CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞慢性缺氧損傷的機(jī)制與優(yōu)點(diǎn),神經(jīng)生物學(xué)論文

CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞慢性缺氧損傷的機(jī)制與優(yōu)點(diǎn),神經(jīng)生物學(xué)論文原標(biāo)題：氯化鈷誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制及應(yīng)用內(nèi)容摘要：CoCl2是研究神經(jīng)退行性疾病建立缺氧模型時(shí)常用的造模藥物，CoCl2引起缺氧與Co2+置換細(xì)胞內(nèi)的氧感受器類血紅素蛋白及一些催化酶中的Fe2+、HIF表示出增加、ROS蓄積等都密切相關(guān)。本文就CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧的可能機(jī)制及應(yīng)用作一綜述。本文關(guān)鍵詞語：CoCl2;神經(jīng)細(xì)胞；缺氧模型；機(jī)制；應(yīng)用缺血性腦血管疾病因發(fā)病率高、致殘率高，與心臟病、惡性腫瘤一起構(gòu)成了人類的三大致死性疾病。缺血性腦血管病發(fā)生時(shí)，缺血會(huì)直接引起神經(jīng)細(xì)胞的缺氧損傷，引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、構(gòu)造改變和功能減退，這與癲癇、阿爾茨海默癥、帕金森等多種疾病密切相關(guān)。氯化鈷〔CoCl2〕由于使用方便、理化性質(zhì)穩(wěn)定而成為誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞慢性缺氧損傷的首選藥物，本文將從CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制及其應(yīng)用方向和特點(diǎn)作一綜述。一、CoCl2在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧損傷的機(jī)制CoCl2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞缺氧的機(jī)制復(fù)雜，多條途徑共同作用，并有特異性蛋白的表示出、免疫炎癥反響及基因的活化或抑制。華而不實(shí)主要包括Co2+的作用、缺氧誘導(dǎo)因子-1〔hypoxiainduciblefator1,HIF-1〕的作用和反響活性氧〔reactiveoxygenspecies,ROS〕的蓄積反響三方面，下面將從此三方面展開闡述?！惨弧矯o2+的作用包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞的氧感受器都是胞內(nèi)的一種類血紅素蛋白，根據(jù)其Fe2+能否與O2結(jié)合而分為氧合和脫氧狀態(tài)，缺氧時(shí)它通過轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾蠣顟B(tài)來感受細(xì)胞缺氧，然后經(jīng)信息傳遞引起缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Co2+作用于細(xì)胞后，一方面它能夠直接取代類血紅素中的Fe2+,使類血紅素不能和氧結(jié)合而保持脫氧狀態(tài)，進(jìn)而模擬缺氧[1];另一方面，Co2+會(huì)置換催化基團(tuán)上的Fe2+,進(jìn)而阻止脯氨酸羥化酶和天冬氨酸羥化酶的活性，抑制HIF-1的降解，HIF-1聚集后引起缺氧損傷作用[2].除此之外，Co2+可以以作為亞鐵螯合酶的底物，亞鐵螯合酶是將鐵合成亞鐵血紅素的重要的介入酶，Co2+作為底物介入合成后可使新生成的類血紅素蛋白失去攜氧活性[3].因而，CoCl2能夠抑制類血紅素蛋白合成和影響其功能而發(fā)揮誘導(dǎo)缺氧的作用?！捕矵IF的作用HIF-1在細(xì)胞缺氧損傷的調(diào)節(jié)經(jīng)過中處于關(guān)鍵地位。1992年，Semenza等在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核粗提液中發(fā)現(xiàn)了HIF-1,它主要由異二聚體的形式存在，由和兩個(gè)亞單位組成。華而不實(shí)HIF-1在細(xì)胞內(nèi)表示出水平相對恒定，在常氧下，HIF-1半衰期小于5分鐘且一直處于合成和分解的狀態(tài)，在胞漿中幾乎檢測不到，而缺氧細(xì)胞內(nèi)HIF-1的水平迅速增高，并成為細(xì)胞接受缺氧刺激的感受器[4].HIF-1在抗缺氧損傷和缺氧損傷經(jīng)過中都起了重要的作用，神經(jīng)細(xì)胞在應(yīng)用CoCl2后HIF-1表示出增高[5].HIF-1在細(xì)胞內(nèi)受脯氨酸羥化酶和天冬氨酸羥化酶二者的調(diào)節(jié)，在O2和Fe2+存在的條件下發(fā)生羥基化，繼而可與細(xì)胞內(nèi)的腫瘤抑制蛋白〔VonHippel-Lindautumorsuppressorprotein,pVHL〕結(jié)合并降解。