三聚氰胺檢測方法

三聚氤胺檢測方法檢測方法利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氤胺的定量測定。檢測原理酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氤胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氤胺進(jìn)行免疫測定。先將三聚氤胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氤胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氤胺與三聚氤胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氤胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氤胺及三聚氤胺酶標(biāo)記物。在用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氤胺的的濃度值。實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備及材料三聚氤胺檢測試劑盒（目前常用進(jìn)口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的）酶標(biāo)儀一臺(tái)（配有450nm濾光片）1—5ml可調(diào)移液器100—1000ul可調(diào)移液器.20—200ul可調(diào)移液器.蒸餾水或去離子水..可吸取50ul的移液器及吸頭.可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧?450nm的酶標(biāo)儀.計(jì)時(shí)器.洗瓶混旋器.20mMPBS：0.62gNaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl，蒸餾水定容至1000ml.注意事項(xiàng)最好配套使用試劑，不要同其它公司的產(chǎn)品混用，不要將不同批次的產(chǎn)品混用。樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。不要使用過期的產(chǎn)品。使用之前將所有試劑回升全室溫，但不要放置超過24小時(shí)。三聚氤胺屬于有毒性的化學(xué)品，請小心處理。停止液是1N鹽酸，避免接觸皮膚。樣品制備（以美國Beacon試劑為例）濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：100）均質(zhì)樣品全布丁狀。稱取2g樣品加入10mL60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。3000g室溫離心5分鐘。用玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL10%甲醇/20mMPBS）移取150ul進(jìn)行分析。注意：用此方法測定了8個(gè)添加有15ppm三聚氰胺的貓糧（非要求召回），回收率范圍為75%-117%。本方法只可作為樣品篩選方法，不可作為最終確認(rèn)方法。小麥面筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數(shù)：500）均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品。稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL酸化的60%甲醇/水溶液（1mL1NHCl/100mL60%甲醇/水）。漩渦混合并超聲萃取，使樣品溶解（確保樣品中沒有結(jié)塊）。用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL10%MeOH/20mMPBS）。5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘。用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。移取150ul進(jìn)行分析。注意：如果樣品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保證萃取效率。操作人依據(jù)自己的判斷力，如果測試結(jié)果比較高，需要加入兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進(jìn)行二次測定。干的寵物食品萃取方法（稀釋倍數(shù)：200）質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品。稱取1g樣品加入10mL60%甲醇/水溶液，并劇烈振蕩。超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘，然后靜置5分鐘，使樣品分層。4.3000g室溫離心5分鐘。用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液，并將萃取液收集于一干凈試管中。用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL10%甲醇/20mMPBS）移取150ul進(jìn)行分析。免疫測定過程（注意：標(biāo)準(zhǔn)及樣品最好做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確度）將所有試劑及樣品回升全室溫20-280C，但不要放置超過24小時(shí)。從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)、樣品到對應(yīng)微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。加入50ul三聚氤胺酶標(biāo)記溶液到每個(gè)小孔中?；旌?0秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘。將微孔中的溶液倒入水槽中，用蒸餾水完全充滿微孔，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板。在吸水紙上拍打，盡可能將水拍十。每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液。20-28攝氏度下，孵育30分鐘。每個(gè)微孔中加入100ul停止液。450nm下讀板。結(jié)果分析半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡單對比而來判定:樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺則三聚氤胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高，樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氤胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸，以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣吸