瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)復(fù)習(xí)進(jìn)程

瘧原蟲(chóng)檢驗(yàn)技術(shù)內(nèi)容提綱血片制作與染色瘧原蟲(chóng)計(jì)數(shù)瘧原蟲(chóng)的基本形態(tài)特征血片制作第一步：載玻片的清洗用加有洗潔精或洗衣粉的熱水洗滌，清水沖洗后涼干，浸于95%的乙醇中1小時(shí)以上用綢布擦干置干燥環(huán)境中保存。第二步：患都信息的核實(shí)采集血樣涂片時(shí)，首先要核對(duì)患者的姓名和年齡并在玻片的右側(cè)編號(hào)第三步：采集血樣采血部位：耳垂或無(wú)名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無(wú)名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過(guò)深或過(guò)淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小,薄血膜血量為厚血膜的一半或1/3。厚血膜用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)2~4圈，涂成直徑0.8~1厘米大小圓形厚血膜薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將推片的邊緣緊貼載玻片，輕輕上下移動(dòng)，使血液沿邊緣散開(kāi)，然后勻速地向前推進(jìn)，形成薄而平鋪的薄血膜第四步：血片制作厚血膜薄血膜制片過(guò)程圖示標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片標(biāo)簽●厚血膜血量不宜過(guò)多或過(guò)少●薄血膜平整,無(wú)皺折和空泡.顯微鏡下紅細(xì)胞單層排列血片的制作×××××√血片制作影響因素載玻片必須清潔無(wú)油污，理想的薄血膜是一層血細(xì)胞均勻分布不重疊、無(wú)裂縫、無(wú)皺折和空泡，血膜末端呈舌狀；厚血膜厚度以一個(gè)油鏡視野內(nèi)可見(jiàn)5-10個(gè)白細(xì)胞為宜；血片制作場(chǎng)所要保持清潔，以免塵埃沾污血膜，防止蒼蠅等舔食血膜；制成的血片在未干前不能傾斜放置，待其自然干燥，不要加熱，加熱會(huì)使原蟲(chóng)變形，影響鏡檢結(jié)果．血片染色

兩種染色方法:●吉氏染色法

1.染色原液配制2.門診快染、慢染

3.成批染色和溶血染色●

瑞氏染色法WHO推薦使用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置

吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(純)250ml甲醇

(純)250ml●吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨,

然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動(dòng)數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過(guò)濾即可使用。保存時(shí)間越長(zhǎng)染色效果越好?！裾麄€(gè)染色液配制時(shí)間不能少于5個(gè)小時(shí)血片的染色染色用水和沖洗用水配制常用中性的蒸餾水或經(jīng)煮沸過(guò)濾的冷開(kāi)水用pH7.0～pH7.2的緩沖液。血片染色薄血膜的固定厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要點(diǎn)：甲醇不能觸碰到厚血膜）操作1（快染）量筒內(nèi)量2ml緩沖液(PBSPH7.0)或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水緩緩沖洗，晾干（血膜朝內(nèi)面）鏡檢。操作2(慢染)量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色30min。清水緩緩沖洗，晾干鏡檢。血片染色將已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒(méi)血片，染色30分鐘。（如染液稀釋液不合標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得酌情增減染色時(shí)間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將染色片插于晾干板上晾干，包裝，待鏡檢。成批血片染色厚血膜溶血染色放置多時(shí)未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，須在厚血膜上用清水進(jìn)行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分鐘。然后用清水漂洗干凈,晾干。質(zhì)量好的染色

