植物生物技術(shù)-植物遺傳轉(zhuǎn)化載體課件

第十章

植物遺傳轉(zhuǎn)化載體1?????遺傳轉(zhuǎn)化常用的選擇標(biāo)記基因及及無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化第一節(jié)

植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的種類及特點(diǎn)第二節(jié)

農(nóng)桿菌質(zhì)粒系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和構(gòu)建第三節(jié)

植物病毒載體第四節(jié)

葉綠體轉(zhuǎn)化載體第五節(jié)系統(tǒng)本章主要內(nèi)容第

10章植物遺傳轉(zhuǎn)化載體2本章教學(xué)目的與要求根癌農(nóng)桿菌

Ti

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能名詞：一元載體、雙元載體、卸甲載體葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)與意義遺傳轉(zhuǎn)化中常用的選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因3第

10章植物遺傳轉(zhuǎn)化載體植物遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)植物遺傳轉(zhuǎn)化也稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)

(transgene

technology)是指將人工分離和修飾過(guò)的外源基因?qū)肷矬w的基因組中，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生改變的技術(shù)植物轉(zhuǎn)基因的優(yōu)越性對(duì)植物基因型和表現(xiàn)型的改變只作用于目標(biāo)性狀，

不涉及非目標(biāo)累贅基因，因而更具有針對(duì)性，可加快育種進(jìn)程；可克服傳統(tǒng)育種中不同Th物之間的Th殖隔離等限制，擴(kuò)大可利用的資源庫(kù)（動(dòng)物、植物、微Th物、人工合成基因均可利用）；可創(chuàng)造出自然界所沒有的新種質(zhì)；以轉(zhuǎn)基因植物為主體的植物化工廠具有高效、低污染、可再Th的優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié)

植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的種類及特點(diǎn)一、植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的特點(diǎn)作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體，必須具有兩種功能：1.

能作為媒介將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞中去2.

它能提供被寄主細(xì)胞的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識(shí)別的

DNA

序列，以保證導(dǎo)入的外源基因能在受體植物細(xì)胞中正常復(fù)制和表達(dá)質(zhì)粒載體Ri質(zhì)粒載體共整合載體系統(tǒng)Ti質(zhì)粒載體雙元載體系統(tǒng)二、植物基因工程載體的種類病毒載體單鏈RNA病毒載體單鏈DNA病毒載體雙鏈DNA病毒載體第二節(jié) 農(nóng)桿菌質(zhì)粒系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能和構(gòu)建農(nóng)桿菌是一類革蘭氏陰性土壤桿菌（

G

－），活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來(lái)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（冠癭堿）生存的一類細(xì)菌。農(nóng)桿菌可分為根癌農(nóng)桿菌

Agrobacterium

tumefaciems

（含

Ti

質(zhì)粒）和發(fā)根農(nóng)桿菌

Agrobacterium

rhizogenes （含

Ri

質(zhì)粒）

，在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的

Ti

質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根癌農(nóng)桿菌侵染植物后產(chǎn)生冠癭瘤一、根癌農(nóng)桿菌

Ti

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能Ti

質(zhì)粒

(

tumor

induced

Plasmid)

是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀

DNA

分子，其分子量為95--156

x

106 D

，約有

150--200kb依據(jù)

Ti

質(zhì)粒誘導(dǎo)的植物冠癭瘤種類的不同，

Ti

質(zhì)粒可以分為四種類型：

章魚堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型和農(nóng)桿菌素堿型（

agrocinoPine

）或琥珀堿型（

succinamo

Pine

）Ti

質(zhì)粒結(jié)構(gòu)T-DNA

區(qū)CytokininAuxin Opine左邊界右邊界Ti

質(zhì)粒travir

區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)T-DNA

區(qū)Auxin左邊界CytokininOpineCon區(qū)右邊界vir

區(qū)Ori區(qū)Ti

質(zhì)粒tra毒性區(qū)（

vir

區(qū)）：激活

T

－

DNA

的轉(zhuǎn)移T

－

DNA

區(qū)：

侵染植物時(shí)，

從

Ti

質(zhì)粒上被切割，

轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，帶有與腫瘤形成有關(guān)的基因存在與細(xì)菌間進(jìn)行接合保證

Ti

質(zhì)粒進(jìn)行自我接合轉(zhuǎn)移區(qū)：有關(guān)的基因復(fù)制起始區(qū)：復(fù)制（一）

T-DNA

的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及功能編長(zhǎng)長(zhǎng)左左碼冠癭堿的合成，能隨機(jī)整合到植物的染色體上。度一般為

