小鵝瘟滅活疫苗(TZ10株)的研制

小鵝瘟滅活苗（株）研制小鵝瘟是導(dǎo)致雛鵝死亡的常見疾病之一,可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)有弱毒活疫苗和小鵝瘟抗體的廣泛應(yīng)用在我國小鵝瘟疫病防控過程中發(fā)揮了巨大的作用。但活毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的潛在危害從而限制了其生產(chǎn)應(yīng)用,因此研究小鵝瘟滅活疫苗顯得尤為重要研究對小鵝瘟分離毒株的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究,篩選出免疫原性好殖滴度高的小鵝瘟野毒株作為滅活疫苗候選株,并開展了生產(chǎn)工藝、乳化工藝和免疫效力研究工作以期制備出安全、高效的小鵝瘟滅活疫苗,為我國小鵝瘟疫病的防控和凈化提供有力工具。1鵝瘟病毒疫苗候選株的篩選為了研制與當(dāng)前小鵝瘟流行株匹配的疫苗本研究對從2009～2011年江蘇省養(yǎng)鵝地區(qū)疑似小鵝瘟的臨床樣品中共分離了5株鵝細(xì)小病毒(GPV),同時對分離株進(jìn)行VP3因測序并繪制遺傳進(jìn)化樹,序列分析結(jié)果表明GPV分離株與國內(nèi)大部分分離株屬于同一分支明顯不同于國內(nèi)疫苗株SY61和臺灣主要分支獲得的毒株經(jīng)有限稀釋法純化并對純化后的病毒進(jìn)行繁殖性能、毒力、特異性及免疫原性等進(jìn)行了測,5株病毒均屬于強(qiáng)毒株,其中Goslingplaguevirus/taizhou/10(TZ10)病毒含量最高(F10代:105.0ELD50/0.2ml以上),且其滅活抗原免疫鵝周后的抗體水平最高,因此確定以TZ10株作為小鵝瘟疫苗候選株。按照農(nóng)業(yè)部頒發(fā)獸用生物制品(毒種種子批建立實驗技術(shù)指導(dǎo)原則》各項要求,對純化后的TZ10株F0代毒在鵝胚中連續(xù)傳至代,并分別對不同代次種毒進(jìn)行了AGP、鵝胚半數(shù)致死量(ELD50)定、免疫原性、特異性實驗及純凈性檢驗,建立了符合規(guī)定的小鵝瘟病TZ10株的基礎(chǔ)種子批(F16～F20種毒)、

規(guī)定了生產(chǎn)用最高限制代次(F25)2小鵝瘟滅活疫苗生產(chǎn)工藝研究疫苗生產(chǎn)過程中,抗原的生產(chǎn)工藝決定了疫苗質(zhì)量及生產(chǎn)成本抗原的完全滅活和疫苗的乳化工藝分別是關(guān)系到疫苗安全、有效性和疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。本研究選取前期種子批代次GPV尿囊液,進(jìn)行最佳鵝胚接種劑量與最佳鵝胚接種日齡的試驗,從鵝胚死亡數(shù)統(tǒng)計、抗原收獲量統(tǒng)計、病毒含量測定三方面進(jìn)行比較,分別確定生產(chǎn)過程中最佳病毒稀釋比例、接毒劑量、鵝胚日齡為種毒用滅菌生理鹽水進(jìn)1:100倍稀釋,0.2ml/胚劑量尿囊腔途徑接11日齡非免鵝胚最佳根據(jù)接種后不同時間鵝胚死亡數(shù)抗原收獲量死亡鵝胚情況和病毒含量測定數(shù)據(jù)確定種毒最佳培養(yǎng)時間為接毒后～120小時,收獲死亡鵝胚尿囊液;抗原最佳培養(yǎng)時間為接毒后48～144小時收獲死亡鵝胚尿囊液及鵝胚。為了確定抗原滅活的最佳方法對甲醛溶液的濃度、滅活時間進(jìn)行了研究結(jié)果表明:采用甲醛溶液作為滅活劑,滅活劑終濃度為℃滅活48時,可以完全滅活小鵝瘟病毒TZ10株。乳化工藝研究證實取小鵝瘟病毒株滅活抗原,按每96份抗原加4份滅菌吐溫-80比例加吐溫80,充分溶解混勻,制成水相;94份注射用白油加6份司盤-80及1份硬脂酸鋁加熱溶解至透明滅菌,制成油相;水相與油相的最佳配比為1:3,二次乳化的剪切速率在3000～4000r/min,乳化過程溫度控制在25℃以下,可獲得最佳乳化效果。3小鵝瘟滅活疫苗的安全性評價按照確定的小鵝瘟滅活疫苗TZ10株)生產(chǎn)工藝,在實驗室試制了3批滅活疫苗。將試制的3批小鵝瘟滅活疫苗TZ10株)通過疫苗單劑量單劑量重復(fù)及雙倍劑量免疫3～5日齡1月齡鵝7月齡開產(chǎn)種鵝、月齡產(chǎn)蛋種鵝進(jìn)行安全性評,果表明:所有免疫鵝精神狀態(tài)、采食、飲水正常,無全身不良反應(yīng)。

