細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿詳解演示文稿

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有89頁\編輯于星期二（優(yōu)選）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法講稿現(xiàn)在是2頁\一共有89頁\編輯于星期二3熱原熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì)細(xì)胞分裂素（IL-1,IL-2,IL-6,IL-8）內(nèi)源性熱原產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的物質(zhì)內(nèi)毒素?zé)嵩庠葱詿嵩?/p>

非內(nèi)毒素?zé)嵩ú《尽⒓?xì)菌、真菌、抗體-抗原復(fù)合物、細(xì)胞分裂素）現(xiàn)在是3頁\一共有89頁\編輯于星期二4細(xì)菌內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組分之一化學(xué)結(jié)構(gòu)含有3個不同的區(qū)域

O-特異側(cè)鏈

核心多糖

類脂A

現(xiàn)在是4頁\一共有89頁\編輯于星期二5細(xì)菌內(nèi)毒素致熱性內(nèi)毒素作用于人體細(xì)胞，使之釋放內(nèi)原性熱原，再刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)耐熱性分子極性多糖鏈有親水性，脂肪鏈具有疏水性在水中呈不均勻分布酸堿性與強酸強堿水解反應(yīng)鱟反應(yīng)性現(xiàn)在是5頁\一共有89頁\編輯于星期二6C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原二價陽離子β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子G因子細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機理能與鱟的血液提取物可發(fā)生發(fā)生多級酶促反應(yīng)，形成凝膠現(xiàn)在是6頁\一共有89頁\編輯于星期二7細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法反應(yīng)機理在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）條件下進行藥品生產(chǎn)的質(zhì)量控制，一般可以接受的觀點是，不存在內(nèi)毒素就意味著不存在熱原通過檢測內(nèi)毒素控制藥品中的熱原現(xiàn)在是7頁\一共有89頁\編輯于星期二8Boc-leu-Gly-Arg-PNA（鱟三肽）活化的C因子C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子顯色法凝膠法，濁度法凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝膠）凝固蛋白原β(1,3)-D-葡聚糖或LAL-RM活化的G因子（旁路反應(yīng)）G因子現(xiàn)在是8頁\一共有89頁\編輯于星期二9細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法定義：本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹

現(xiàn)在是9頁\一共有89頁\編輯于星期二10細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括：限量實驗?zāi)z法半定量實驗可使用其中任何一種方法進行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。

濁度法動態(tài)濁度法光度測定法終點濁度法顯色基質(zhì)法動態(tài)顯色法終點顯色法

二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法介紹

現(xiàn)在是10頁\一共有89頁\編輯于星期二11

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法現(xiàn)在是11頁\一共有89頁\編輯于星期二12細(xì)菌內(nèi)毒素檢查----------凝膠法

1、綜述部分實驗原理實驗準(zhǔn)備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）2、實驗部分鱟試劑靈敏度復(fù)核干擾實驗：預(yù)實驗正式干擾實驗檢查法：限量試驗半定量試驗現(xiàn)在是12頁\一共有89頁\編輯于星期二13C因子活化的C因子內(nèi)毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白原凝固蛋白（凝膠）二價陽離子1、凝膠法實驗原理現(xiàn)在是13頁\一共有89頁\編輯于星期二1437±1℃下保溫反應(yīng)602分鐘當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度達(dá)到或超過鱟試劑的靈敏度時，凝集為堅實凝膠，為陽性，記為“+”。當(dāng)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度未達(dá)到鱟試劑的靈敏度時，不能凝集為堅實凝膠，為陰性，記為“—”。1、凝膠法實驗原理現(xiàn)在是14頁\一共有89頁\編輯于星期二152、凝膠法實驗的準(zhǔn)備實驗所需物品細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水凝膠法鱟試劑漩渦混合器適宜的恒溫器37±1℃電熱干燥箱250℃實驗器械等現(xiàn)在是15頁\一共有89頁\編輯于星期二16細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)國家標(biāo)準(zhǔn)品以內(nèi)毒素國際標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價

150600-20070710000EU/支工作標(biāo)準(zhǔn)品以內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定效價

150601-200862120EU/支2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是16頁\一共有89頁\編輯于星期二17細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水。2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是17頁\一共有89頁\編輯于星期二18凝膠法鱟試劑8個鱟試劑廠家靈敏度0.5~0.03EU/ml規(guī)格0.5ml、0.1ml等

2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是18頁\一共有89頁\編輯于星期二19漩渦混合器

2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是19頁\一共有89頁\編輯于星期二20適宜的恒溫器恒溫水浴恒溫培養(yǎng)箱干熱恒溫器