12-24kb

，是

Ti

質(zhì)粒最重要的部分。右邊界分別為

25bP

的重復(fù)序列，其中14bP

是核心，是完全保守的。右邊界對(duì)于致瘤必不可少。（二）

Vir

區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能：該區(qū)段上編碼的基因能激活

T-

DNA

轉(zhuǎn)移，

使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故也稱作致毒區(qū)。

T-

DNA

區(qū)與

Vir

區(qū)在質(zhì)粒上彼此相鄰，

合起來(lái)約占

Ti

質(zhì)粒

DNA的三分之一Vir

區(qū)段總長(zhǎng)度大約

35kb

，由

6

個(gè)互補(bǔ)群組成，

分別命名為VirA

、

VirB

、

VirC

、

VirD

、

VirE

、和

VirG

。Vir

區(qū)中各個(gè)基因之間都是相互聯(lián)系相互影響的，缺一不可。當(dāng)

Vir

基因與

T-

DNA

分別位于兩個(gè)不同的復(fù)制子上時(shí)，即

Vir

區(qū)與

T-

DNA區(qū)分割開來(lái)以后， Vir

基因仍然能夠?yàn)?/p>

T-

DNA

提供轉(zhuǎn)移功能毒性區(qū)中各個(gè)位點(diǎn)的表達(dá)情況可以分為兩種組成性表達(dá)：在無(wú)植物誘導(dǎo)分子存在下依然保持一定的表達(dá)水平；VirA

屬于組成型表達(dá)的位點(diǎn)誘導(dǎo)性表達(dá)：即這些基因的表達(dá)必須在土壤農(nóng)桿菌感染植物受傷組織時(shí)，植物細(xì)胞分泌的信號(hào)分子（

乙酰丁香酮及羥基乙酰丁香酮）作用下才能啟動(dòng)表達(dá)；

VirB

、

VirC

、

VirD

和

VirE

是屬于誘導(dǎo)性表達(dá)的位點(diǎn)virG

既為組成型表達(dá)，也具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，

在信號(hào)分子的誘導(dǎo)下，表達(dá)量提高

10

倍Vir

區(qū)基因的功能：Vir

A

蛋白––

幫助植物細(xì)胞接受植物信號(hào)分子；Vir

G

蛋白––

對(duì)毒性區(qū)的其他基因進(jìn)行正調(diào)節(jié)Vir

B

蛋白––

形成膜通道，

使

T-DNA

轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞外Vir

D

蛋白––

VirD

1

、 VirD

2

誘導(dǎo)

T-DNA

形成單股

DNA

片段，

并形成復(fù)合物（

T-

DNA-

Vir

D2

）；Vir

E

蛋白––

與單鏈

T-DNA

結(jié)合（

形成

T

復(fù)合物），保護(hù)

T-

DNA

不被胞外核酸酶降解轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，

整合到寄主基因組中；Vir

C

蛋白––

與切割單鏈

T-

DNA

有關(guān)Vir

F

蛋白––

協(xié)助

T-

DNA

轉(zhuǎn)移到宿主植物細(xì)胞中Vir

H

蛋白對(duì)植物產(chǎn)Th的殺菌或抑菌物進(jìn)行解讀二、發(fā)根農(nóng)桿菌

Ri

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和功能Ri

質(zhì)粒：

200kb-

800kb

，

其基本結(jié)構(gòu)也與

Ti

質(zhì)粒相似，

包括致瘤區(qū)（

Vir

區(qū)）、

T-DNA

區(qū)和復(fù)制起點(diǎn)

Ori

。根據(jù)其合成的冠癭堿種類的不同可分為三類：

農(nóng)桿堿型、甘露堿型和黃瓜堿型。農(nóng)桿堿型

Ri

質(zhì)粒有兩段

T-

DNA

，即

TL

和

TR

，

可以分別插入植物基因組；甘露堿型和黃瓜堿型

Ri

質(zhì)粒只有單一

T-DNA

，

甘露堿型和黃瓜堿型

Ri質(zhì)粒的單一

T

區(qū)除其

25bP

邊界重復(fù)序列外，其他部分與

Ti

質(zhì)粒同源性很低，但它們與農(nóng)桿堿型

Ri

質(zhì)粒的

TL

區(qū)有較高的同源性。三、

Ti

質(zhì)粒載體的改造Ti

質(zhì)粒作為載體的可能性能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。能轉(zhuǎn)化多種植物。強(qiáng)啟動(dòng)子：

T-DNA

的

oPine

合成酶基因上有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，能啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。天然

Ti

質(zhì)粒載體的缺點(diǎn)分子量太大（

200kb

），

基因工程中難以操作

；限制性酶切位點(diǎn)太多，

難以找到單一的限制性位點(diǎn)

；T-DNA

區(qū)致瘤基因產(chǎn)物使被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞成為腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植株再生；在大腸桿菌中不能復(fù)制；質(zhì)粒上存在一些對(duì)

T-DNA

轉(zhuǎn)移不起作用的基因2

、除去

T-

DNA

上的有機(jī)堿Th物合成基因（

tmt

）；

因?yàn)橛袡C(jī)堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，

影響植物細(xì)胞的Th長(zhǎng)；3

、除去 Ti 質(zhì)粒上的其它非必需序列，

最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度；、安裝大腸桿菌復(fù)制子，

使其能在大腸桿菌中復(fù)制，以利于克隆操作；、安裝植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如 neor 基因，