顯微鏡下核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色，薄血膜平整，紅細(xì)胞單層排列

如果血片偏紅,說(shuō)明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說(shuō)明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片偏酸偏堿標(biāo)準(zhǔn)配置完吉氏原液時(shí)必須過(guò)濾除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量；染液稀釋后使用時(shí)間：原液必須臨用時(shí)稀釋，隨配隨用；染液的稀釋濃度；染色時(shí)間。染色質(zhì)量影響因素用水過(guò)酸，可致感染的RBC上的點(diǎn)彩染不出來(lái)；用水過(guò)堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍(lán)色，致使R的胞漿難以辨論。染色稀釋用水:PH7.0-7.2清潔水。染色質(zhì)量影響因素固定薄血膜時(shí)不要將甲醇觸碰到厚血膜；血膜在制備后應(yīng)盡量能在當(dāng)天染色，一般夏天不超過(guò)48小時(shí)，冬天也不能超過(guò)72小時(shí),放置時(shí)間越久，厚血膜越不易脫血，染色效果也差。染色質(zhì)量影響因素瘧原蟲(chóng)鏡檢●瘧原蟲(chóng)厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)●瘧原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)方法●人體四種瘧原蟲(chóng)的形態(tài)特征●當(dāng)前分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)快速發(fā)展,但是厚薄血片的檢查仍被認(rèn)為是不可替代的確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)”

●顯微鏡檢查是唯一可查到原蟲(chóng)實(shí)體并鑒別4種人體瘧原蟲(chóng)原蟲(chóng)鏡檢---金標(biāo)準(zhǔn)瘧原蟲(chóng)厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)

厚血膜

薄血膜

優(yōu)點(diǎn)血量多，面積小，原蟲(chóng)檢出率高經(jīng)甲醇固定，紅細(xì)胞完整，原蟲(chóng)形態(tài)改變不大，原蟲(chóng)易于辨認(rèn)缺點(diǎn)原蟲(chóng)在干燥過(guò)程中皺縮，紅細(xì)胞消失，原蟲(chóng)變形較大，原蟲(chóng)鑒定困難血量比厚血膜少許多，但面積是厚血膜的8-10倍。檢查費(fèi)時(shí)，原蟲(chóng)檢出率較低用途用于瘧疾病人檢查原蟲(chóng)蟲(chóng)種、蟲(chóng)期鑒定及初學(xué)者教學(xué)標(biāo)本瘧原蟲(chóng)密度計(jì)算計(jì)算瘧原蟲(chóng)密度的三種方法：●白細(xì)胞原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法(厚血膜WHO)

優(yōu)點(diǎn)：可作為定性和定量分析●

半定量計(jì)數(shù)法(厚血膜)

優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：只能定性，不宜作為定量分析●

紅細(xì)胞感染密度計(jì)算法(薄血膜)白細(xì)胞原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法鏡檢厚血膜，按視野順序，記錄200個(gè)白細(xì)胞中的瘧原蟲(chóng)數(shù)，如果原蟲(chóng)密度較低（200個(gè)白細(xì)胞中小于100個(gè)瘧原蟲(chóng)），可增加白細(xì)胞，計(jì)數(shù)500個(gè)。密度單位:原蟲(chóng)數(shù)/μl計(jì)算公式：瘧原蟲(chóng)數(shù)÷計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù)×患者每微升血白細(xì)胞數(shù)=瘧原蟲(chóng)數(shù)/μl血。如果不知患者的白細(xì)胞數(shù)，則每微升血以8000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))。白細(xì)胞原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)法從血膜的左上角開(kāi)始，橫向。計(jì)數(shù)1個(gè)視野后，每次間隔5個(gè)視野,再計(jì)數(shù)。厚血膜×不需要計(jì)數(shù)的視野●需要進(jìn)行白細(xì)胞、瘧原蟲(chóng)計(jì)數(shù)的視野如果該視野無(wú)原蟲(chóng)，則計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)

●看到第一個(gè)原蟲(chóng)開(kāi)始計(jì)數(shù)