2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是20頁\一共有89頁\編輯于星期二21試驗器械的要求移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是21頁\一共有89頁\編輯于星期二22試驗器械的要求若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是22頁\一共有89頁\編輯于星期二23供試品溶液的制備某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。2、凝膠法實驗的準(zhǔn)備現(xiàn)在是23頁\一共有89頁\編輯于星期二243、限值（L）的確定《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)、國家藥品標(biāo)準(zhǔn)藥品、生物制品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定：L=K/M現(xiàn)在是24頁\一共有89頁\編輯于星期二253、限值（L）的確定L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/kg/h表示。其中注射劑，K＝5EU/kg/h；放射性藥品注射劑，K＝2.5EU/kg/h；鞘內(nèi)用藥品，K=0.2EU/kg/h。M為人用每公斤體重每小時最大劑量，以ml/kg/h、mg/kg/h、U/kg/h表示。藥品人用最大劑量可參閱《臨床用藥須知》或藥品使用說明書。中國人均體重按60kg計算，注射時間小于1小時的按1小時計。現(xiàn)在是25頁\一共有89頁\編輯于星期二263、限值（L）的確定計算舉例：注射用阿莫西林鈉

根據(jù)國家藥典委員會編纂的《臨床用藥須知》:

“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一次0.5~1g，一日3~4次；小兒按體重每日50~100mg/kg，分3~4次靜脈滴注。”M成人=1000mg/h÷60kg=16.67mg/(kg·h)

M兒童=100mg/(kg·h)÷3=33.3mg/(kg·h)L=K/M=5EU/(kg·h)÷33.3mg/(kg·h)=0.150EU/mg現(xiàn)在是26頁\一共有89頁\編輯于星期二273、限值（L）的確定限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況從嚴(yán)原則聯(lián)合用藥特殊情況等現(xiàn)在是27頁\一共有89頁\編輯于星期二284、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。

MVD=cL/λ現(xiàn)在是28頁\一共有89頁\編輯于星期二294、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）MVD=cL/λL：供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值c：供試品溶液的濃度λ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml）現(xiàn)在是29頁\一共有89頁\編輯于星期二304、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）計算舉例：a、當(dāng)L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml

適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/ml。例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，則

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍現(xiàn)在是30頁\一共有89頁\編輯于星期二314、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）計算舉例：b、當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時，濃度c的單位需為mg/ml或U/ml。適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xxEU/mg或EU/U。

現(xiàn)在是31頁\一共有89頁\編輯于星期二324、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）例：注射用阿莫西林鈉

計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉,在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。

MVD=20mg/ml0.15EU/mg÷0.125EU/ml=24倍現(xiàn)在是32頁\一共有89頁\編輯于星期二334、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=λ/L；

適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。例：注射用阿莫西林鈉

計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。最小有效稀釋濃度c=

0.125EU/ml÷0.15EU/mg=0.833mg/ml

現(xiàn)在是33頁\一共有89頁\編輯于星期二34細(xì)菌內(nèi)毒素檢查----------凝膠法

2、實驗部分鱟試劑靈敏度復(fù)核干擾實驗：預(yù)實驗正式干擾實驗檢查法：限量試驗半定量試驗現(xiàn)在是34頁\一共有89頁\編輯于星期二35鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗?zāi)康模翰粌H是考察鱟試劑靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考查檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。要求每個實驗室在使用一批新的鱟試劑前必須進行鱟試劑靈敏度復(fù)核實驗。現(xiàn)在是35頁\一共有89頁\編輯于星期二36鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗實驗操作:取細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘?，F(xiàn)在是36頁\一共有89頁\編輯于星期二37鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ

陰性對照

鱟試劑

平行管

現(xiàn)在是37頁\一共有89頁\編輯于星期二38鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。現(xiàn)在是38頁\一共有89頁\編輯于星期二39堅實凝膠陽性“+”現(xiàn)在是39頁\一共有89頁\編輯于星期二40未形成凝膠凝膠不堅實陰性“—”現(xiàn)在是40頁\一共有89頁\編輯于星期二41鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果判斷：

若最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。結(jié)果計算：

反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。

λc=lg-1（∑X/4）式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度?，F(xiàn)在是41頁\一共有89頁\編輯于星期二42鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗內(nèi)毒素濃度2λλ0.5λ0.25λ陰性對照終點

