探討TLR7通路活化對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞表達(dá)CD5的影響,分子生物學(xué)論文

探討TLR7通路活化對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞表達(dá)CD5的影響,分子生物學(xué)論文表示出CD5抗原的B細(xì)胞即B1a細(xì)胞廣泛分布于小鼠胸腔和腹腔,也存在于脾臟中,約占其B細(xì)胞總量的5%.這種細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種多反響性及親和力低的本身抗體,并且能夠分泌具有免疫抑制作用的IL-10[1].TLR7受體是一種形式辨別受體,能夠辨別病原相關(guān)形式分子進(jìn)而引發(fā)先天性免疫反響并起始獲得性免疫反響[2].已經(jīng)知道TLR7沖動(dòng)劑能夠使NaiveB細(xì)胞增殖及活化,且促進(jìn)其產(chǎn)生趨化因子、造血生長(zhǎng)因子以及其他細(xì)胞因子如IL-6和IL-10[3,4].重要的是,小鼠B細(xì)胞分泌的IL-10主要來自于CD5+B細(xì)胞[5-7].固然激活TLR7能促進(jìn)小鼠B細(xì)胞分泌IL-10,但TLR7沖動(dòng)劑能否影響B(tài)細(xì)胞表示出CD5迄今尚無報(bào)道.為此,本文用B220+磁珠從小鼠脾臟細(xì)胞中分選出B細(xì)胞,在體外用TLR7沖動(dòng)劑處理,觀察TLR7沖動(dòng)劑對(duì)分泌IL-10的CD5+B細(xì)胞的比例變化,并分析TLR7沖動(dòng)劑對(duì)于B細(xì)胞表示出CD5的比例及其MFI的變化,以討論TLR7通路活化對(duì)小鼠脾臟B細(xì)胞表示出CD5的影響.1材料與方式方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57/B6小鼠,購于南京大學(xué)形式動(dòng)物研究所.1.1.2主要試劑與儀器PE-anti-CD5、IL-10-APC、小鼠B220+陽性選擇磁珠及其分離產(chǎn)品購自Milte-nyi公司;R848(TLR7沖動(dòng)劑)購自Sigma公司;抑制劑PDTC(NF-B抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)以及PD98059(ERK抑制劑)均購自碧云天公司;RPMI1640與胎牛血清由Gibco公司購得;流式細(xì)胞儀為BDFACScalibur公司儀器.1.2方式方法1.2.1B細(xì)胞的分離純化脫頸處死B6小鼠,放入75%酒精10min,在超凈臺(tái)內(nèi)取出小鼠脾臟置于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi),用5ml一次性無菌注射器汲取無菌PBS反復(fù)吹打脾臟;然后用濾網(wǎng)過濾,除去組織團(tuán)塊.4℃,1200r/min離心5min,去上清,根據(jù)107脾臟細(xì)胞參加1ml磁珠專用分離Buffer重懸,然后參加100lB220+磁珠,用移液槍混勻,4℃孵育15min,孵育經(jīng)過中每5min稍微震蕩混勻一次;參加5mlPBS洗一次,4℃,1200r/min離心5min,去上清;然后將沉淀混勻于1ml磁珠分離Buffer中用LS磁珠分離柱進(jìn)行陽選,即得到純化的小鼠脾臟B細(xì)胞.1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)將B細(xì)胞以為5105每孔的量接種于96孔培養(yǎng)板中,設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1.2.3添加抑制劑及沖動(dòng)劑將分離純化的B細(xì)胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min,然后在各個(gè)相應(yīng)孔中參加下面濃度的TLR7通路抑制劑:SP600125(JNK抑制劑)10mol/L、PDTC(NF-B抑制劑)10mol/L、SB203580(P38抑制劑)10mol/L及PD98059(ERK抑制劑)10mol/L混勻后放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min后分別每孔再參加1mol/LR848后混勻培養(yǎng).不需要參加抑制劑的實(shí)驗(yàn)操作,直接在鋪板后1h向每孔參加1mol/LR848后混勻培養(yǎng).1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)B細(xì)胞外表CD5及其內(nèi)部IL-10CD5的檢測(cè):將各孔細(xì)胞轉(zhuǎn)移到流式管中,用PBS洗一遍細(xì)胞,4℃,1200r/min離心5min,去除上清,參加1lCD5-PE,于旋渦振蕩儀上混勻,4℃孵育30min,參加200lPBS重懸,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè).胞內(nèi)IL-10的檢測(cè):1200r/min離心5min,去除上清,直接參加1mlfixation重懸細(xì)胞,室溫固定20min,參加2mlPBS洗滌一次,參加1mlperme-abilization重懸細(xì)胞,4℃避光孵育30min,1200r/min離心5min去除上清,往每管各參加1lIL-10-APC,震蕩混勻后于4℃避光孵育30min,參加1mlpermeabilization洗滌2次,最后參加200lPBS,上機(jī)檢測(cè).1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x-s來表示,用Prism5.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,兩組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析.P0.05為差異具有顯著性.2結(jié)果2.1TLR7沖動(dòng)劑上調(diào)小鼠脾臟B細(xì)胞中CD5+IL-10+B細(xì)胞的比例IL-10在小鼠B細(xì)胞中主要是由CD5+B細(xì)胞分泌,為了確定TLR7沖動(dòng)劑能否上調(diào)CD5+IL-10+B細(xì)胞的比例,我們?cè)诘?天用R848刺激B細(xì)胞,并用流式細(xì)胞術(shù)連續(xù)檢測(cè)了1~7dB細(xì)胞表示出CD5和IL-10的動(dòng)態(tài)變化.結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,R848能夠以時(shí)間依靠性的方式持續(xù)性地上調(diào)CD5+IL-10+B細(xì)胞的比例(P0.01),而CD5-IL-10+B細(xì)胞的比例無變化(圖1).2.2TLR7沖動(dòng)劑上調(diào)B細(xì)胞表示出CD5在正常狀態(tài)下小鼠脾臟B細(xì)胞中CD5+B細(xì)胞的比例約為5%,為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR7沖動(dòng)劑能否能夠促進(jìn)B細(xì)胞表示出CD5,我們用R848刺激B細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀連續(xù)檢測(cè)了1~7dCD5+B細(xì)胞比例和CD5MFI的變化.結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,R848能夠以時(shí)間依靠性的方式顯著上調(diào)B細(xì)胞表示出CD5(圖2A),并且在第7天CD5的上調(diào)比例到達(dá)峰值27.78%(P0.001).另外從第1天至第4天,CD5的MFI也呈現(xiàn)出顯著的持續(xù)上調(diào)(圖2B).2.3TLR7下游通路均與B細(xì)胞表示出CD5有關(guān)TLR7下游有JNK、P38、ERK及NF-B四條信號(hào)通路,為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR7主要通過哪條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其對(duì)CD5表示出的調(diào)控,我們預(yù)先用四條通路的阻斷劑分別處理B細(xì)胞1h后參加R848刺激劑,并用流式檢測(cè)CD5表示出的抑制情況.結(jié)果顯示,R848顯著促進(jìn)了B細(xì)胞上調(diào)表示出CD5,NF-B阻斷劑在第1天就顯示出其對(duì)B細(xì)胞表示出CD5的顯著性抑制(P0.05)(圖3A),而四條通路阻斷劑在第3天均顯示出對(duì)CD5表示出的顯著性抑制(P0.05)(圖3B).這些結(jié)果講明TLR7下游通路均可促進(jìn)B細(xì)胞上調(diào)表示出CD5.3討論小鼠B細(xì)胞分泌的IL-10主要來自于CD5+B細(xì)胞[5-7].既然TLR7刺激能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10,那么TLR7通路的活化對(duì)于B細(xì)胞表示出CD5能否有影響呢?首先,我們研究發(fā)現(xiàn)TLR7沖動(dòng)劑能夠上調(diào)分泌IL-10的CD5陽性B細(xì)胞的比率,這與已報(bào)道的研究結(jié)果一致.一些研究指出CD5+B細(xì)胞本身比CD5-B細(xì)胞存活時(shí)間要長(zhǎng),且B細(xì)胞分泌的IL-10能夠維持人和小鼠CD5+B細(xì)胞的長(zhǎng)期存活[8-10],這與我們發(fā)如今體外培養(yǎng)7d后對(duì)照組CD5+B細(xì)胞的比例也有所升高的現(xiàn)象是一致的.2018年,Garaud等[11]通過轉(zhuǎn)染CD5基因于不表示出CD5基因的B細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)這種B細(xì)胞分泌IL-10的能力與CD5的表示出成正相關(guān);隨后Garaud等[12]發(fā)現(xiàn)表示出CD5的B細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子NFAT2和STAT3的入核直接與IL-10在B細(xì)胞中的表示出水平有關(guān),即便在CD5-B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了NFAT2和STAT3基因也不能讓該細(xì)胞表示出IL-10,講明CD5通過控制轉(zhuǎn)錄因子NFAT2和STAT3的入核來控制IL-10的表示出.我們發(fā)現(xiàn)TLR7刺激能夠促進(jìn)IL-10的表示出,提示TLR7通路有可能通過促進(jìn)CD5的表示出間接促進(jìn)B細(xì)胞分泌IL-10.關(guān)于CD5+B細(xì)胞的來源一直存在爭(zhēng)議,當(dāng)前有兩種假講:一種假講叫種系假講,該假講以為B1a細(xì)胞來源于胚胎或者出生后早期的前體細(xì)胞,而B2細(xì)胞來源于不同的前體細(xì)胞.另一種假講則以為,CD5+B和CD5-B細(xì)胞來源于同一種細(xì)胞前體,CD5+細(xì)胞是經(jīng)過某些特殊的抗原刺激后發(fā)生了基因重排所構(gòu)成的[13].早在1991年Cong等[14]在體外驗(yàn)證:anti-IgM能夠誘導(dǎo)常規(guī)B細(xì)表示出CD5.我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR7通路的活化能夠促進(jìn)脾臟B細(xì)胞上調(diào)CD5蛋白的表示出,提示TLR7通路活化可能通過某些通路誘導(dǎo)常規(guī)B細(xì)胞表示出CD5.