白細(xì)胞原蟲(chóng)密度計(jì)數(shù)方法白細(xì)胞瘧原蟲(chóng)計(jì)數(shù)法●例如計(jì)數(shù)200WBC中有135個(gè)瘧原蟲(chóng)，在不知患者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù),由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲(chóng)密度為：135（計(jì)數(shù)的瘧原蟲(chóng)數(shù)）÷200（計(jì)數(shù)的白細(xì)胞）x8000（每微升血白細(xì)胞數(shù)）=5400/μl答：該患者的瘧原蟲(chóng)密度為5400/μl。用厚血膜每個(gè)視野中所觀察到瘧原蟲(chóng)的平均數(shù)粗略地估算出瘧原蟲(chóng)密度。此方法將密度分為6級(jí)：1.全厚血膜查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲(chóng)，記錄“少”3.平均每個(gè)視野1～5個(gè)蟲(chóng)，記錄“＋”4.平均每個(gè)視野6～10個(gè)蟲(chóng)，記錄“++”5.平均每個(gè)視野11～100個(gè)蟲(chóng)，記錄“+++”6.平均每個(gè)視野100個(gè)蟲(chóng)以上，記錄“++++”。

如：PvR+T++S5G少這種方法簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲(chóng)數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。半定量計(jì)數(shù)法如何確定瘧原蟲(chóng)血片為陰性●

檢查全部厚血膜視野未查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)●最少檢查100個(gè)厚血膜視野未查見(jiàn)瘧原蟲(chóng)（臨床病人）人體四種瘧原蟲(chóng)的分布瘧原蟲(chóng)鏡檢感染人的瘧原蟲(chóng)有四種:

惡性瘧原蟲(chóng)P.falciparum間日瘧原蟲(chóng)P.vivax三日瘧原蟲(chóng)P.malariae

卵形瘧原蟲(chóng)P.ovale

惡性瘧P.falciparum

●分布熱帶、亞熱帶，是非洲的重要疾病●我國(guó)流行區(qū)域?yàn)樵颇鲜『秃Ｄ鲜　袼姆N瘧原蟲(chóng)中致病力最強(qiáng)，無(wú)免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時(shí)治療可危及生命（腦型瘧）間日瘧P.vivax

●間日瘧原蟲(chóng)分布于我國(guó)大部分地區(qū),主要是中部地區(qū)●病程良性,有復(fù)發(fā)●遍布全球溫帶地區(qū)及大片熱帶地區(qū)。在熱帶非洲，特別是西非則很少見(jiàn)三日瘧P.malariae

●遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是東、西非洲，圭亞那及印度部分地區(qū)，呈片狀、塊狀分布●三日瘧在我國(guó)非常少見(jiàn)，只在南方廣西有過(guò)散在報(bào)告卵形瘧（蛋形瘧）P.ovale●主要分布非洲。太平洋地區(qū)、緬甸、東南亞有散在報(bào)告●在我國(guó)已基本消滅

原蟲(chóng)鏡檢血細(xì)胞紅細(xì)胞血小板白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）紅細(xì)胞紅細(xì)胞是雙面凹的圓餅狀邊緣較厚，而中間較薄血小板各種血細(xì)胞模式圖