鱟試劑

平行管

+—

λ

λ0.5λ0.5λλc=

lg-1（(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4)=0.707λ+++++++++———————現(xiàn)在是42頁\一共有89頁\編輯于星期二43鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度?，F(xiàn)在是43頁\一共有89頁\編輯于星期二44凝膠法干擾試驗?zāi)康模菏谴_定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。未進行過內(nèi)毒素檢查法驗證的樣品當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，或供試品陽性對照結(jié)果呈陰性時驗證供試品是否存在干擾作用。

現(xiàn)在是44頁\一共有89頁\編輯于星期二45凝膠法干擾試驗試驗操作：在干擾試驗中，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液。解釋：即與所使用的鱟試劑反應(yīng)，不出現(xiàn)陽性的供試品溶液?，F(xiàn)在是45頁\一共有89頁\編輯于星期二46凝膠法干擾試驗試驗操作：預(yù)試驗正式干擾實驗現(xiàn)在是46頁\一共有89頁\編輯于星期二47凝膠法干擾試驗預(yù)試驗?zāi)康模撼醪酱_定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/u活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)。優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本現(xiàn)在是47頁\一共有89頁\編輯于星期二48凝膠法干擾試驗預(yù)試驗將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋。使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即含2.0λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）。另做2支陰性對照，和2支陽性對照?，F(xiàn)在是48頁\一共有89頁\編輯于星期二49凝膠法干擾試驗預(yù)試驗——結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。現(xiàn)在是49頁\一共有89頁\編輯于星期二50凝膠法干擾試驗預(yù)試驗舉例供試品限值硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U現(xiàn)在是50頁\一共有89頁\編輯于星期二51凝膠法干擾試驗預(yù)試驗舉例系列稀釋倍數(shù)的確定稀釋倍數(shù)一般為MVD0.5~MVD0.03，不大于MVD0.03。MVD0.5=cL/λ=由此可計算出使用不同λ時所對應(yīng)的MVD：=20（倍）0.5EU/ml20000U/ml×0.5EU/1000U靈敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對應(yīng)的MVD（倍）204080160320現(xiàn)在是51頁\一共有89頁\編輯于星期二52凝膠法干擾試驗預(yù)試驗試驗結(jié)果稀釋倍數(shù)

原液20倍40倍80倍160倍320倍樣品溶液PPCNCPC--++如上結(jié)果可初步確定該批硫酸慶大霉素的最小不干擾稀釋倍數(shù)為80倍，可在此濃度下進行正式干擾實驗。-----+++++++------------現(xiàn)在是52頁\一共有89頁\編輯于星期二53凝膠法干擾試驗正式干擾試驗?zāi)康模簷z驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用?，F(xiàn)在是53頁\一共有89頁\編輯于星期二54凝膠法干擾試驗正式干擾試驗?zāi)康模簷z驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。現(xiàn)在是54頁\一共有89頁\編輯于星期二55凝膠法干擾試驗正式干擾試驗操作：內(nèi)毒素檢查用水同一支內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品供試品溶液同時制備2支供試品陰性對照和2支陰性對照。

含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液含2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素的供試品溶液

現(xiàn)在是55頁\一共有89頁\編輯于星期二56凝膠法干擾試驗

正式干擾試驗結(jié)果判斷：當(dāng)供試品陰性對照和陰性對照都為陰性用檢查用水稀釋的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時試驗方為有效現(xiàn)在是56頁\一共有89頁\編輯于星期二57凝膠法干擾試驗

正式干擾試驗分別計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）。

Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)當(dāng)Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用?，F(xiàn)在是57頁\一共有89頁\編輯于星期二58凝膠法干擾試驗

正式干擾試驗試驗舉例硫酸慶大霉素根據(jù)干擾初篩試驗的結(jié)果，供試品在80倍稀釋時無干擾（對應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml）選擇將供試品稀釋80倍進行干擾驗證試驗。選用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑現(xiàn)在是58頁\一共有89頁\編輯于星期二59凝膠法干擾試驗

正式干擾試驗試驗舉例制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液

方法1：標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解用硫酸慶大霉素80倍稀釋溶液將內(nèi)毒素稀釋至2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的濃度現(xiàn)在是59頁\一共有89頁\編輯于星期二60凝膠法干擾試驗

正式干擾試驗試驗舉例制備含內(nèi)毒素的供試品80倍稀釋溶液

方法2：標(biāo)準(zhǔn)品+1ml檢查用水溶解用檢查用水將內(nèi)毒素稀釋至4.0λ、2.0λ、λ、0.5λ0.5ml4.0λ內(nèi)毒素溶液