至于這種現(xiàn)象究竟是TLR7沖動(dòng)劑通過誘導(dǎo)常規(guī)B細(xì)胞表示出CD5,還是沖動(dòng)劑對(duì)本來存在的CD5+B細(xì)胞作用所致有待通過分選CD5陽性和陰性的B細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證.不管CD5+B細(xì)胞的來源到底屬于哪種假講,CD5+B細(xì)胞本身具有很強(qiáng)的自我更新能力,固然當(dāng)前其自我更新機(jī)制尚未明了,但是在正常生理狀態(tài)下CD5+B細(xì)胞的數(shù)量遭到了嚴(yán)格的控制,在新生小鼠脾臟內(nèi)CD5+B細(xì)胞的比例為30%~40%,2周后其比例約為5%左右[15].最新研究指出B1細(xì)胞外表存在大量的小鼠唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素G(Siglec-G),這種凝集素可能對(duì)控制CD5+B細(xì)胞的數(shù)量至關(guān)重要[16,17].還有研究表示清楚CD5+B細(xì)胞數(shù)量或者功能的異常出如今多種本身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)以及慢性B淋巴細(xì)胞白血病中[18].綜上所述,TLR7沖動(dòng)劑能夠顯著上調(diào)CD5+IL-10+B細(xì)胞的比例;并且能夠促進(jìn)脾臟B細(xì)胞高表示出B細(xì)胞外表分子CD5;進(jìn)一步,TLR7下游NF-B、P38、ERK及JNK通路的活化均能促進(jìn)B細(xì)胞表示出CD5.這些結(jié)果講明TLR7刺激直接影響小鼠B細(xì)胞中CD5的表示出,進(jìn)而影響其IL-10的分泌等功能.提示TLR7改變CD5+IL-10+B細(xì)胞的比例可能介入本身免疫性疾病進(jìn)程.以下為參考文獻(xiàn):[1]BerlandR,WortisHH.OriginsandfunctionsofB-1cellswithnotesontheroleofCD5[J].AnnuRevImmunol,2002,20:253-300.[2]GururajanM,JacobJ,PulendranB.Toll-likereceptorexpressionandresponsivenessofdistinctmurinesplenicandmucosalB-cellsubsets[J].PLoSOne,2007,2(9):e863.[3]AgrawalS,GuptaS.TLR1/2,TLR7,andTLR9signalsdirectlyactivatehumanperipheralbloodnaiveandmemoryBcellsubsetstoproducecytokines,chemokines,andhematopoieticgrowthfac-tors[J].JClinImmunol,2018,31(1):89-98.[4]GenestierL,TaillardetM,MondiereP,etal.TLRagonistsselec-tivelypromoteterminalplasmacelldifferentiationofBcellsubsetsspecializedinthymus-independentresponses[J].JImmunol,2007,178(12):7779-7786.[5]OGarraA,ChangR,GoN,etal.Ly-1B(B-1)cellsarethemainsourceofBcell-derivedinterleukin10[J].EurJImmunol,1992,22(3):711-717.[6]BarrTA,BrownS,RyanG,etal.TLR-mediatedstimulationofAPC:DistinctcytokineresponsesofBcellsanddendriticcells[J].EurJImmunol,2007,37(11):3040-3053.[7]SindhavaV,WoodmanME,StevensonB,etal.Interleukin-10mediatedautoregulationofmurineB-1B-cellsanditsroleinBor-reliahermsiiinfection[J].PLoSOne,2018,5(7):e11445.[8]HayakawaK,HardyRR.DevelopmentandfunctionofB-1cells[J].CurrOpinImmunol,2000,12(3):346-353.[9]PersJO,JaminC,YouinouP,etal.RoleofIL-10inthedistri-butionofBcellsubsetsinthemouseB-1cellpopulation[J].EurCytokineNetw,2003,14(3):178-185.[10]Gary-GouyH,HarriagueJ,BismuthG,etal.HumanCD5pro-motesB-cellsurvivalthroughstimulationofautocrineIL-10pro-duction[J].Blood,2002,100(13):4537-4543.[11]GaraudS,LeDantecC,deMendozaAR,etal.IL-10produc-tionbyBcellsexpressingCD5withthealternativeexon1B[J].AnnNYAcadSci,2018,1173:280-285.[12]GaraudS,MorvaA,LemoineS,etal.CD5promotesIL-10pro-ductioninchroniclymphocyticleukemiaBcellsthroughSTAT3andNFAT2activation[J].JImmunol,2018,186(8):4835-4844.[13]WortisHH,BerlandR.Cuttingedgecommentary:originsofB-