液相基本原理和主要分離的類型

液相基本原理和主要分離的類型2023/4/12第1頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日一、液-固吸附色譜

liquid-solidadsorption

chromatography

固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2023/4/12第2頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān)溶質(zhì)分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑

溶劑系統(tǒng)極性↑，洗脫能力↑，k↓，tR↓注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%分配色譜硅膠失活→載體吸附的水→固定液2023/4/12第3頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日練習(xí)：1.在液相色譜中，吸附色譜特別適合于分離（），梯度洗脫用于分離（）A異構(gòu)體B沸點(diǎn)相近，官能團(tuán)相同的試樣C沸點(diǎn)相差大的試樣D極性范圍變化寬的試樣2.吸附作用在下面哪種色譜方法中起主要作用（）A液液色譜B液固色譜C鍵合相色譜D離子交換色譜法3.在液相色譜中，常用作固定相，又可用作鍵合相基體的物質(zhì)是()A分子篩B硅膠C氧化鋁D活性炭2023/4/12第4頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日二、化學(xué)鍵合相色譜

Chemicallybondedphases

chromatography固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；

流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

Chemicallybondedstationaryphases

：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2023/4/12第5頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/4/12第6頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2023/4/12第7頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日（一）反相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：疏溶劑理論流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力強(qiáng)，作用時(shí)間↑

k↑，組分tR↑

流動(dòng)相與溶質(zhì)排斥力弱，作用時(shí)間↓，

k↓，組分tR↓2．固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）3．流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性>固定相極性底劑+有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF2023/4/12第8頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日（二）正相鍵合相色譜1．分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相3．流動(dòng)相：極性?。ㄍ琇SC）底劑+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2023/4/12第9頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等2023/4/12第10頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日練習(xí)：1.在150cm×φ2mm硅膠柱中流動(dòng)相為己烷/甲醇（150:2），紫外檢測(cè)器條件下分離丙烯酰胺，判斷以下組分的出峰順序，為什么？

AB2.在硅膠柱上，用甲苯為流動(dòng)相，某組分的保留時(shí)間為30min，如果改用四氯化碳或乙醚為流動(dòng)相，試指出選用哪種溶劑能減小該組分的保留時(shí)間？為什么？2023/4/12第11頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日3.測(cè)定鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯胺，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動(dòng)相：水/甲醇，異丙醚/己烷，應(yīng)選用哪種固定相和流動(dòng)相？為什么？2023/4/12第12頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日三、離子交換色譜

ion-exchange

chromatography

固定相：cationexchangeresinsoranionexchangeresins;

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）

2023/4/12第13頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

流動(dòng)相：

陰離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/4/12第14頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日四、離子色譜

ionchromatography

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。有關(guān)內(nèi)容將在第八章第六節(jié)中講授。2023/4/12第15頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日五、離子對(duì)色譜

ionpairchromatography

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子；

反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+

X-后；在兩相間分配。適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿2023/4/12第16頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。六、排阻色譜色譜

size-exclusionchromatography固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；2023/4/12第17頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日

原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2023/4/12第18頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日七、親和色譜(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2023/4/12第19頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日八、分離類型選擇

choiceofseparationtypes2023/4/12第20頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日1．根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇相對(duì)分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液一固、液一液、及離子交換色譜）最適合的相對(duì)分子質(zhì)量范圍是20O～2000。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。2．根據(jù)溶解度選擇弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采2023/4/12第21頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日用液一固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時(shí)，常用水和異丙醇的混合液作液一液分配色譜的流動(dòng)相，以憎水性化合物作固定相。3．根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇用紅外光譜法，可預(yù)先簡(jiǎn)單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液一液分配色譜、液一固吸附色譜；異構(gòu)體用液一固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的用液一液分配色譜。

2023/4/12第22頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日九、HPLC的應(yīng)用

applicationofHPLC

1.環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動(dòng)相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器

可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。2023/4/12第23頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日2.稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動(dòng)相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器2023/4/12第24頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日1.高效液相色譜法之所以高效，是由于采用（）A較高的流動(dòng)相速率B高靈敏的檢測(cè)器C粒徑小，孔淺而且均一的填料2.下列檢測(cè)器不能用于梯度洗脫的是（）A紫外吸收檢測(cè)器B示差折光檢測(cè)器C熒光檢測(cè)器3.在高效液相色譜中，溶劑極性降低，溶質(zhì)保留值會(huì)降低的是（）A正相液相色譜B反相液相色譜C尺寸排阻色譜2023/4/12第25頁，共28頁，2023年，2月20日，星期日4.尺寸排阻色譜中，A組分的相對(duì)分子質(zhì)量是B組分的2倍，兩者的相對(duì)分子質(zhì)量都在該柱的相對(duì)分子質(zhì)量分離范圍內(nèi)，那么出峰順序?yàn)椋?AB、ABA、BC同時(shí)流出5.采用離子交換色譜分離酚類樣品時(shí)，流動(dòng)相pH從比它的pKa小一個(gè)單位，改變到大一個(gè)單位