第四章-細(xì)胞化學(xué)染色

第四章--細(xì)胞化學(xué)染色第一頁(yè)，共73頁(yè)。第一節(jié)概述

以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)的原理，應(yīng)用涂片染色的方法，對(duì)血細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)成分及其變化作定性、定位、半定量的分析。

第二頁(yè)，共73頁(yè)。

一、研究對(duì)象

外周血和骨髓新鮮涂片單個(gè)細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì)：

酶類、脂類、糖類、鐵、蛋白質(zhì)、核酸等第三頁(yè)，共73頁(yè)。

二、基本步驟固定保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分顯示被染的化學(xué)物質(zhì)最終形成穩(wěn)定的有色沉淀

復(fù)染顯示各種細(xì)胞，其顏色與有色沉淀的顏色有明顯的對(duì)比度第四頁(yè)，共73頁(yè)。

三、臨床應(yīng)用

第五頁(yè)，共73頁(yè)。

第二節(jié)

常用細(xì)胞化學(xué)染色方法

過(guò)氧化物酶染色中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)α-醋酸萘酚酯酶染色鐵染色

第六頁(yè)，共73頁(yè)。一、過(guò)氧化物酶染色

（peroxidase，POX）

第七頁(yè)，共73頁(yè)。

髓過(guò)氧化物酶（marrowperoxidase,MPO)血細(xì)胞主要的POX,是人類中性粒細(xì)胞含量最多的蛋白質(zhì)，主要功能是破壞生物氧化過(guò)程中有劇毒的過(guò)氧化物。第八頁(yè)，共73頁(yè)。POX

新生態(tài)氧

[O]↑過(guò)氧化氫（基質(zhì)中）二氨基聯(lián)苯胺（無(wú)色）粒、單核細(xì)胞胞漿【原理】

棕黃色沉淀

（漿內(nèi)酶部位）第九頁(yè)，共73頁(yè)?！窘Y(jié)果判斷】陰性

無(wú)顆粒弱陽(yáng)性顆粒小，分布稀疏陽(yáng)性顆粒稍粗，分布較密集強(qiáng)陽(yáng)性顆粒粗大，密布于整個(gè)胞漿第十頁(yè)，共73頁(yè)。【正常血細(xì)胞染色反應(yīng)】

POX主要存在于粒系細(xì)胞中。分化差的原粒細(xì)胞陰性;

分化好的原粒細(xì)胞至中性成熟粒細(xì)胞各階段均呈陽(yáng)性，陽(yáng)性反應(yīng)程度隨細(xì)胞的成熟逐漸增強(qiáng)。第十一頁(yè)，共73頁(yè)。第十二頁(yè)，共73頁(yè)。

陰性或弱陽(yáng)性

紅細(xì)胞系統(tǒng)巨核細(xì)胞系統(tǒng)陰性漿細(xì)胞組織細(xì)胞

第十三頁(yè)，共73頁(yè)。第十四頁(yè)，共73頁(yè)。【臨床意義】

臨床上是輔助判斷急性白血病首選的、最重要的細(xì)胞化學(xué)染色

急性髓細(xì)胞白血病急性淋巴細(xì)胞白血病

鑒別第十五頁(yè)，共73頁(yè)。

1.急性髓細(xì)胞白血病

（1）急性粒細(xì)胞白血病

陽(yáng)性反應(yīng)：M3>M2b>M2a>M1（分化差的原粒細(xì)胞呈陰性反應(yīng)）

（2）急性單核細(xì)胞白血病弱陽(yáng)性反應(yīng)（分化差的原單核細(xì)胞呈陰性反應(yīng)）第十六頁(yè)，共73頁(yè)。

2.急性淋巴細(xì)胞白血病陰性反應(yīng)或陽(yáng)性率<3%(殘留的原粒細(xì)胞)第十七頁(yè)，共73頁(yè)。第十八頁(yè)，共73頁(yè)。二、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色

（neutrophilicalkaline

phosphatase，NAP）第十九頁(yè)，共73頁(yè)。磷酸萘酚鈉（基質(zhì)中）中性粒細(xì)胞胞漿中NAP磷酸鈉α-萘酚

重氮鹽（堅(jiān)牢藍(lán)鹽RR）＋紫黑色偶氮染料（胞漿中）水解【原理】Kaplow偶氮偶聯(lián)法第二十頁(yè)，共73頁(yè)?！窘Y(jié)果判斷】

