化妝品的微生物學檢查

第八章

化妝品的微生物學檢查1第一頁，共四十六頁?；瘖y品的衛(wèi)生標準化妝品微生物學檢查基礎知識化妝品中微生物總數(shù)檢查化妝品中控制菌檢查2第二頁，共四十六頁。一、2007版“化妝品衛(wèi)生規(guī)范”粘膜用、嬰兒及兒童用化妝品眼部及口唇等細菌菌落總數(shù)不得大于500CFU/mL或500CFU/g。其他化妝品細菌菌落總數(shù)不得大于1000CFU/mL或1000CFU/g3第三頁，共四十六頁。所有化妝品霉菌和酵母菌總數(shù)不得大于100CFU／mL或100CFU／g每克或每毫升產(chǎn)品中不得檢出糞大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。4第四頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識1.采樣采樣應具有代表性。從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL作為檢驗量。樣品應嚴格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。及時檢驗的樣品應放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。5第五頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識1.采樣若樣品需同時做多種分析，如細菌、毒理、化學等，則宜先取出部分樣品做細菌檢驗，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在無菌室內(nèi)進行，或在相應條件下，按無菌操作規(guī)定進行。6第六頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識1.采樣如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應保存一個月。7第七頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識2.供檢樣品（供試品）的制備水溶性液體樣品樣品10mL90mL生理鹽水1:10供試液8第八頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識2.供檢樣品（供試品）的制備油性液體樣品②5mL滅菌液體石蠟1:10供試液均質(zhì)器③10mL滅菌吐溫8040~44℃①10mL樣品混勻10min④75mL40~44℃滅菌生理鹽水40~44℃乳化9第九頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識2.供檢樣品（供試品）的制備親水性半固體（膏、霜、乳劑）樣品振蕩②90mL生理鹽水上清液作為1:10供試液①10g樣品15min膏、霜劑若用均質(zhì)器，混合均質(zhì)1~2min即可。10第十頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識2.供檢樣品（供試品）的制備疏水性半固體樣品②10mL滅菌液體石蠟1:10供試液均質(zhì)器③10mL滅菌吐溫8040~44℃①10g樣品混勻10min④70mL40~44℃滅菌生理鹽水40~44℃乳化膏、霜劑若用均質(zhì)器，混合均質(zhì)3~5min即可。11第十一頁，共四十六頁。二、檢查的必備知識2.供檢樣品（供試品）的制備固體樣品振蕩②90mL生理鹽水上清液作為1:10供試液①10g樣品15min12第十二頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查1.意義測定總數(shù)主要是作為判定化妝品被細菌、霉菌及酵母菌污染程度的標記，也可以觀察化妝品中細菌、霉菌及酵母菌的性質(zhì)和在化妝品中的繁殖動態(tài)，以便對樣品進行衛(wèi)生學評價時提供科學依據(jù)。13第十三頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查2.培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和時間檢查菌培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間細菌卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)肉湯瓊脂36℃±1℃48h±2h真菌虎紅瓊脂28℃±2℃72h±2h14第十四頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查3.方法－平皿法數(shù)據(jù)處理混合平板的制備細菌、真菌的培養(yǎng)檢查結(jié)果、觀察與計數(shù)供試液的制備書寫檢驗記錄單15第十五頁，共四十六頁。

細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)的操作過程10-110-210-210-110-110-210-2

10-1對照對照對照對照1.0ml倒置培養(yǎng)48h±1h36℃±1℃卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)肉湯瓊脂28℃±2℃虎紅瓊脂倒置培養(yǎng)72h±2h9.0ml

稀釋液10g/ml供試品

9.0ml10-210-11.0ml16第十六頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查4.操作注意事項1.盡量使菌細胞分散開，使每個菌細胞生成一個菌落，否則將會導致重大的技術(shù)誤差。

2.為防止細菌增殖及產(chǎn)生菌苔，制成供試液后，應盡快稀釋，注皿。一般稀釋后應在1小時內(nèi)操作完畢。17第十七頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查4.操作注意事項3.使用吸量管時，應小心沿管壁加入，不用觸及管內(nèi)溶液，以防吸管尖端外側(cè)黏附的溶液混入其中。

4.注意抑菌現(xiàn)象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計數(shù)結(jié)果受影響，如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數(shù)反而增大。遇此情況應重復檢驗，以確定是防腐劑影響還是操作技術(shù)誤差。18第十八頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查4.操作注意事項5.為檢查和控制滅菌效果，應做空白對照，以檢驗所使用的物品是否徹底滅菌及檢驗過程是否無菌操作。

6.為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有細菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。19第十九頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查5.菌落計數(shù)及報告方法

宜選取細菌、酵母菌平均菌落數(shù)30~300之間、霉菌平均菌落數(shù)5~50之間的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。（1）當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù);（2）若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30個～300個之間，則應求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應報告其平均數(shù)，若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)20第二十頁，共四十六頁。三、細菌、真菌總數(shù)檢查5.菌落計數(shù)及報告方法（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之;（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之;