1ml含2.0λ內(nèi)毒素的80倍稀釋溶液……0.5ml40倍稀釋溶液現(xiàn)在是60頁\一共有89頁\編輯于星期二61內(nèi)毒素濃度0.250.1250.060.03EU/ml內(nèi)毒素/檢查用水陰性對照內(nèi)毒素/供試品80倍稀釋溶液供試品80倍稀釋溶液陰性對照現(xiàn)在是61頁\一共有89頁\編輯于星期二62內(nèi)毒素濃度0.250.1250.060.03終點內(nèi)毒素/檢查用水陰性對照內(nèi)毒素/供試品80倍稀釋溶液供試品80倍稀釋溶液陰性對照

Es=lg-1(ΣXs/4)=0.125Et=lg-1(ΣXt/4)=0.1770.1250.1250.250.250.1250.1250.1250.125現(xiàn)在是62頁\一共有89頁\編輯于星期二63凝膠法干擾試驗

導(dǎo)致干擾的因素：pH值抗凝因子螯合劑葡聚糖…….現(xiàn)在是63頁\一共有89頁\編輯于星期二64凝膠法干擾試驗

排除干擾的方法：稀釋中和過濾加熱……現(xiàn)在是64頁\一共有89頁\編輯于星期二65凝膠法干擾試驗

為確保所選擇的處理方法能有效的排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。即，先在供試品溶液中添加2λ濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，然后用所選擇的方法處理溶液，而后再進行稀釋、檢測?，F(xiàn)在是65頁\一共有89頁\編輯于星期二66凝膠法干擾試驗

由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成的陽性影響?，F(xiàn)在是66頁\一共有89頁\編輯于星期二67凝膠法干擾試驗

當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進行干擾試驗。須：三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑。當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時現(xiàn)在是67頁\一共有89頁\編輯于星期二68凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗檢驗供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限值的定性方法。每批供試品必須做

2支供試品管

2支供試品陽性對照

同時

每次實驗須做2支陽性對照和2支陰性對照。

現(xiàn)在是68頁\一共有89頁\編輯于星期二69凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照供試品溶液：4倍替硝唑稀釋液供試品陽性對照為：含0.25EU/ml標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的4倍替硝唑稀釋液陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液現(xiàn)在是69頁\一共有89頁\編輯于星期二70凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照++--++試驗有效現(xiàn)在是70頁\一共有89頁\編輯于星期二71凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照++--++--

此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定?，F(xiàn)在是71頁\一共有89頁\編輯于星期二72凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照

此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，

不符合規(guī)定。++++++--現(xiàn)在是72頁\一共有89頁\編輯于星期二73凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算

MVD=1.0ml/ml0.5EU/ml÷0.125EU/ml=4倍供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照

須復(fù)試。---+++++現(xiàn)在是73頁\一共有89頁\編輯于星期二74凝膠法----檢查法

凝膠限量試驗復(fù)試時，供試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品陽性對照陰性對照陽性對照--++++現(xiàn)在是74頁\一共有89頁\編輯于星期二75凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗半定量試驗是使用凝膠法估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法。系通過確定反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。現(xiàn)在是75頁\一共有89頁\編輯于星期二76凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD?，F(xiàn)在是76頁\一共有89頁\編輯于星期二77編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A

無/供試品溶液檢查用水1248—2222B2λ/供試品溶液12λC2λ/檢查用水檢查用水12482λ1λ0.5λ0.25λ2222D無/檢查用水———2A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液。B：供試品陽性對照。（為確證不存在干擾作用）C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列。（為確證本次試驗的操作和環(huán)境都符合要求。）D：陰性對照。

現(xiàn)在是77頁\一共有89頁\編輯于星期二78凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗結(jié)果判斷：當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.5λ～2λ之間試驗有效現(xiàn)在是78頁\一共有89頁\編輯于星期二79凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗結(jié)果計算：內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液APPC溶液BNC溶液D現(xiàn)在是79頁\一共有89頁\編輯于星期二80凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗結(jié)果計算：內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C0.5λλ稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液APPC溶液BNC溶液Dλc=lg-1（∑X/2）=0.707λ，在0.5λ～2λ之間

仍以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。現(xiàn)在是80頁\一共有89頁\編輯于星期二81凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗結(jié)果計算：內(nèi)毒素濃度2.0λλ0.5λ0.25λ終點標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液C0.5λλ稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A4λ2λPPC溶液BNC溶液DCE=lg-1（∑X/2）=lg-1（（lg4λ+lg2λ）

/2）=2.83λ

現(xiàn)在是81頁\一共有89頁\編輯于星期二82凝膠法----檢查法

凝膠半定量試驗結(jié)果計算：如果檢驗時采用的是供試