第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)演示文稿

第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)演示文稿目前一頁\總數(shù)五十一頁\編于七點優(yōu)選第三節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)目前二頁\總數(shù)五十一頁\編于七點目前三頁\總數(shù)五十一頁\編于七點目前四頁\總數(shù)五十一頁\編于七點1.干擾素概述干擾素的種類干擾素的理化性質(zhì)干擾素的生物學活性干擾素的臨床應用干擾素的生產(chǎn)工藝路線目前五頁\總數(shù)五十一頁\編于七點1.1干擾素的種類概念：（interferon，IFN）干擾素是一種細胞因子，它是機體感染病毒時，宿主細胞通過抗病毒應答反應，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名稱為Interferon，簡稱IFN。發(fā)現(xiàn)：干擾素是1957年英國科學家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學家們進一步發(fā)現(xiàn)，機體對入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進行防御。當機體細胞受到病毒感染時，機體細胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復制，它是機體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。

目前六頁\總數(shù)五十一頁\編于七點天然干擾素分類1.根據(jù)來源、基因序列和氨基酸組成分類

I型干擾素：

IFNα、IFNβ、IFNτ、IFN

ω

來源：白細胞、成纖維細胞、病毒感染的組織細胞等

功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長

免疫調(diào)節(jié)(較弱）

其中IFN-α為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。

II型干擾素：干擾素γ（IFN)

來源：活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生

功能：免疫調(diào)節(jié)提高單核巨噬細胞、樹突狀細胞的抗原提呈能力增強Tc細胞和NK細胞的殺傷活性抑制TH2細胞形成，下調(diào)體液免疫應答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據(jù)動物來源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。

目前七頁\總數(shù)五十一頁\編于七點上市重組干擾素:α2a、α2b、α1b、β1b，γ1992年我國第一個基因工程藥物IFN-α1b獲得國家一類新藥證書。研發(fā)中的重組干擾素：IFNω，臨床階段目前八頁\總數(shù)五十一頁\編于七點1.2干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW:18-40ku；；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。目前九頁\總數(shù)五十一頁\編于七點Ⅰ型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應不是直接的，而是通過對宿主細胞的作用引起的。①對干擾素敏感的細胞表面存在于干擾素受體，核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進病毒mRNA降解。②干擾素能提高細胞表面MHCⅠ類分子的表達水平，受到病毒感染的細胞表面MHCⅠ類分子的增加有助于向Tc細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解。③干擾素可增強NK細胞對病毒感染的殺傷能力。1.3干擾素的生物學活性正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細胞產(chǎn)生干擾素。廣譜抗病毒活性機制目前十頁\總數(shù)五十一頁\編于七點病毒復制抑制病毒復制信號轉(zhuǎn)導IFN-aIFN-誘導蛋白誘導刺激胞核胞核目前十一頁\總數(shù)五十一頁\編于七點抗腫瘤作用機制Ⅰ型干擾素能抑制細胞的DNA合成，減慢細胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對腫瘤細胞的作用比對正常細胞的作用強

500～1000倍。另外，Ⅱ型干擾素也可通過增強機體免疫機制、加強免疫監(jiān)督功能來實現(xiàn)其抗腫瘤效應。目前十二頁\總數(shù)五十一頁\編于七點免疫調(diào)節(jié)活性機制

免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對宿主免疫細胞活性的影響，如對巨噬細胞、T細胞、B細胞和NK細胞等均有一定作用。對巨噬細胞的作用：IFNγ可使巨噬細胞表面MHCⅡ類分子的表達增加，增強其抗原遞呈能力；此外還能增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。對淋巴細胞的作用：干擾素對淋巴細胞的作用較為復雜，可受劑量和時間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時投入會產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強的效果。在適宜的條件下，IFNγ對B細胞和CD8+T細胞的分化有促進作用，但不能促進其增殖。IFNγ能增強TH1細胞的活性，增強細胞免疫功能；但對TH2細胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFNγ不僅抑制TH2細胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE。對其它細胞的作用：IFNγ對其他細胞也有廣泛影響：①刺激中性粒細胞，增強其吞噬能力；②活化NK細胞，增強其細胞毒作用；③使某些正常不表達MHCⅡ類分子的細胞（如血管內(nèi)皮細胞、某些上皮細胞和結(jié)締組織細胞）表達MHCⅡ類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；④使靜脈內(nèi)皮細胞對中性粒細胞的粘附能力更強，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細胞。目前十三頁\總數(shù)五十一頁\編于七點1.4重組干擾素的臨床應用廣譜抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFNα）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性——治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFNγ）多發(fā)性硬化癥rhuIFNβ目前十四頁\總數(shù)五十一頁\編于七點1.5.干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：

Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFNα-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1gIFNα，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性目前十五頁\總數(shù)五十一頁\編于七點干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：

1999年：IFNα-n1/Wellferon,批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。目前十六頁\總數(shù)五十一頁\編于七點干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；

1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；

2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys

表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程?；蚬こ檀竽c桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:目前十七頁\總數(shù)五十一頁\編于七點干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）上市產(chǎn)品：rhuIFNβ-1a1996，Avonex(Biogen)；

2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：目前十八頁\總數(shù)五十一頁\編于七點干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）?宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）?上市產(chǎn)品：IFNα-2b/安福隆?表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性?工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝目前十九頁\總數(shù)五十一頁\編于七點2.基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏

基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫的建立與保藏目前二十頁\總數(shù)五十一頁\編于七點2.1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素α-2b基因的克隆第二步：表達載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建目前二十一頁\總數(shù)五十一頁\編于七點第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR)

制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。目前二十二頁\總數(shù)五十一頁\編于七點第二步：表達載體構(gòu)建?IFN基因與表達載體連接?轉(zhuǎn)化大腸桿菌?篩選陽性克隆?獲得序列正確表達載體目前二十三頁\總數(shù)五十一頁\編于七點第三步：工程菌構(gòu)建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種目前二十四頁\總數(shù)五十一頁\編于七點2.2基因工程菌的特性（1）具有宿主菌的特征：細菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學效價不低于2.0×109IU/L。目前二十五頁\總數(shù)五十一頁\編于七點2.3菌種庫的建立與保藏?QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性?菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。目前二十六頁\總數(shù)五十一頁\編于七點

3.干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程目前二十七頁\總數(shù)五十一頁\編于七點3.1搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。目前二十八頁\總數(shù)五十一頁\編于七點3.2種子罐培養(yǎng)

接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30℃，pH7.0?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速DO為30%，3～4h，OD>4.0。檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。目前二十九頁\總數(shù)五十一頁\編于七點

3.3發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。終點控制：OD值達9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查目前三十頁\總數(shù)五十一頁\編于七點3.4．菌體收集連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。目前三十一頁\總數(shù)五十一頁\編于七點4干擾素的分離純化工藝過程4.1、干擾素分離工藝過程

4.2、干擾素的純化工藝過程目前三十二頁\總數(shù)五十一頁\編于七點4.1干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預處理初級分離目前三十三頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(1)菌體裂解

裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎－20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃，2hr凍融:細胞完全破裂，釋放干擾素。目前三十四頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(2)預處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。目前三十五頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(3)離心

連續(xù)流離心機：2℃～10℃，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。目前三十六頁\總數(shù)五十一頁\編于七點（4）初級分離

鹽析:4M硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。目前三十七頁\總數(shù)五十一頁\編于七點4.2、干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無菌過濾分裝目前三十八頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(1)溶解粗干擾素

配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集。冷卻至2℃～10℃。檢查:緩沖液的pH值和電導值。溶解：

2℃～10℃，勻漿，完全溶解。目前三十九頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(2)沉淀與疏水層析

等電點沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中

除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。目前四十頁\總數(shù)五十一頁\編于七點等電點沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2℃～10℃，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。目前四十一頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(3)陰離子交換層析與濃縮0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。濃縮：調(diào)整溶液和電導，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。目前四十二頁\總數(shù)五十一頁\編于七點（4)陽離子交換層析與濃縮用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5～50ms/cm進行洗脫配合SDS收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進行。目前四十三頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(5)凝膠過濾層析洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂上樣，相同緩沖液進行洗脫。合并干擾素部分目前四十四頁\總數(shù)五十一頁\編于七點(6)無