在CoCl2的作用下Fe2+被置換，使HIF-1無法羥基化而在細(xì)胞內(nèi)聚集。HIF-1堆積后首先進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1異物二聚化構(gòu)成HIF-1,HIF-1作為反式作用因子與核染色體的缺氧反響元件結(jié)合而激活多種目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯經(jīng)過。到當(dāng)前為止已發(fā)現(xiàn)60多種基因的調(diào)控與HIF-1有關(guān)[6].在長期或嚴(yán)重缺氧時(shí)，胞漿內(nèi)大量HIF-1會(huì)發(fā)生去磷酸化而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。這是由于：一方面HIF-1發(fā)生了共價(jià)修飾使HIF-1與HIF-1解聚，進(jìn)一步減少了HIF-1與缺氧反響元件的連接[7];共價(jià)修飾后的HIF-1會(huì)增加與Hsp40/70的結(jié)合能力，募集Hsp70并介導(dǎo)泛素-蛋白酶體途徑，HIF-1迅速降解，細(xì)胞抗缺氧能力下降。另一方面，HIF-1與位于Nip3翻譯起始密碼子上游234bp處基因啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Nip3的表示出〔Althaus等。2006〕,Nip3是Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白成員，Nip3表示出增加可與抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-XL結(jié)合直接抑制它們的抗凋亡作用；同時(shí)還能直接結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔復(fù)合物〔mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP〕上，使線粒體膜的通透性增加、線粒體腫脹而導(dǎo)致促進(jìn)凋亡因子釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。再者，去磷酸化的HIF-1能夠穩(wěn)定P53蛋白，可以使促紅細(xì)胞生成素〔EPO〕、內(nèi)皮素-1〔ET-1〕、胰島素樣生長因子-2〔IGF-2〕和血管內(nèi)皮生長因子〔VEGF〕等一系列蛋白的表示出異常共同介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡發(fā)生[8].〔三〕ROS的作用Liu等[9]通過檢測缺氧的海馬神經(jīng)元的裂解液中超氧化物歧化酶〔SOD〕活性和丙二醛〔MDA〕含量發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元缺氧后SOD活性持續(xù)下降，MDA含量逐步增加，而應(yīng)用抗氧化損傷藥物可通過下調(diào)ROS明顯保衛(wèi)神經(jīng)元，講明自由基的蓄積在大腦缺血損傷經(jīng)過中起了重要作用。Wang等[10]通過CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞缺氧并檢測其ROS的生成量及相關(guān)凋亡蛋白〔包括Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bcl-XL〕的表達(dá)及P38MAPK磷酸化程度發(fā)現(xiàn)CoCl2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞缺氧后可導(dǎo)致ROS增加，同時(shí)ROS可上調(diào)凋亡相關(guān)基因表示出及促使p38MAPK磷酸化程度增加進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的凋亡損傷。在正常生理情況下，自由基不斷產(chǎn)生并不斷去除，始終維持在一個(gè)正常的生理水平。ROS包括羥自由基、過氧化氫、一氧化氮、過氧亞硝酸鹽和O2-等，與線粒體氧化磷酸化功能密切相關(guān)。ROS在細(xì)胞缺氧損傷經(jīng)過中起著重要的作用，其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制復(fù)雜至今尚無定論。其可能的機(jī)制主要是ROS產(chǎn)生增加或是去除減少時(shí)導(dǎo)致其蓄積并可能與其引起胞漿內(nèi)Ca2+變化，P38激活絲裂原活化蛋白〔P38MAPK〕以及激活Caspase系統(tǒng)引起線粒體通透性等改變等有關(guān)。1.胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平升高：ROS引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化主要是通過促進(jìn)細(xì)胞膜Ca2+通道開放和阻止Ca2+從胞漿進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，使Ca2+在胞質(zhì)內(nèi)大量蓄積。