胞漿中有紫黑色顆粒為陽(yáng)性(+～++++）第二十一頁(yè)，共73頁(yè)?！菊Ｑ?xì)胞染色反應(yīng)】

1.中性成熟粒細(xì)胞（桿狀和分葉）陽(yáng)性反應(yīng)

其他細(xì)胞呈陰性反應(yīng)第二十二頁(yè)，共73頁(yè)。第二十三頁(yè)，共73頁(yè)。

油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)成熟中性粒細(xì)胞（桿狀和分葉）,分別記錄其分級(jí)情況：

第二十四頁(yè)，共73頁(yè)。

(-)0分(+)1分(++)2分(+++)3分(++++)4分

陽(yáng)性率全部陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞之和

積分值各種陽(yáng)性程度細(xì)胞的分值之和第二十五頁(yè)，共73頁(yè)。

3.參考值

積分值40~80分

陽(yáng)性率10%~40%

(各實(shí)驗(yàn)室參考值不同)

第二十六頁(yè)，共73頁(yè)。

【臨床意義】病理性變化：（1）細(xì)菌性感染與病毒性感染（尤其是化膿性感染）明顯增加無(wú)明顯變化第二十七頁(yè)，共73頁(yè)。(2）類白血病反應(yīng)與慢性粒細(xì)胞白血病明顯增加明顯下降且常為零分，緩解時(shí)又上升到正常第二十八頁(yè)，共73頁(yè)。（3）再生障礙性貧血增加陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿下降第二十九頁(yè)，共73頁(yè)。

三、過(guò)碘酸-雪夫反應(yīng)

(糖原染色)

（periodicacid-Schiffreaction，PAS）第三十頁(yè)，共73頁(yè)。雙醛基過(guò)碘酸雪夫試劑中的無(wú)色品紅

紫紅色化合物

(附于含多糖類的胞漿內(nèi))

乙二醇基(多糖類物質(zhì)含有)氧化【原理】第三十一頁(yè)，共73頁(yè)?！窘Y(jié)果判斷】陽(yáng)性胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色陽(yáng)性物，呈彌漫均勻紅色、顆粒狀或小塊狀。陰性胞漿內(nèi)無(wú)色,核淡綠。用陽(yáng)性率報(bào)告結(jié)果，并說(shuō)明陽(yáng)性物的形態(tài)。第三十二頁(yè)，共73頁(yè)?！菊Ｑ?xì)胞染色反應(yīng)】

1.粒細(xì)胞系統(tǒng)分化差的原粒細(xì)胞為陰性；分化好的原粒細(xì)胞至中性分葉核粒細(xì)胞各階段均呈陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性程度隨細(xì)胞的成熟逐漸增強(qiáng)。陽(yáng)性物呈細(xì)顆粒、均勻紅色。第三十三頁(yè)，共73頁(yè)。

陰性

3.單核細(xì)胞系統(tǒng)

細(xì)顆粒狀，有時(shí)分布于細(xì)胞邊緣的陽(yáng)性顆粒較粗大。第三十四頁(yè)，共73頁(yè)。

大多數(shù)淋巴細(xì)胞呈陰性；少于20%淋巴細(xì)胞呈粗顆粒狀或塊狀陽(yáng)性。

呈顆粒狀或塊狀陽(yáng)性（含血小板）。第三十五頁(yè)，共73頁(yè)。第三十六頁(yè)，共73頁(yè)。【臨床意義】:惡性疾病呈陽(yáng)性，良性疾病，呈陰性。紅血病或紅白血病幼紅細(xì)胞陽(yáng)性巨幼細(xì)胞性貧血幼紅細(xì)胞陰性骨髓增生異常綜合征幼紅細(xì)胞陽(yáng)性再生障礙性貧血幼紅細(xì)胞陰性

