、耗糖慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)，賴氨酸產(chǎn)量減少。發(fā)酵中、后期產(chǎn)酸階段，溫度可提高至賴氨酸生物合成酶系的最適作用溫度32~34℃。根據(jù)菌種，發(fā)酵過(guò)程可采用二級(jí)或三級(jí)溫度管理（2）pH對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響及控制pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物形成的影響賴氨酸發(fā)酵的最適pH為6.5~7.0，一般控制在6.5~7.5，在發(fā)酵過(guò)程控制pH平穩(wěn)。賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的pH下降，可以通過(guò)流加氨水或尿素來(lái)控制，也可加入CaCO3來(lái)維持。賴氨酸發(fā)酵中，流加尿素容易調(diào)節(jié)pH，初始尿素濃度一般為0.5％~0.6％。接種2~3h后，菌體內(nèi)脲酶分解尿素釋放氨使pH上升；隨著菌體的生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中氨與碳源被利用，生成有機(jī)酸等中間代謝產(chǎn)物而使pH下降。當(dāng)培養(yǎng)至14~18h,pH降至6.2~6.4時(shí)開始流加尿素，流加量為,0.2％~0.3％。發(fā)酵整個(gè)過(guò)程中共流加3~5次尿素，總量為,1.5％~2.5％。產(chǎn)酸旺盛期流加量大些；發(fā)酵后期殘?zhí)橇康蜁r(shí)少量流加。當(dāng)殘?zhí)橇康陀?％時(shí)就不必流加尿素。（3）供氧對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響及控制只有在供氧充足的條件下,才大量生成賴氨酸。供氧不足時(shí)影響菌體的生長(zhǎng)，使賴氨酸產(chǎn)量降低；嚴(yán)重供氧不足，賴氨酸產(chǎn)量很少而積累乳酸。菌體生長(zhǎng)階段,對(duì)氧的需求量大于產(chǎn)酸階段，溶氧分壓一般控制在0.4×104~0.8×104Pa。若此時(shí)通氣和攪拌強(qiáng)度低，氧供給不足，乳酸生成量增加，造成培養(yǎng)基pH低，菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體量減少。即使在產(chǎn)酸階段增大通氣量，也無(wú)法彌補(bǔ)對(duì)賴氨酸產(chǎn)量的影響。通氣攪拌強(qiáng)度過(guò)高，會(huì)造成pH高，耗糖快,同樣也會(huì)出現(xiàn)菌體生長(zhǎng)緩慢的現(xiàn)象，降低賴氨酸的產(chǎn)量。當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期以后，溶氧分壓控制在0.2×104~0.4×104Pa，直至發(fā)酵結(jié)束。（4）生物素對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響生產(chǎn)菌：谷氨酸產(chǎn)生菌的各種突變株，均為生物素缺陷型。發(fā)酵培養(yǎng)基中需要生物素作為生長(zhǎng)因子。以葡萄糖、丙酮酸為唯一碳源時(shí)，添加過(guò)量生物素(200~500μg/L)可使賴氨酸的積累顯著增加。過(guò)量生物素使細(xì)胞內(nèi)合成的谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶的反饋抑制作用增強(qiáng)，抑制谷氨酸的大量生成，使代謝流向合成天冬氨酸的方向進(jìn)行。因此生物素有促進(jìn)草酰乙酸生成,增加天冬氨酸供給，提高賴氨酸產(chǎn)量的作用。（5）蘇氨酸、蛋氨酸對(duì)賴氨酸影響及控制蘇氨酸和蛋氨酸是賴氨酸生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)因子。賴氨酸生產(chǎn)菌缺乏蛋白質(zhì)分解酶。不能直接分解蛋白質(zhì)，只能將有機(jī)氮源水解后才能利用。大豆餅粉、花生餅粉和毛發(fā)水解液通常作為賴氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基中的蘇氨酸和蛋氨酸豐富，就會(huì)出現(xiàn)只長(zhǎng)菌，而不產(chǎn)或少產(chǎn)賴氨酸的現(xiàn)象，所以要控制其亞適量，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到一定時(shí)間后，轉(zhuǎn)入產(chǎn)酸期。