植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)技術(shù)-滅菌方法無菌操作技術(shù)

教學(xué)目的要求1．掌握外植體的選擇條件與消毒方法；2．掌握外植體接種操作步驟及培養(yǎng)的環(huán)境條件；3．了解愈傷組織形成的條件及愈傷組織形成過程、形態(tài)發(fā)生的調(diào)控方法，掌握愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式和植物組織培養(yǎng)中愈傷組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)技術(shù)。4．一般掌握離體葉片和離體根培養(yǎng)基本過程（選修）；掌握離體莖培養(yǎng)的種類和操作步驟；第1頁/共39頁第一頁，共40頁。本節(jié)教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：重點(diǎn)：無菌操作技術(shù)；組培苗的培養(yǎng)難點(diǎn)：無菌操作技術(shù)第2頁/共39頁第二頁，共40頁。第一節(jié)外植體的選擇和消毒一、外植體的選擇選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)或特殊的基因型1.選擇健壯的植株：

健壯、無病蟲、發(fā)育正常

代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，培養(yǎng)后比較容易成功

2.選擇最適的時期：旺盛生長期

注意植物的生長季節(jié)和生長發(fā)育階段：莖尖、花蕾、嫩葉生長時間較長的塊莖、鱗莖、球莖等，往往由于攜菌量較多，不易消毒而難以培養(yǎng)成功。3.選取適宜的大小：一般0.5-1cm;脫毒0.2-0.3mm材料太大易污染，也不需要；材料太小，易受傷害脅迫、多形成愈傷組織，甚至難于成活第3頁/共39頁第三頁，共40頁。外植體（葉）的各個部分其芽、苗再生能力也很不相同

膠皮楓香樹（Liquidamnbarstyraciflua“Variegata”）葉片外植體的供體及葉的部位對其不定芽形成的影響外植體部位每個外植體形成不定芽分生組織的數(shù)目由培養(yǎng)基上增殖苗中的葉片由溫室生長2年的完整植株上的葉片葉柄葉片總數(shù)6.78.014.76.750.357.0外植體培養(yǎng)于WPM附加0.1mg/LNAA和2.5mg/LBA的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)用外植體數(shù)為70第4頁/共39頁第四頁，共40頁。二、滅菌與消毒（一）有菌和無菌的范疇有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，它的表面都是有菌的。無菌的范疇：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體。第5頁/共39頁第五頁，共40頁。菌類：

細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)：

☆極小，肉眼看不見；☆無處不有，適應(yīng)能力強(qiáng)；☆繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時便可大量滋生。消毒：

指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用的過程。第6頁/共39頁第六頁，共40頁。（二）常用的滅菌與消毒方法滅菌方法：物理方法：如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等滅菌措施；化學(xué)方法：使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理，以達(dá)滅菌效果。第7頁/共39頁第七頁，共40頁。1.濕熱滅菌（培養(yǎng)基）高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在o．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。常用方法：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時，關(guān)電源，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0．1MPa開始計(jì)時，壓力0．1---0．15MPa，20min。注意：1、培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。2、完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。第8頁/共39頁第八頁，共40頁。2.灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）鑷子、剪子、解剖刀等：→浸入95%的酒精中→酒精燈火焰上灼燒滅菌→冷卻后，立即使用。第9頁/共39頁第九頁，共40頁。3.干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）——利用烘箱加熱到160-180°C的溫度（持續(xù)90min）來殺死微生物。注意：1、干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。2、滅菌時應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時間。3、烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對流和穿透；4、到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。缺點(diǎn)：干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時間。第10頁/共39頁第十頁，共40頁。4.過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）對象：不耐熱又不能用高壓滅菌處理的制劑。如：一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素等。濾膜網(wǎng)孔直徑：0.45μm以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻。第11頁/共39頁第十一頁，共40頁。5.紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌

紫外線的波長為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。方法簡便，空間關(guān)閉緊密即可。

常用熏蒸劑：高錳酸鉀、甲醛。常用方法：房間關(guān)閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。第12頁/共39頁第十二頁，共40頁。6.噴霧滅菌（物體表面）70%～75%的酒精l%-2%的來蘇兒溶液涂擦、噴霧0.25%—1%的新潔爾滅（桌面、墻面、雙手、植物材料表面等）第13頁/共39頁第十三頁，共40頁。7.植物材料表面用消毒劑滅菌√第一步：

1、將采來的植物材料除去不用的部分，仔細(xì)洗干凈。2、切割成適當(dāng)大?。礈缇萜髂芊湃藶橐耍?。3、置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時（可加入洗衣粉）。第14頁/共39頁第十四頁，共40頁。第二步：是對材料的表面浸潤滅菌。