第三十七頁(yè)，共73頁(yè)。第三十八頁(yè)，共73頁(yè)。

2.鑒別急性白血病類型（1）急性淋巴細(xì)胞白血病

陽(yáng)性率20%～80%，呈紅色粗顆粒狀或塊狀。第三十九頁(yè)，共73頁(yè)。（2）急性粒細(xì)胞白血病少數(shù)陽(yáng)性，呈細(xì)顆粒狀或均勻紅色。（3）急性單核細(xì)胞白血病可陽(yáng)性，呈細(xì)顆粒狀、彌散分布，有時(shí)胞質(zhì)邊緣處顆粒較粗大。第四十頁(yè)，共73頁(yè)。（4）巨核細(xì)胞白血病陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為紅色顆?；驂K狀。第四十一頁(yè)，共73頁(yè)。

戈謝細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性（葡萄糖腦苷脂在單核-吞噬細(xì)胞積聚）尼曼-匹克細(xì)胞呈陰性或弱陽(yáng)性（鞘磷脂在單核-吞噬細(xì)胞積聚）第四十二頁(yè)，共73頁(yè)。

四、α-醋酸萘酚酯酶染色

（α-naphtholacetateesterase，α-NAE）第四十三頁(yè)，共73頁(yè)。酸性α-醋酸萘酚酯酶

（T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞）

α-醋酸萘酚酯酶（α-NAE）非特異性

（單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）

α-丁酸萘酚酯酶

（單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）

醋酸AS-D萘酚酯酶（AS-DNAE)

（單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）

特異性

氯乙酸AS-D萘酚酯酶(AS-DNCE)

（粒細(xì)胞）

酯酶第四十四頁(yè)，共73頁(yè)。α-醋酸萘酚酯酶（細(xì)胞內(nèi)）α-醋酸萘酚（基質(zhì)液中）α-萘酚

重氮鹽（堅(jiān)牢藍(lán)B）胞漿不溶性灰黑色或棕黑色沉淀水解【原理】第四十五頁(yè)，共73頁(yè)?！窘Y(jié)果判斷】胞漿內(nèi)有灰黑色或棕黑色彌散性顆粒狀沉淀為陽(yáng)性。第四十六頁(yè)，共73頁(yè)。

氟化鈉抑制試驗(yàn)在基質(zhì)液中加入適量NaF,其余染色方法同上。兩種方法染色后用油鏡計(jì)數(shù)100或200個(gè)被檢細(xì)胞，分別計(jì)算出抑制前和抑制后的陽(yáng)性率或陽(yáng)性積分。第四十七頁(yè)，共73頁(yè)。

氟化鈉抑制率=抑制前陽(yáng)性率或陽(yáng)性積分-抑制后陽(yáng)性率或陽(yáng)性積分抑制前陽(yáng)性率或陽(yáng)性積分100%第四十八頁(yè)，共73頁(yè)?！菊Ｑ?xì)胞染色反應(yīng)】

原始單核細(xì)胞分化差陰性分化好陽(yáng)性幼稚及成熟單核細(xì)胞陽(yáng)性被氟化鈉抑制第四十九頁(yè)，共73頁(yè)。

2.粒細(xì)胞系統(tǒng)

原粒細(xì)胞陰性或弱陽(yáng)性以下階段為弱陽(yáng)性

3.淋巴細(xì)胞系統(tǒng)

多數(shù)陰性，少數(shù)弱陽(yáng)性

不被氟化鈉抑制第五十頁(yè)，共73頁(yè)。第五十一頁(yè)，共73頁(yè)。【臨床意義】

急單急粒急性早幼粒急粒單急淋α-NAE+++或-或++陽(yáng)性-或+++++弱+NaF被抑制不被不被抑制部分被抑制抑制部分未被抑制主要用于鑒別急性白血病類型第五十二頁(yè)，共73頁(yè)。五、α-丁酸萘酚酯酶染色

2.原理

細(xì)胞內(nèi)的α-丁酸萘酚酯酶(α-NBE)在堿性條件下，將基質(zhì)中的α-丁酸萘酚水解，產(chǎn)生α-萘酚，再與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有色沉淀，定位于酶活性所在處。第五十三頁(yè)，共73頁(yè)。α-丁酸萘酚酯酶（細(xì)胞內(nèi)）α-丁酸萘酚酯

