不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的觀察,發(fā)育生物學論文

不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的觀察,發(fā)育生物學論文視神經(jīng)是視覺傳導的通路，屬中樞神經(jīng)，由視網(wǎng)膜節(jié)細胞發(fā)出的神經(jīng)纖維及神經(jīng)膠質(zhì)細胞組成，不含神經(jīng)元胞體，因而常用作中樞神經(jīng)損傷再生研究較理想的實驗材料[1、2],但有關不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的變化當前還未見系統(tǒng)報道。本研究從組織形態(tài)學的角度，采用常規(guī)HE及免疫組織化學染色，結合電鏡技術，通過對不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)的觀察，以期揭示其變化規(guī)律，為進一步進行有關視神經(jīng)的研究提供實驗資料。1材料和方式方法1.1動物及主要試劑來源實驗動物由第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供成年Wistar品系大鼠，種鼠按雄：雌1∶2籠養(yǎng)交配，次晨檢查出現(xiàn)陰栓為妊娠零天。實驗試劑為抗CNPase單抗〔23-cyclicnucleotide3-phosphohydrolase,CNPase,Promega公司〕用于標記整個發(fā)育階段的少突膠質(zhì)細胞，抗GalC〔Galactocere-brosideGalC,Sigma公司〕多抗用于標記成熟的少突膠質(zhì)細胞。抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白〔glialfibrillaryacid-icprotein,GFAP,重慶醫(yī)科大學〕單抗用于標記星形膠質(zhì)細胞。SP免疫組化試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品。1.2分組與檢測方式方法1.2.1動物分組及取材按產(chǎn)后〔postnatal〕0、3、5、8、15、20、90天平均分成7組，分別命名為P0d、P3d、P5d、P8d、P15d、P20d及P90d,每組4只。華而不實HE染色、抗CNPase、GalC和GFAP免疫組化染色2只，電鏡2只。動物斷頭后1分鐘內(nèi)用顯微手術器械于視穿插向前一直達眼球完好取出視神經(jīng)。電鏡標本放入3%的戊二醛中固定，HE及免疫組化染色標本放入4%的多聚甲醛/PB中固定，常規(guī)石蠟包埋切片。1.2.2免疫組化染色觀察操作步驟按講明書進行，只作少許修改，即石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2/甲醇10min,PBS洗3min3次，7%山羊血清/PBS室溫孵育30min,CNPase〔1∶1000〕單抗，GalC多抗〔1∶100〕及GFAP單抗〔1∶100〕4℃過夜，PBS洗5min3次，生物素化IgG〔1∶200〕37℃6h,PBS5min3次，HRP標記的鏈霉卵白素〔1∶200〕37℃2h,PBS5min3次后，DAB顯色光鏡觀察。1.2.3發(fā)育大鼠視神經(jīng)HE染色按常規(guī)進行電鏡觀察、常規(guī)包埋后切片，電子染色，透射電鏡觀察。將HE染色及GFAP和CNPase、GalC染色結果照相，然后換算成一樣放大倍數(shù)〔200〕，每張照片〔5寸〕分別隨機統(tǒng)計4個一樣面積〔4cm2〕內(nèi)陽性細胞數(shù)，每種染色在一樣時相點統(tǒng)計兩張照片〔n=8〕，統(tǒng)計時根據(jù)體視學的原則，對于統(tǒng)計格內(nèi)框格線上的細胞進行數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右；HE染色切片則統(tǒng)計一樣情況下藍染細胞核的數(shù)目，以此作為視神經(jīng)內(nèi)膠質(zhì)細胞的總數(shù)。1.3統(tǒng)計學分析所得數(shù)據(jù)用SPMR數(shù)理統(tǒng)計程序包在計算機進行雙因素方差分析，所用程序為MANOVA,結果以珚xs標準差表示，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1電鏡觀察大鼠出生后1天的視神經(jīng)內(nèi)細胞排列不規(guī)則，核多呈圓形，有的細胞內(nèi)胞漿較豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及高爾基氏體較發(fā)達，異染色質(zhì)相對較多；另有一些細胞質(zhì)內(nèi)電子密度相對較低，有時可見成束的膠質(zhì)原纖維，細胞核相對較大，異染色質(zhì)相對較少，此類細胞相對較前一類為多。細胞間有大量的軸突，不見明顯的髓鞘構成。出生后3天，細胞的數(shù)量有所增加，細胞的排列趨于規(guī)則，即細胞沿視神經(jīng)長軸平行排列，與纖維相間。胞體稍有增大，胞質(zhì)內(nèi)細胞器仍較豐富，異染色質(zhì)較多的細胞比例有所增加，軸突似可見單層的髓鞘。出生后5天，異染色質(zhì)較多的細胞明顯增加，細胞排列更規(guī)則，胞質(zhì)顯著減少，胞核拉長變扁，纖維區(qū)出現(xiàn)散在髓鞘包繞的軸突〔見圖1〕。