其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制是一方面Ca2+作為第二信使激活鈣離子依靠性蛋白激酶1〔calcium-activatedneutralproteases1,Calpains1〕。Calpains1活化后進(jìn)一步激活Caspase-12誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡通路；另一方面Ca2+蓄積使其與鈣調(diào)素的結(jié)合減少，導(dǎo)致鈣/鈣調(diào)素依賴性激酶Ⅱ〔calcium/camodulin-de-pendentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ〕活性受抑制，CaMKⅡ是一種多功能蛋白激酶，在神經(jīng)組織細(xì)胞中含量較多，其活性受抑制后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)障礙，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)加重[11].除此之外在細(xì)胞凋亡經(jīng)過中NADPH氧化酶和線粒體產(chǎn)生大量了ROS,并誘導(dǎo)Ca2+蓄積，可進(jìn)一步激活c-JunN端激酶〔c-JunN-terminalkinase,JNK〕通路。2.P38MAPK激活：P38MAPK是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原激活蛋白激酶家族成員，其主要功能是將胞外的信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，調(diào)控著細(xì)胞的生長、分裂、分化、死亡，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞間的功能同步等多數(shù)經(jīng)過。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS增加后一方面可激活蛋白酪氨酸激酶〔PTK〕,活化后的PTK可通過分子SH2/SH3蛋白進(jìn)一步活化Ras蛋白，Ras蛋白能夠激活P38MAPK;另一方面ROS可直接激活P38MAPK并迅速導(dǎo)致其磷酸化，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象改變，進(jìn)一步活化一系列底物如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、胞漿和胞核蛋白等，引發(fā)炎癥反響、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期停滯、凋亡、衰老、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及RNA剪接調(diào)控等〔Sehieven等。2005〕。3.引起線粒體通透性改變：Brookes等[12]以為在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞ROS水平升高，超過機(jī)體去除能力，使線粒體膨大、通透性改變、孔道構(gòu)成，細(xì)胞色素C從內(nèi)膜脫落并流失到細(xì)胞質(zhì)中，影響bcl-xl基因表示出進(jìn)而激活caspase系統(tǒng)。通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、激光共聚焦以及Westernblot技術(shù)檢測可發(fā)如今細(xì)胞ROS增加的情況下一方面使線粒體膜電位降低、線粒體內(nèi)膜心磷脂過氧化；另一方使細(xì)胞質(zhì)Bax移位至線粒體外膜促使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔〔MPTP〕改變，大量的凋亡蛋白如內(nèi)外膜間蛋白細(xì)胞色素C〔cytochromeC〕、凋亡誘導(dǎo)因子〔AIF〕等釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)激活下游的凋亡復(fù)合體，進(jìn)而使DNA剪切、凋亡小體構(gòu)成。通過對線粒體內(nèi)膜ATP敏感鉀通道〔mitochon-drialATP-sensitivepotassiumchannels,mitoKATP〕和ROS之間關(guān)系的研究也發(fā)現(xiàn)〔Xuan等。2005〕:在ROS介導(dǎo)下PKC的疏基激活，同時(shí)PKC通過cAMP通路和mitoKATP開放使MPTP開放程度增大，進(jìn)一步使線粒體構(gòu)造和功能改變，誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體通路凋亡。Zhong等以為113],在神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)用CoCl2后HI