（6）前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑對(duì)賴氨酸發(fā)酵的影響在賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中，添加某些物質(zhì)可以提高賴氨酸的產(chǎn)量。如谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)賴氨酸時(shí)，添加與不添加胱氨酸發(fā)酵液，賴氨酸的產(chǎn)量分別為55g/L、40g/L。28.5谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝谷氨酸是一種重要的氨基酸。味精——谷氨酸單鈉谷氨酸還可以制成對(duì)皮膚無(wú)刺激性的洗滌劑——十二烷基谷氨酸鈉肥皂、能保持皮膚濕潤(rùn)的潤(rùn)膚劑——焦谷氨酸鈉、質(zhì)量接近天然皮革的聚谷氨酸人造革，以及人造纖維和涂料等。谷氨酸是目前氨基酸生產(chǎn)中產(chǎn)量最大的一種，谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝也是氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中最典型和最成熟的。谷氨酸的生物合成途徑包括糖酵解作用（EMP途徑）戊糖磷酸途徑（HMP途徑）三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）乙醛酸循環(huán)(DCA途徑)丙酮酸羧化支路（CO2固定）28.5.1谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的原料谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)以淀粉水解糖為原料。淀粉水解糖的制備一般有酸水解法和酶水解法。水解糖液要求①糖液中還原糖的含量要達(dá)到發(fā)酵用糖的標(biāo)準(zhǔn)。②糖液潔凈、杏黃色或黃綠色，有一定的透光度。③糖液中不含糊精。④糖液不能變質(zhì)。28.5.2谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的菌種主要有棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬及節(jié)桿菌屬的細(xì)菌。除節(jié)桿菌外，其他三屬中有許多菌種適用于糖質(zhì)原料的谷氨酸發(fā)酵。這些細(xì)菌都是需氧微生物，都需要以生物素為生長(zhǎng)因子。我國(guó)所用菌種：北京棒狀桿菌ASl.299、鈍齒棒狀桿菌ASl.542、HU7251及7338、B9等。在正常情況下谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率可達(dá)4%~6%，谷氨酸對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率為40%~50%。菌種擴(kuò)大培養(yǎng)（1）斜面培養(yǎng)：一般采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，pH7.0～7.2，32℃培養(yǎng)18～24h，冰箱保存。（2）一級(jí)種子培養(yǎng)：采用液體培養(yǎng)基，由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳等組成，pH為6.5～6.8，在三角瓶?jī)?nèi)32℃振蕩培養(yǎng)12h，貯存于4℃冰箱。（3）二級(jí)種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基除用水解糖代替葡萄糖外，其他與一級(jí)種子培養(yǎng)基相仿。在種子罐內(nèi)32℃通氣攪拌培養(yǎng)7～10h，即可移種或冷卻至10℃?zhèn)溆谩７N子的質(zhì)量要求

