物理圖繪制市公開課獲獎(jiǎng)?wù)n件

第三章物理圖繪制學(xué)習(xí)要點(diǎn)：物理作圖辦法各種辦法優(yōu)缺點(diǎn)第1頁(yè)第1頁(yè)用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對(duì)于指導(dǎo)基因組計(jì)劃測(cè)序階段還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，由于遺傳圖譜不足：遺傳圖分辨率有限：依賴于所得到互換數(shù)目。遺傳圖準(zhǔn)確性較低：重組熱點(diǎn)存在。遺傳圖準(zhǔn)確率有限：環(huán)境原因和取樣誤差，分子標(biāo)識(shí)排列有時(shí)會(huì)出現(xiàn)差錯(cuò)。第2頁(yè)第2頁(yè)物理圖譜是以物理距離來(lái)表示各遺傳標(biāo)識(shí)之間或DNA序列兩點(diǎn)之間在DNA分子上位置，以實(shí)際堿基對(duì)長(zhǎng)度來(lái)度量其物理距離。第3頁(yè)第3頁(yè)1）限制性作圖（Restrictionmapping）：它是將限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)定在DNA分子相對(duì)位置。2）依托克隆基因組作圖

(Clone-basedmapping)：依據(jù)克隆DNA片段之間重疊順序構(gòu)建重疊群

(Contig),繪制物理連鎖圖。3）熒光原位雜交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：將熒光標(biāo)識(shí)探針與染色體雜交擬定分子標(biāo)識(shí)所在位置。4）序列標(biāo)識(shí)位點(diǎn)作圖

（Sequencetaggedsite,STS）：通過PCR或分子雜交將小段DNA序列定位在基因組DNA區(qū)段中。物理圖繪制辦法第4頁(yè)第4頁(yè)3.1限制性作圖第5頁(yè)第5頁(yè)3.1.1限制性作圖---小分子DNA第6頁(yè)第6頁(yè)在連續(xù)出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)相同酶切位點(diǎn)區(qū)段，其排列序列可有各種選擇，此時(shí)采用部分酶切辦法使該區(qū)段只發(fā)生一次酶切，這稱為部分限制作圖。第7頁(yè)第7頁(yè)第8頁(yè)第8頁(yè)部分限制作圖為構(gòu)建完整圖譜提供了必須信息。但假如有多個(gè)限制位點(diǎn)，這種辦法就顯得力不從心。尤其是內(nèi)部含有大小相同片段時(shí)，重疊片段無(wú)法區(qū)別，使排序變得非常復(fù)雜。一個(gè)較簡(jiǎn)樸變通策略使我們能夠忽略大量片段。這種辦法是將標(biāo)識(shí)物加到要分析DNA分子兩端，進(jìn)行部分酶切處理后，諸多產(chǎn)物成為不可見，我們利用可見部分大小，擬定那些未定位切點(diǎn)與DNA分子末端相對(duì)位置。第9頁(yè)第9頁(yè)第10頁(yè)第10頁(yè)1)制備---瓊脂糖包埋法2)酶切---稀有酶切位點(diǎn)限制酶3)分離---脈沖電泳分離3.1.2限制性作圖局限假如基因組較大，切點(diǎn)較多，單、雙、部分酶切片段會(huì)諸多。限制性作圖只能應(yīng)用于較小DNA分子。大分子DNA研究策略與辦法：第11頁(yè)第11頁(yè)

1.制備--瓊脂糖包埋法1)分離純化細(xì)胞核；2)將搜集細(xì)胞核包埋在瓊脂糖凝膠薄片中；3)蛋白酶消化處理細(xì)胞核。第12頁(yè)第12頁(yè)2.稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶應(yīng)用1)稀有切點(diǎn)限制酶：在基因組DNA序列中只有很少可辨認(rèn)序列限制酶，普通辨認(rèn)位點(diǎn)在6-8堿基對(duì)之間,并含有高G/C比。2)選取稀有切點(diǎn)限制酶注意事項(xiàng)：a)辨認(rèn)位點(diǎn)非特異序列，-GANTC-(HinfI)，-GCCN4NGCC-(BglI)b)高等生物基因組普通A/T比較高，應(yīng)選G/C高百分比限制酶，如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因組甲基化狀態(tài)，人類基因組DNA中5’-CG-3’序列較少。第13頁(yè)第13頁(yè)稀有切點(diǎn)限制酶第14頁(yè)第14頁(yè)常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場(chǎng)凝膠電泳3.脈沖凝膠電泳第15頁(yè)第15頁(yè)均一脈沖電泳第16頁(yè)第16頁(yè)3.2基于克隆基因組作圖