以后這種變化越來越明顯，到出生后3月，可見細胞體積相對較小，胞質(zhì)內(nèi)仍可見較多的高爾基氏體和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；細胞核長方形，常偏位；軸突均為髓鞘所包繞，已少見到胞質(zhì)內(nèi)有膠質(zhì)原纖維的細胞，見圖2.2.2HE染色光鏡觀察大鼠出生后1天，視神經(jīng)組織內(nèi)細胞散在，較少，排列不規(guī)則；出生后3天，細胞數(shù)量明顯增加〔見圖3〕；出生后5天，細胞排列漸規(guī)則，細胞數(shù)量的增幅明顯減?。恢脸錾?0天后細胞排列規(guī)則，見圖4.2.3CNPase及GalC免疫組化染色大鼠出生后1天，視神經(jīng)內(nèi)均未見GalC免疫染色陽性細胞，而只要極少數(shù)的CNPase免疫反響陽性細胞，排列不規(guī)則〔見圖5〕。到出生后5天，兩種抗體均為陽性的細胞數(shù)已顯著增加，排列也趨于規(guī)則，于出生后15天，細胞數(shù)量的增長已顯著放慢，并沿視神經(jīng)的長軸平行排列，見圖6.2.4GFAP免疫組化染色大鼠出生后前3天，有較多的GFAP免疫反應陽性細胞〔見圖7〕,8天后，GFAP免疫反響陽性細胞數(shù)量較新生大鼠顯著減少，到出生后3月，GFAP免疫反響陽性細胞已較少見到，見圖8.2.5不同發(fā)育階段視神經(jīng)內(nèi)兩種大膠質(zhì)細胞的統(tǒng)計學變化大鼠出生后3天，視神經(jīng)內(nèi)細胞總數(shù)較出生時有顯著增加〔P0.05〕，以后其增加速度迅速減慢，但成年大鼠視神經(jīng)內(nèi)的細胞數(shù)較出生后20天仍有一定程度的增長。CNPase免疫反響陽性細胞在出生后3天顯著增加〔P0.05〕，同時，GalC免疫反響陽性細胞也迅速增加〔P0.05〕，到出生后20天，一樣面積內(nèi)CNPase免疫反響陽性細胞數(shù)與GalC免疫反響陽性細胞數(shù)已無顯著差異不同〔P0.05〕。相反，GFAP免疫反響陽性細胞固然在出生后3天有一定程度的增加，但出生5天后其數(shù)量即迅速減少，至成年后便維持在一定水平，見表1【1】3討論中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞的分類復雜，根據(jù)其大小、形態(tài)、功能及免疫學特性就可分為很多種。華而不實兩種大膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所占的比例最大，且生物學作用也非常重要。因而，本研究主要就這兩種膠質(zhì)細胞進行了觀察。當前，鑒定星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞的方式方法也有多種，包括光鏡及電鏡方式方法。電鏡對組織構造的細微變化觀測有著不可替代的優(yōu)越性，通過對電鏡下某些細胞所表現(xiàn)出的特征性構造的認識，能夠到達對這些細胞進行初步定性的目的[3].而在光鏡下，免疫組化染色不僅可對細胞進行較準確的定性，進而對細胞進行較準確的分類計數(shù)，而且在一定程度上還可對細胞內(nèi)某些代射產(chǎn)物進行定量檢測。本研究正是基于這樣的事實，綜合運用常規(guī)HE染色、免疫組化及電鏡技術，對不同發(fā)育階段大鼠視神經(jīng)進行了比擬系統(tǒng)的觀察。本研究結果顯示，新生大鼠的視神經(jīng)內(nèi)可見大量平行排列的視網(wǎng)膜節(jié)細胞軸突，不見明顯的髓鞘構成，其髓鞘是在出生后5天才逐漸形成的，這與Schwab等〔1989〕在皮質(zhì)脊髓束中觀察到的基本一致。視神經(jīng)中各細胞成份的統(tǒng)計學顯示，視神經(jīng)中一樣面積內(nèi)的細胞總數(shù)在出生后的最初3天變化比擬明顯，即在出生后3天之內(nèi)，細胞總數(shù)迅速增加，以后則變化明顯放慢。同時，視神經(jīng)中兩種主要的細胞成份少突膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量各自向著相反的方向變化，即在較短的時間內(nèi)少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量迅速增加，而星形細胞的數(shù)量迅速減少。在出生后3天，視神經(jīng)中不僅CNPase免疫反響陽性細胞數(shù)迅速增加，而且還出現(xiàn)了較多GalC免疫反響陽性細胞〔P0.05〕，這種GalC免疫反響陽性細胞隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，其比例也逐步接近CNPase免疫反響陽性細胞，也就是講，視神經(jīng)不斷發(fā)育成熟伴隨著少突膠質(zhì)細胞的發(fā)育成熟[5,6].早些時候Jakson[7]及Dentinger[8]等采用先在光鏡下數(shù)單位面積內(nèi)細胞的總數(shù)，再在電鏡下鑒定細胞類型的方式方法對發(fā)育大鼠視神經(jīng)內(nèi)各細胞成份的變化進行了類似的研究。其結論是：視神經(jīng)在出生后的發(fā)育中細胞的總數(shù)有逐步減少的頃向，并以為少突膠質(zhì)細胞的比例在出生后雖迅速增加，但星形細胞卻終保持著較高的比例，在成年動物差不多為1∶1,這與本實驗結果有較大的偏差。Burne等[9]直接在電鏡下進行細胞分類計數(shù)，結果是少突膠質(zhì)細胞：星形膠質(zhì)細胞為2∶1的比例。也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著視神經(jīng)的發(fā)育成熟，神經(jīng)纖維會逐步減少，髓鞘構成細胞逐步增加[10].筆者以為，這與其計數(shù)及鑒定方式方法有關。由于電鏡的放大倍數(shù)較大及少突膠質(zhì)細胞多形性，因而，很難對細胞進行比擬精到準確地計數(shù)。本實驗采用少突膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞特異性標記物對細胞進行免疫組織化學染色并在光鏡下觀測，極大地避免了分類上的誤差；另