鏡檢：菌體健壯，排列整齊，大小均一，呈單個(gè)或八字形排列。染色性：革蘭氏陽(yáng)性。二級(jí)種子的活菌濃度要求達(dá)到108~109個(gè)/ml。種子活力旺盛平板檢查：菌落淡黃色，中間隆起，表面濕潤(rùn)，有光澤，邊緣整齊，呈半透明狀。小搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)酸穩(wěn)定并在高峰。28.5.3谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵初期：菌體生長(zhǎng)遲滯，約2～4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，代謝旺盛，糖耗快，這時(shí)必須流加尿素以供給氮源并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH至7.5～8.0，溫度為30～32℃。此階段主要是菌體生長(zhǎng)，幾乎不產(chǎn)酸，菌體內(nèi)生物素含量由豐富轉(zhuǎn)為貧乏，時(shí)間約12h。發(fā)酵中期：進(jìn)入谷氨酸合成階段，此時(shí)菌體濃度基本不變，糖與尿素分解后產(chǎn)生的。ａ-酮戊二酸和氨主要用來(lái)合成谷氨酸。這一階段應(yīng)及時(shí)流加尿素提供氨以維持谷氨酸合成的最適pH7.2～7.4，需要大量通氣，并將溫度提高到谷氨酸合成的最適溫度34～37℃。發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?，需減少流加尿素量。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡、谷氨酸濃度不再增加時(shí)，及時(shí)放罐。發(fā)酵周期約為30h。28.5.4谷氨酸發(fā)酵條件的控制溫度：生長(zhǎng)30~32℃；產(chǎn)酸34~37℃pH值：發(fā)酵前期pH7.5左右；發(fā)酵中、后期pH7.2左右菌齡及接種量：接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的種子；接種量一般為１％。通風(fēng)量與攪拌速度：菌體生長(zhǎng)期小通風(fēng)、谷氨酸產(chǎn)生期加大通氣量；磷酸鹽：濃度不能太高，否則向纈氨酸發(fā)酵谷氨基酸發(fā)酵的代謝控制環(huán)境因子發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)換溶解氧乳酸或琥珀酸←→谷氨酸←→α－酮戊二酸（通氣不足）（適量）（通氣過(guò)量，轉(zhuǎn)速過(guò)快）氨離子

α－酮戊二酸←→谷氨酸←→谷氨酰胺（缺乏）（適量）（過(guò)量）pH谷氨酰胺，N－乙酰谷酰胺←→谷氨酸（pH值5～8，氨離子過(guò)多）（中性或微堿性）磷酸纈氨酸←→谷氨酸（高濃度磷酸鹽）（磷酸鹽適量）生物素乳酸或琥珀酸←→谷氨酸（過(guò)量）（限量）生物素、氯化銨、醇類、脯氨酸←→谷氨酸(正常條件生物素亞適量）（生物素50～100ug/l,氯化銨6％，乙醇1.5~2%)提高谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)率的措施（1）選育高產(chǎn)菌種

–菌體自發(fā)突變；物理化學(xué)誘變；體外DNA重組、原生質(zhì)體融合等。

–高產(chǎn)菌株應(yīng)具有的特點(diǎn)：①喪失α-酮戊二酸脫氫酶的氧化能力；②谷氨酸脫氫酶活力高；③氧化還原氨基化反應(yīng)強(qiáng)；④CO2固定反應(yīng)強(qiáng)；⑤異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)；⑥不分解和利用谷氨酸；⑦耐高糖、高濃度的谷氨酸。（2）根據(jù)菌種特性控制最適宜的發(fā)酵條件（3）追加糖化法低糖濃度、大接種量使菌體迅速生長(zhǎng)，發(fā)酵期追加糖，維持一定的糖濃度，加大產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率。谷氨酸發(fā)酵污染噬菌體后的異?，F(xiàn)象①發(fā)酵液OD值在初期開始上升，而后又下降或不上升。②發(fā)酵液pH逐漸上升，4～8h內(nèi)可達(dá)8.0以上，且不下降。③不耗糖或耗糖緩慢。④泡沫大、黏度大、有時(shí)成膠狀；可拔絲。⑤發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酸低或不產(chǎn)酸。⑥鏡檢時(shí)，菌體減少，缺少八字排列，菌體變胖，革蘭氏染色呈紅色片狀。嚴(yán)重時(shí)呈網(wǎng)狀或魚翅狀，幾乎看不到完整細(xì)胞。⑦發(fā)酵中后期，周期稍延長(zhǎng)，溫度緩慢升，谷氨酸產(chǎn)量有所提高(菌體破裂時(shí)放出谷氨酸所致)。⑧平板檢查時(shí)有噬菌斑。搖瓶發(fā)酵發(fā)酵液稀而清。⑨發(fā)酵液殘?zhí)歉摺㈩伾珳?/p>