---大分子DNA克隆基于克隆基因組作圖：依據(jù)克隆DNA片段之間重疊序列構(gòu)建重疊群(Contig)，繪制物理連鎖圖。第17頁(yè)第17頁(yè)3.2.1克隆作圖載體和辦法常規(guī)質(zhì)粒載體不適合用于大分子DNA克隆。大分子DNA克隆載體構(gòu)建:YAC,BAC,HAC,MAC第18頁(yè)第18頁(yè)酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護(hù)線狀DNA不被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解，以形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。著絲粒：有絲分裂過程中紡錘絲結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分派到子細(xì)胞中。在YAC中起到確保一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體作用。自主復(fù)制序列：一段特殊序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須信號(hào)。第19頁(yè)第19頁(yè)YAC文庫(kù)裝載DNA片段大小普通可達(dá)200-500kb，有可達(dá)1Mb以上。

YAC載體工作原理第20頁(yè)第20頁(yè)YAC主要缺點(diǎn)：

1．存在高百分比嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來(lái)不相連獨(dú)立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中也許會(huì)發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)別開，由于YAC與酵母染色體含有相同結(jié)構(gòu);

4．轉(zhuǎn)化效率低。

第21頁(yè)第21頁(yè)細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建環(huán)狀DNA分子。能夠攜帶不小于100-350Kb外源DNA片段。選擇標(biāo)識(shí)：氯霉素抗性基因等。BAC載體長(zhǎng)處：較為穩(wěn)定；沒有嵌合現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提??；BAC文庫(kù)篩選以便。第22頁(yè)第22頁(yè)基因組文庫(kù)：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生基因組DNA片段隨機(jī)同相應(yīng)載體重組、克隆，所產(chǎn)生克隆群體代表了某種有機(jī)體整個(gè)基因組。1)目的基因組大分子DNA制備；2)載體制備；3)載體和DNA連接；4)轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化子鑒定。YAC和BAC基因組文庫(kù)構(gòu)建第23頁(yè)第23頁(yè)

目的基因組大分子DNA制備樣品→洗滌吸干水分→液氮冷凍→碾碎→離心搜集細(xì)胞核→低融點(diǎn)瓊脂糖包埋→蛋白酶消化→洗滌→限制酶部分酶解第24頁(yè)第24頁(yè)插入大分子DNA分離第25頁(yè)第25頁(yè)載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：制備過程與普通質(zhì)粒載體相同。2)BAC載體：低拷貝載體，大量制備，超離心純化。3)酶切：釋放接頭，接頭去磷，減少自連。4)連接：將含有大分子DNA瓊脂糖薄片與載體混合,按重量比1:1，680C保溫5min，降溫至370C，加入連接酶過夜。第26頁(yè)第26頁(yè)思考題：如何從單條染色體中制備出DNA克隆文庫(kù)？第27頁(yè)第27頁(yè)染色體步移3.2.2重疊群組建互相重疊DNA片段構(gòu)成物理圖稱為重疊群(contig)。構(gòu)建重疊群：步移法和指紋法第28頁(yè)第28頁(yè)

3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊克隆，最好辦法是克隆指紋排序。指紋指克隆DNA序列所含有特定DNA片段構(gòu)成。第29頁(yè)第29頁(yè)限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理第30頁(yè)第30頁(yè)限制性片段指紋電泳圖第31頁(yè)第31頁(yè)指紋重疊群構(gòu)建第32頁(yè)第32頁(yè)酵母基因組遺傳圖與物理圖整合第33頁(yè)第33頁(yè)3.3染色體細(xì)胞圖細(xì)胞圖：通過原位雜交辦法將基因或DNA分子標(biāo)識(shí)定位在染色體某一區(qū)段，由此繪制圖稱為細(xì)胞圖。最慣用細(xì)胞圖繪制技術(shù)為熒光原位雜交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位雜交是以標(biāo)識(shí)DNA分子為探針，檢測(cè)完整染色體一個(gè)雜交分析辦法，其必須使染色體DNA成為單鏈。第34頁(yè)第34頁(yè)熒光原位雜交第35頁(yè)第35頁(yè)一個(gè)封閉雜交探針中重復(fù)序列辦法第36頁(yè)第36頁(yè)限制性作圖不能用于大型基因組；克隆重疊群復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；FISH難于操作，數(shù)據(jù)積累慢。目前最有效物理作圖技術(shù)，也是能對(duì)大型基因組產(chǎn)生最詳盡圖譜技術(shù)，是STS作圖，主要為輻射雜種作圖。3.4序列標(biāo)簽位點(diǎn)