1.紅細(xì)胞

2.嗜酸性粒細(xì)胞

3.嗜堿性粒細(xì)胞

4.中性粒細(xì)胞

5.淋巴細(xì)胞

6.單核細(xì)胞

7.血小板1234567瘧原蟲(chóng)的基本形態(tài)特征瘧原蟲(chóng)基本構(gòu)造為細(xì)胞質(zhì)(胞漿)、核和瘧色素；原蟲(chóng)：經(jīng)吉氏或瑞氏染色：核呈紅色，胞質(zhì)呈蘭色，瘧色素為本色；細(xì)胞漿：藍(lán)色或深藍(lán)色，隨著蟲(chóng)體發(fā)育長(zhǎng)大，細(xì)胞漿逐漸增多；核：呈鮮紅色，呈圓形或橢圓形。核的結(jié)構(gòu)致密，只有在個(gè)別發(fā)育階段較為疏松，例如間日瘧原蟲(chóng)雄配子體的核。核胞漿斑點(diǎn)瘧色素：不著色，顏色和顆粒的形狀，因瘧原蟲(chóng)種類而異，瘧色素在蟲(chóng)體內(nèi)散在分布或聚集成團(tuán)塊。間日瘧原蟲(chóng)：呈短棒狀，黃褐色；惡性瘧原蟲(chóng)：呈細(xì)砂狀，黑褐色；三日瘧原蟲(chóng)：呈砂粒狀，深褐色；卵形瘧原蟲(chóng)：與間日瘧原蟲(chóng)相似。瘧原蟲(chóng)的基本形態(tài)特征瘧色素紅細(xì)胞不漲大環(huán)狀體纖細(xì),常有多重感染，環(huán)狀體內(nèi)可有2個(gè)核環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣除環(huán)狀體，配子體外沒(méi)有其他發(fā)育期配子體呈新月形或臘腸形成熟裂殖體約含16-32個(gè)裂殖子，排列不規(guī)則可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)21.AmemberoftheUNforcesinEastTimor.Presentedwithhightemperature.紅細(xì)胞明顯漲大薛氏點(diǎn)明顯成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足血片中可見(jiàn)各期的原蟲(chóng)形態(tài)成熟裂殖體約含12-24個(gè)裂殖子

間日瘧（P.vivax）鑒定要點(diǎn)2.Intermittentfever;arrivedfromIndia2monthsago.紅細(xì)胞不漲大或略小環(huán)狀體中等大小，核較大，胞漿粗厚胞漿不活躍呈帶狀形成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含6-12個(gè)裂殖子雌雄配子體小于正常紅細(xì)胞，色素呈深褐色常可查見(jiàn)各階段的瘧原蟲(chóng)三日瘧（P.malariae）診斷要點(diǎn)卵形瘧（P.ovale）鑒定要點(diǎn)紅細(xì)胞正常或略漲大

常見(jiàn)慧星狀(也稱齒輪狀)環(huán)粗大薛氏點(diǎn)明顯

成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲(chóng)但更粗大成熟裂殖體約含6-12個(gè)裂殖子

18.RecenttriptoSouthernIndia-headachesandvaguelyunwell.類型周圍血中發(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲(chóng)形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)狀體配子體正常大小茂氏點(diǎn)小滋養(yǎng)體纖細(xì)，常見(jiàn)２個(gè)核，一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)常有2個(gè)以上的原蟲(chóng)粗黑，配子體中明顯

16-32間日瘧原蟲(chóng)各期滋養(yǎng)體裂殖體配子體漲大,可達(dá)正常的1.5-2倍薛氏點(diǎn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍(lán)色，活潑金棕色不明顯12-24

卵形瘧原蟲(chóng)各期均有正常大小或略漲大,

薛氏點(diǎn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍(lán)色較深，核較大深棕色明顯6-12三日瘧原蟲(chóng)各期均有裂殖體正?；蚵钥s小齊氏點(diǎn)（西門氏）但少見(jiàn)圓形，藍(lán)色深，核緊縮，滋養(yǎng)體胞漿呈帶狀深棕色，粗明顯6-12

混合感染的鑒別容易鑒別的混合感染1）同一血膜中發(fā)現(xiàn)間日瘧各期原蟲(chóng)和惡性瘧雌雄配子體。2）同一血膜中發(fā)現(xiàn)大量纖細(xì)的惡性瘧環(huán)狀體，并混有少量間日瘧原蟲(chóng)。不易鑒別的混合感染1）間日瘧各期原蟲(chóng)和粗環(huán)的惡性瘧環(huán)狀體。2）僅有間日瘧和惡性瘧的環(huán)狀體。厚血膜中容易被誤認(rèn)為瘧原蟲(chóng)的物質(zhì)●

未成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞溶血后的殘影易被誤為薛氏點(diǎn)