（基質(zhì)液中）α-萘酚

重氮鹽（堅(jiān)牢藍(lán)B）胞漿不溶性灰黑色或棕黑色沉淀水解【原理】第五十四頁(yè)，共73頁(yè)。參考值粒細(xì)胞系統(tǒng)：各階段均陰性單核細(xì)胞系統(tǒng)：原單陰性，余均陽(yáng)性，但被氟化鈉抑制淋巴細(xì)胞系統(tǒng)：B淋巴細(xì)胞均陰性，余可陽(yáng)性其他細(xì)胞：可陽(yáng)性，不被氟化鈉抑制第五十五頁(yè)，共73頁(yè)。5.臨床意義：1）鑒別急性白血病類型：AMOL時(shí)，原始單核細(xì)胞可呈陽(yáng)性反應(yīng)，幼單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，但能被氟化鈉抑制(抑制率在50%以上)；AML時(shí)，原始粒細(xì)胞一般呈陰性反應(yīng)，少數(shù)呈陽(yáng)性反應(yīng)，但不被氟化鈉抑制或僅部分輕度抑制；ALL時(shí)，原始淋巴細(xì)胞和幼淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，T-ALL原始淋巴細(xì)胞可呈陽(yáng)性反應(yīng)，但不被氟化鈉抑制。2）鑒別急性單核細(xì)胞白血病和組織細(xì)胞白血?。寒惓＝M織細(xì)胞可呈陽(yáng)性反應(yīng)，但此酶不能被氟化鈉抑制；急單時(shí)，白血病細(xì)胞的陽(yáng)性反應(yīng)可被氟化鈉抑制。第五十六頁(yè)，共73頁(yè)。

六、鐵染色

（ferricstain）第五十七頁(yè)，共73頁(yè)。

正常人骨髓中的貯存鐵存在的方式：骨髓小粒中的含F(xiàn)e血黃素—骨髓單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)

（細(xì)胞外鐵）鐵蛋白—幼紅細(xì)胞內(nèi)（細(xì)胞內(nèi)鐵）第五十八頁(yè)，共73頁(yè)。亞鐵氰化鉀

亞鐵氰化鐵(藍(lán)色沉淀在含F(xiàn)e部位)鐵＋酸性環(huán)境普魯士藍(lán)反應(yīng)原理第五十九頁(yè)，共73頁(yè)?！窘Y(jié)果判斷】

細(xì)胞外鐵低倍鏡觀察涂片尾部和骨髓小粒,細(xì)胞外鐵位于幼紅細(xì)胞外或骨髓小粒巨噬細(xì)胞漿內(nèi)，呈藍(lán)色顆粒狀、小珠狀或團(tuán)塊狀。

第六十頁(yè)，共73頁(yè)。

再用油鏡判斷陽(yáng)性程度，根據(jù)鐵量多少分五級(jí):（-）（+）（++）（+++）（++++）第六十一頁(yè)，共73頁(yè)。第六十二頁(yè)，共73頁(yè)。

細(xì)胞內(nèi)鐵幼紅細(xì)胞核染色為鮮紅色,鐵粒呈藍(lán)綠色。油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)中幼紅細(xì)胞和晚幼紅細(xì)胞，記錄胞漿中含有藍(lán)色顆粒細(xì)胞的百分率。第六十三頁(yè)，共73頁(yè)。

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布情況,將鐵粒幼紅細(xì)胞分為四型:

Ⅰ型(1-2)Ⅱ型(3-5)Ⅲ型(6-10)Ⅳ型(11以上)第六十四頁(yè)，共73頁(yè)。第六十五頁(yè)，共73頁(yè)。鐵粒幼紅細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒的幼紅細(xì)胞。環(huán)鐵粒幼紅細(xì)胞幼紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)色鐵顆粒在6顆以上，并圍繞核周1/2以上者。鐵粒紅細(xì)胞成熟紅細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)色鐵顆粒。第六十六頁(yè)，共73頁(yè)。1.細(xì)胞外鐵

+～++，約2/3人為++，約1/3人為+。

陽(yáng)性率19%～44%Ⅰ型為主，少數(shù)為Ⅱ型（無(wú)環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞和鐵粒紅細(xì)胞）【參考值】第六十七頁(yè)，共73頁(yè)。

【臨床意義】1.診斷缺鐵性貧血、指導(dǎo)鐵劑治療細(xì)胞內(nèi)、外鐵明顯減低甚至消失，經(jīng)鐵劑治療有效后，其細(xì)胞外鐵、內(nèi)鐵先后增多。第六十八頁(yè)，共73頁(yè)。