（Sequencetaggedsite,STS）作圖第37頁(yè)第37頁(yè)STS是一段短DNA序列，其長(zhǎng)度通常為100—500bp。一段DNA序列要成為STS需滿足兩個(gè)條件：1.它序列必須是已知，便于PCR檢測(cè)；2.STS必須在擬研究染色體上有唯一定位。第38頁(yè)第38頁(yè)尋找STS辦法1）從EST序列中尋找2）SSLP3）隨機(jī)基因組序列第39頁(yè)第39頁(yè)1.STS在染色體上位置是確定。2.兩個(gè)不同STS出現(xiàn)在同一片段機(jī)會(huì)取決于它們?cè)诨蚪M中位置，彼此靠近，同時(shí)出現(xiàn)在同一片段機(jī)會(huì)就大，反之則小。

輻射雜種作圖原理第40頁(yè)第40頁(yè)STS作圖與連鎖分析是一樣，不同之處僅在于兩個(gè)標(biāo)識(shí)間圖距是依據(jù)分離頻率來(lái)計(jì)算。主要采取方法是輻射雜種作圖。第41頁(yè)第41頁(yè)輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一個(gè)生物染色體片段嚙齒類細(xì)胞。輻射雜種作圖程序與辦法第42頁(yè)第42頁(yè)輻射雜種群PCR檢測(cè)STS標(biāo)識(shí)，依據(jù)成對(duì)STS出現(xiàn)頻率，判斷標(biāo)識(shí)是否連鎖及連鎖程度第43頁(yè)第43頁(yè)輻射雜種圖距單位

輻射雜種作圖單位為厘鐳(centiRay,cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射線劑量下兩個(gè)分子標(biāo)識(shí)之間發(fā)生1%斷裂機(jī)率。利用類似于遺傳重組原理和最大似然性統(tǒng)計(jì)學(xué)辦法來(lái)計(jì)算存在于DNA片段上STS之間斷點(diǎn)頻率，以此預(yù)計(jì)標(biāo)識(shí)之間距離?！禨tatisticalMethodsforMultipointRadiationHybridMapping》第44頁(yè)第44頁(yè)人類21號(hào)染色體輻射雜種圖第45頁(yè)第45頁(yè)人類21號(hào)染色體輻射雜種物理圖第46頁(yè)第46頁(yè)人類基因組物理圖譜:人類基因組序列開始測(cè)定期，已有45萬(wàn)個(gè)EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析篩選后得到49625個(gè)。再?gòu)闹泻Y選出3萬(wàn)個(gè)EST、2個(gè)輻射雜交系庫(kù)（分別有83和93個(gè)細(xì)胞株）、1個(gè)有3個(gè)克隆YAC文庫(kù)，用于構(gòu)建物理圖譜。構(gòu)建物理圖譜密度為每個(gè)標(biāo)識(shí)183Kb。EST分布結(jié)果表明，基因在染色體上排列是不均勻。將物理圖譜和遺傳圖譜整合而成愈加完整人類基因組圖譜，作為基因組測(cè)序框架和分析依據(jù)。第47頁(yè)第47頁(yè)第48頁(yè)第48頁(yè)討論：遺傳圖譜和物理圖譜哪一個(gè)愈加有用？第49頁(yè)第49頁(yè)圖譜應(yīng)用---定位克?。▓D位克?。┒ㄎ豢寺。╬ositionalcloning）：利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體特定區(qū)帶并對(duì)目的基因進(jìn)行克隆。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖遺傳標(biāo)識(shí)在染色體上位置?？寺。簭亩ㄎ蝗旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要基因，并進(jìn)一步研究其功效。第50頁(yè)第50頁(yè)第51頁(yè)第51頁(yè)定位克隆主要目的之一是將目的基因定位于特定染色體上。A-1型短指（趾）癥：法拉比（Farabee）19在他哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報(bào)道了這一病癥，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)典型例子被全世界生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。第52頁(yè)第52頁(yè)賀林等利用布依族、苗族和漢族三個(gè)A-1型短指（趾）癥大家系，對(duì)該病致病基因進(jìn)行了準(zhǔn)擬定位（位點(diǎn)定在2q35-36區(qū)）、克隆，并初次發(fā)覺了人IHH基因和該基因上三個(gè)突變位點(diǎn)是造成A-1型短指（趾）癥直接原因。第53頁(yè)第53頁(yè)番茄抗病基因圖位克隆第54頁(yè)第54頁(yè)定位候選克隆該辦法是定位克隆進(jìn)一步發(fā)展。將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域；該染色體區(qū)域得到若干候選基因；進(jìn)一步分析得到目的cDNA；蛋白質(zhì)功效研究。疾病染色體定位若干候選基因擬定目基因蛋白質(zhì)功效第55頁(yè)第55頁(yè)功效克隆克?。ㄖ虏。┗蛄硪粋€(gè)策略。搜集所要克隆基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功效信息，用以分離基因，并對(duì)基因進(jìn)行定位。性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功效）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計(jì)DNA引物，從文庫(kù)調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病功效基因第56頁(yè)第56頁(yè)分析異?；虍a(chǎn)物（蛋白質(zhì)），弄清它是如何引起臨床癥狀：純化蛋白質(zhì)，進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，據(jù)此推測(cè)也許核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中篩選對(duì)應(yīng)編碼基因；絕大部分分子病、遺傳性代謝缺點(diǎn)病如白化?。╝lbinism）、苯丙酮尿癥（PKU）和鐮刀形細(xì)胞貧血?。╯ickle-celldisease）等，都是采取這一策略。第57頁(yè)第57頁(yè)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)儀熒光染料對(duì)染色體染色。熒光探測(cè)器擬定含有正確染色體液滴發(fā)出信號(hào)，并將一個(gè)電荷加到液滴上第58頁(yè)第58頁(yè)Science：發(fā)覺新抑癌基因SDH5郝淮湘博士從一個(gè)功效未知蛋白入手，發(fā)覺了一個(gè)疾病基因并闡明了其分子功效和致病機(jī)理。