接種部位無腫脹,免疫21日后,單劑量重復(fù)和雙倍劑量接種的實驗組中,有少量疫苗顆粒未吸收現(xiàn)象除雙倍劑量接種組個別鵝注射部位肌肉有輕微潮紅,其余各免疫組免疫鵝注射部位無異常變化疫21后,免疫組與對照組鵝平均增重?zé)o顯著差異。疫苗注射后1周內(nèi)產(chǎn)蛋鵝產(chǎn)蛋數(shù)較對照組少～3枚,之后恢復(fù)正常,且種蛋孵化率無差異表明研制的小鵝瘟滅活疫苗(TZ10)對產(chǎn)蛋鵝安全,雛鵝接種后未出現(xiàn)任何臨床癥狀。4鵝瘟滅活疫苗的效力評價通過對3試制疫苗的免疫效力試驗,發(fā)現(xiàn)小鵝瘟疫苗免疫種鵝產(chǎn)生血清瓊擴(kuò)抗體水平與雛鵝被動免瓊擴(kuò)抗體水平、攻毒保護(hù)率呈正相關(guān);對種鵝血清GPV瓊擴(kuò)抗體效價與對應(yīng)雛鵝攻毒保護(hù)結(jié)果相關(guān)性分析表明,當(dāng)種鵝血清抗體效價為時,雛鵝血清被動免疫保護(hù)率為92.3%;當(dāng)種鵝血清抗體效價不低于1:4時,雛鵝被動免疫保護(hù)率達(dá)到100%考慮到臨床飼養(yǎng)環(huán)境及鵝群健康狀況的不確定性規(guī)定疫苗的效力檢驗標(biāo)準(zhǔn)為:7～8月齡健康陰性鵝,胸部肌肉注射疫苗,1.0ml/,4周后其血清GPV瓊擴(kuò)抗體效價幾何平均值應(yīng)不低于1:8。最小免疫劑量實驗結(jié)果表明,試制的3批疫苗以不低于0.5ml/只劑量免疫7～8月齡產(chǎn)蛋種鵝,免疫后種蛋孵化的雛鵝以上可以抵抗GPV強(qiáng)毒的攻擊。根據(jù)3批試制疫苗制苗抗原滅活前的病毒含量及最小免疫劑量試驗結(jié)果考慮到臨床實際情況的復(fù)雜性,為保證雛鵝獲得確實的被動保護(hù)規(guī)定制苗用半成品抗原的病毒含量應(yīng)≥105.5ELD50/0.2ml、推薦免疫劑量為只。根據(jù)3批試制疫苗免疫持續(xù)期的種鵝和雛鵝的血AGP體效價及所產(chǎn)種蛋孵化雛鵝的攻毒保護(hù)試驗結(jié)果,確定種鵝開產(chǎn)前免疫次,lml/次,其免疫持續(xù)期

為5個月;推薦免疫程序為:種鵝開產(chǎn)前5周首免胸部肌肉注射,1.0ml/只,3周后以相同劑量途徑加強(qiáng)免疫1次該免疫程序可基本保證種鵝在6月產(chǎn)蛋期內(nèi),雛鵝獲得有效母源抗體抵抗GPV感染。因健康陰性產(chǎn)蛋種鵝的來源和質(zhì)量不夠穩(wěn)定其作為效檢用動物時,難以保證檢驗結(jié)果的穩(wěn)定性及可重復(fù)性此本研究對疫苗免疫雞后血清抗體效價及特異性進(jìn)行了分析,以探討其作為小鵝瘟疫苗效檢替代動物的可行性。3批小鵝瘟滅活疫苗以不同劑量免疫21日齡SPF雞抗體檢測結(jié)果顯示同一劑量不同時間點檢測的SPF雞血清AGP抗體效價基本一致,表明SPF雞對疫苗可產(chǎn)生穩(wěn)定的免疫抗體反應(yīng)SPF雞免疫后陽性血清與小鵝瘟病毒進(jìn)行中和反應(yīng)結(jié)果表明,SPF雞免疫小鵝瘟滅活疫苗后產(chǎn)生的抗體具有特異性抗體效價隨免疫劑量和時間的變化規(guī)律與7～8月齡健康陰性種鵝免疫后血清AGP抗體效價的變化規(guī)律一致,證明免疫F雞后測定血清AGP抗體效價方法作為小鵝瘟滅活疫苗的效檢方法是可行的。根據(jù)疫苗免疫雞和種鵝的中和抗體效價與AGP抗體效價相關(guān)性分析當(dāng)種鵝AGP抗體效價在1:8時,中和抗體效價為對應(yīng)的SPF雞血清AGP抗體