（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之；（6）若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL小于10CFU;21第二十一頁，共四十六頁。例次不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù)(CFU/mL或CFU/g)報告方式(CFU/mL或CFU/g)10-110-210-31136516420-1640016000或1.6*10422760295461.63800038000或3.8*10432890271602.22710027100或2.7*1044不可計4650513-513000513000或5.1*105527115-270270或2.7*1026不可計30512-3050031000或3.1*1047000-<1*1022第二十二頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查項目（1）陰性對照試驗：應無菌生長。（2）陽性對照試驗：供試品+陽性對照菌，應檢出相應的陽性對照菌。（3）供試品控制菌檢查：依相應的檢查方法進行。23第二十三頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程供試品增菌培養(yǎng)分離培養(yǎng)純培養(yǎng)染色鏡檢生化反應試驗報告結(jié)果24第二十四頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程1.增菌培養(yǎng)目的使被檢藥物中的被檢菌增殖，避免出現(xiàn)漏檢。25第二十五頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程2.分離培養(yǎng)目的經(jīng)增殖培養(yǎng)后,被檢菌大量繁殖，同時其他一些雜菌也出現(xiàn)增殖。因此分離培養(yǎng)能使目的菌從混合菌中分離出來。26第二十六頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程3.純培養(yǎng)目的只是大量增殖被檢菌，用于后面的進一步檢驗。27第二十七頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程4.染色鏡檢目的初步鑒定，觀察細菌的形態(tài)大小。28第二十八頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－檢查流程5.生化試驗目的最終的鑒定依據(jù)，結(jié)合染色鏡檢得出實驗結(jié)果，填寫檢驗報告。29第二十九頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－糞大腸菌群檢查★糞大腸菌群糞大腸菌群系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h～48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。30第三十頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－糞大腸菌群檢查★糞大腸菌群檢查意義糞大腸菌群主要存在于溫血動物糞便中，隨糞便排出體外后可直接污染化妝品，若產(chǎn)品中檢出該菌群，表明該產(chǎn)品受到糞便污染，可能存在腸道致病菌并引起疾病，是評價化妝品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標之一。31第三十一頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－糞大腸菌群檢查產(chǎn)酸：黃色產(chǎn)氣：氣泡產(chǎn)酸產(chǎn)氣書寫檢驗記錄單不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣增菌培養(yǎng)供試液的制備配培養(yǎng)基和稀釋液檢查結(jié)果判斷44±0.5℃24~28h分離培養(yǎng)蛋白胨水培養(yǎng)最終結(jié)果判斷44±0.5℃24±2h靛基質(zhì)特征菌落36±1℃18~24h雙倍膽鹽乳糖MEMB瓊脂液面玫瑰紅色紫黑色★糞大腸菌群檢查流程圖32第三十二頁，共四十六頁。雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基EMB瓊脂培養(yǎng)基靛基質(zhì)試驗氣泡，培養(yǎng)基呈黃色紫黑色金屬光澤玫瑰紅色液面33第三十三頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－糞大腸菌群檢查★糞大腸菌群檢查結(jié)果報告

根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。34第三十四頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－銅綠假單胞菌檢查★銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42℃±1℃條件下能生長。35第三十五頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－銅綠假單胞菌檢查★銅綠假單胞菌檢查意義銅綠假單胞菌在特殊情況下可引起皮膚化膿感染、泌尿道感染、中耳炎等。外傷及燒傷患者感染后最易引起化膿，并引起敗血癥。為保證消費者安全，化妝品中不得檢出銅綠假單胞菌。36第三十六頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－銅綠假單胞菌檢查最終結(jié)果判斷增菌培養(yǎng)供試液的制備書寫檢驗記錄單分離純化無菌落或無特征菌落配培養(yǎng)基和稀釋液革蘭染色、鏡檢→氧化酶試驗綠膿菌素試驗生化試驗硝酸鹽還原試驗

42℃生長試驗明膠液化試驗★銅綠假單胞菌檢查流程圖SCDLP培養(yǎng)基十六烷三甲基溴化銨瓊脂36±1℃18~24h36±1℃18~24h特征菌落灰白色、扁平、周圍有水溶性藍綠色素37第三十七頁，共四十六頁。十六烷三甲基溴化銨平板SCDLP培養(yǎng)基黃綠色菌膜灰白色濕潤氧化酶試驗粉紅/紫紅色38第三十八頁，共四十六頁。綠膿菌素試驗鹽酸層呈粉紫色氯仿層呈藍綠色硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗N2明膠液化試驗明膠培養(yǎng)基（高層）明膠液化39第三十九頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－銅綠假單胞菌檢查★銅綠假單胞菌檢查結(jié)果報告

被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。40第四十頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－金黃色葡萄球菌檢查★金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。41第四十一頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－金黃色葡萄球菌檢查★金黃色葡萄球菌檢查意義

金黃色葡萄球菌在外界分布較廣，抵抗力也較強，能引起人體局部化臟性病灶，嚴重時可導致敗血癥，因此化妝品中檢驗金黃色葡萄球菌有重要意義。42第四十二頁，共四十六頁。四、控制菌檢查－金黃色葡萄球菌檢查革蘭染色、鏡檢→生化試驗:血漿凝固酶試驗甘露醇發(fā)酵試驗最終結(jié)果判斷增菌培養(yǎng)供試品的處理書寫檢驗記錄單分離純化無菌落或無特征菌落配培養(yǎng)基和稀釋液36±1℃36±1℃SCDLP培