SDH5,aGeneRequiredforFlavinationofSuccinateDehydrogenase,IsMutatedinParagangliomaHuai-XiangHao1,OlehKhalimonchuk2,MargitSchraders3,NoahDephoure4,Jean-PierreBayley5,HenricusKunst6,PeterDevilee7,CorW.R.J.Cremers6,JoshuaD.Schiffman8,BrandonG.Bentz9,StevenP.Gygi4,DennisR.Winge2,HannieKremer3,JaredRutter1*第59頁(yè)第59頁(yè)郝淮湘，一位在美國(guó)諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練80后大男孩，在《Science》上發(fā)表了一篇美麗研究性文章，文章被同期Nature雜志推薦為亮點(diǎn)研究結(jié)果。郝淮湘1999－在廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)就讀，最后一年在長(zhǎng)江學(xué)者林圣彩專家試驗(yàn)室完畢了本科畢業(yè)論文。8月來(lái)到美國(guó)猶他州鹽湖城猶他大學(xué)就讀，第二年加入醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系JaredRutter專家試驗(yàn)室，在其指導(dǎo)下進(jìn)行博士論文研究，年5月答辯。年6月至今，在波士頓劍橋諾華生物醫(yī)學(xué)研究所（NovartisInstitutesforBioMedicalResearch）進(jìn)行博士后訓(xùn)練。第60頁(yè)第60頁(yè)生物通：作為一名80后年輕人，您能夠說(shuō)十分年輕，就已經(jīng)取得生命科學(xué)領(lǐng)域博士學(xué)位，能談?wù)勀鰢?guó)求學(xué)成長(zhǎng)歷程嗎？能夠給我們青年讀者簡(jiǎn)介一下在美國(guó)學(xué)習(xí)感受嗎？郝淮湘：其實(shí)我拿到博士學(xué)位并不算早，花了快要六年（－），有些人四年多就博士畢業(yè)了。來(lái)美國(guó)后第一年主要是上課和在四個(gè)試驗(yàn)室輪轉(zhuǎn)（能夠從快要100個(gè)試驗(yàn)室選擇）。這邊上課沒有教科書，一門課多個(gè)專家講課，諸多時(shí)候都是直接講文獻(xiàn)，一個(gè)部分上完就考一次試，記憶東西不多，主要是分析能力。第二年時(shí)候，我依據(jù)自己興趣和對(duì)導(dǎo)師和課題判斷加入了一個(gè)新成立試驗(yàn)室，跟年輕導(dǎo)師做研究即使會(huì)辛勞一點(diǎn)，但是確實(shí)能學(xué)諸多東西，也有機(jī)會(huì)理解如何建立試驗(yàn)室和從頭構(gòu)思課題。在此后5年里，我接觸了多個(gè)研究項(xiàng)目，一些失敗了，最后有