1.準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%～75%酒精、消毒液、無菌水、手表等。

2.酒精浸潤消毒：用70%酒精浸10～30s。70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤時間不能過長。第15頁/共39頁第十五頁，共40頁。3.化學(xué)滅菌劑處理消毒劑消毒原理：利用氯氣、重金屬、原子態(tài)氧來殺菌。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9~105~30易很好次氯酸鈉25~30易很好氯化汞0.1~15~8較難最好抗菌素4~50mg/L30~60中較好常用滅菌劑使用濃度及效果比較表第16頁/共39頁第十六頁，共40頁。第三步.無菌水涮洗——是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。

☆滅菌后用無菌水涮洗3～4次即可；

☆升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗6～10次。第17頁/共39頁第十七頁，共40頁。第二節(jié)外植體的接種和培養(yǎng)

一、無菌操作：

經(jīng)過必要消毒的操作者在嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺等)使用消過毒的器皿所進(jìn)行的操作。第18頁/共39頁第十八頁，共40頁。（一）無菌操作步驟（實(shí)驗(yàn)課）(1)接種室消毒：在接種前用甲醛熏蒸接種室，在接種前20min，打開超凈工作臺的風(fēng)機(jī)以及臺上的紫外燈(2)擺放接種用具：將培養(yǎng)基、接種用具等分別防入小推車或超凈工作臺上(無菌水.鑷子.解剖刀.酒精棉.酒精燈.培養(yǎng)皿.小燒杯等)(3)進(jìn)入接種室：接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)手及臺面消毒：用70%酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后按一定順序擦拭工作臺面；(5)培養(yǎng)材料滅菌：將接種材料預(yù)先放入燒杯，置入超凈臺進(jìn)行表面消毒。(6)接種用具滅菌：先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子浸泡在95%酒精并取出從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。注：接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。第19頁/共39頁第十九頁，共40頁。（二）接種技術(shù)

（實(shí)驗(yàn)課）

1.消毒：將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。

2.取材：材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。3.接種：用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。接種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘，蓋上瓶蓋。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1—3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。4.標(biāo)記：注明接種日期、培養(yǎng)基編號等。第20頁/共39頁第二十頁，共40頁。第二節(jié)外植體的接種和培養(yǎng)二、培養(yǎng)：指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(適宜光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或再生植株的過程。第21頁/共39頁第二十一頁，共40頁。1．培養(yǎng)方法

(1)固體培養(yǎng)法——用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單，操作易行。缺點(diǎn)：養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法——用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。優(yōu)點(diǎn)：能均衡提供養(yǎng)分。缺點(diǎn)：透氣性較差。通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給；速度：一般為50-100r／min。濾紙橋方法第22頁/共39頁第二十二頁，共40頁。2．培養(yǎng)步驟(1)初代培養(yǎng)

——即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。目的：獲得無菌材料和無性繁殖系。培養(yǎng)基：常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。

第23頁/共39頁第二十三頁，共40頁。2．培養(yǎng)步驟

(2)繼代培養(yǎng)——（擴(kuò)繁培養(yǎng)）是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。

目的：繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。擴(kuò)繁的方法：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。第24頁/共39頁第二十四頁，共40頁。

2．培養(yǎng)步驟（3）生根培養(yǎng)生根培養(yǎng)目的：使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)基：可采用1／2或者1/4MS培養(yǎng)基，降低全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。第25頁/共39頁第二十五頁，共40頁。第26頁/共39頁第二十六頁，共40頁。3、培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的

問題及解決方法

（第四章植物組織培養(yǎng)中常見問題及解決辦法）A.培養(yǎng)外植體的污染B.初代培養(yǎng)外植體的褐變C.繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化初代第27頁/共39頁第二十七頁，共40頁。4.植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件

在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。第28頁/共39頁第二十八頁，共40頁。溫度(temperature)

一般采用25±2℃。低于15℃℃時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35℃時對植物生長不利。不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是20℃、月季足25-27℃、番茄是28℃。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。第29頁/共39頁第二十九頁，共40頁。光照(light)主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時間方面1．光照強(qiáng)度(lightintensity)光照強(qiáng)度對培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。2．光質(zhì)(lightwave)光質(zhì)對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3．光周期(lightperiod)最常用的周期是16h光照/8h的黑暗。研究表明，一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。

第30頁/共39頁第三十頁，共40頁。濕度(humidity)☆實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的相對濕度：一般要求70%—80%的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。

濕度過低會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時，易引起棉塞長霉，造成污染?！钆囵B(yǎng)容器內(nèi)的相對濕度：100%相對濕度第31頁/共39頁第三十一頁，共40頁。滲透壓(penetratingpressure)1—2個大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用。培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，影響到滲透壓的變化。2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用。5—6個大氣壓植物生長就會完全停止。6個大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。第32頁/共39頁第三十二頁，共40頁。pH值(pHvalue)大多在5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.6-5.8。不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的。pH值對瓊脂的影響：一般來說當(dāng)pH值高于6.5時，培養(yǎng)基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。pH值在培養(yǎng)基制作中的變化：高溫滅菌會降低pH值(約0.2—0.8個pH值)

pH值大小調(diào)整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高0．2單位，lml的HCl可使pH值降低0．2單位。