使用植物基因的啟動(dòng)子和Poly

A

化信號(hào)序列；、安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。Ti

質(zhì)粒的改造1

、除去

T-

DNA

上的Th長(zhǎng)素（

tms

）和分裂素（

tmr

）

Th物合成基因，

因?yàn)榇罅康腡h長(zhǎng)素和分裂素會(huì)抑止細(xì)胞再Th長(zhǎng)為整株植物；（一）中間載體中間載體：

帶有重組

T-DNA

的大腸桿菌質(zhì)粒的衍Th載體目的：

解決體外操作中農(nóng)桿菌不能直接導(dǎo)入目的基因的困難具有

bom

位點(diǎn)

,

中間載體可以在不同細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移能在兩種不同的Th物中復(fù)制的，

既能在原核Th物中復(fù)制，

又能在真核Th物中復(fù)制的載體。具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因，

還有真核Th物的自主復(fù)制序列(

ARS)

以及選擇標(biāo)記性狀具有多克隆位點(diǎn)。卸甲載體由于影響植株再Th的直接原因是

T-DNA

中的

Onc

基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成為無(wú)毒的質(zhì)粒，

即“卸甲”

其“武裝”的

Ti

載體，稱為“卸甲載體”。卸甲載體：構(gòu)建無(wú)毒的

Ti

質(zhì)粒載體例：

PGV3850:

是從胭脂堿

Ti

質(zhì)粒

PTiC58

衍Th而來(lái)的PGV2250:

是從章魚堿

Ti

質(zhì)粒

PTiB6S3

衍Th而來(lái)的（二）中間表達(dá)載體中間表達(dá)載體：

是由中間載體（含選擇標(biāo)記）加上能在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子及目的基因構(gòu)成，也就是嵌合基因插入中間載體后構(gòu)成。嵌合基因（

chimeric

gene

）外源基因和植物表達(dá)元件（啟動(dòng)子、終止子、

5‘

和3’UTR

內(nèi)含子、信號(hào)肽等）連接在一起構(gòu)成基因。啟動(dòng)子Ti

質(zhì)粒Nos

（

胭脂堿合成酶基因）、

Ocs

（章魚堿合成酶基因）等基因具有與真核Th物啟動(dòng)子類似的

TATA

盒和

CAAT

盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，

并且無(wú)組織特異性。因此，

它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動(dòng)子。Ca

MV

的

35s

啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒

DNA

的的

35s

啟動(dòng)子能使嵌合的外源基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。（三

)

植物遺傳轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)一元載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（共整合載體）轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)雙元載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)1. 一元載體（

共整合）系統(tǒng)：有

2

個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒，農(nóng)桿菌

Ti

質(zhì)粒和大腸桿菌中間載體將外源基因裝載到小質(zhì)粒上，

然后把載有外源基因的小質(zhì)粒通過(guò)同源重組的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌的

Ti

質(zhì)粒。Ti

質(zhì)粒的其他部分PBR322

（含AMPr

）胭脂合成酶基因（

Nos)右邊界（

RB

）左邊界（

LB

）PBR322vector目的基因

重組載體卸甲載體外源基因插入

PGV3850

的過(guò)程中間載體共整合載體2.

雙元載體系統(tǒng)是指由兩個(gè)分別含

T-DNA

和

Vir

區(qū)的相容性突變

Ti

質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng)

,

又因?yàn)槠?/p>

T-DNA

與

Vir

基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上，

通過(guò)反式激活

T-DNA

轉(zhuǎn)移

,

故稱之為反式載體（

trans

vecter

）。穿梭載體（中間載體）主要包括兩個(gè)載體（

Ti

質(zhì)粒）卸甲載體（

Ti

質(zhì)粒）目的基因目的基因T-DNA

區(qū)左邊界右邊界OriA植物選擇標(biāo)記基因細(xì)菌選擇標(biāo)記基因OriE中間載體vir

區(qū)細(xì)菌選擇標(biāo)記基因Ori

區(qū)卸甲載體幫助質(zhì)粒農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌感染植物接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞核整合，表達(dá)VirE.coli穿梭載體左右外源基因Vir左右外源基因左右外源基因雙元載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化過(guò)程Ri

質(zhì)粒的

T-DNA

上的基因不影響植株的再Th，野Th的

Ri

質(zhì)粒直接可以用作轉(zhuǎn)化載體。Ri

轉(zhuǎn)化載體也有兩種構(gòu)建策略

:共整合載體：與

Ti

質(zhì)粒的共整合載體的不同之處是可直接利用野Th型的

Ri

質(zhì)粒。雙元載體：與

Ti

質(zhì)粒相同，其原理主要是

Ri

質(zhì)粒的

Vir基因反式作用驅(qū)動(dòng)

T-DNA

轉(zhuǎn)移。4.

Ri

轉(zhuǎn)化載體的改造第三節(jié)

植物病毒載體病毒轉(zhuǎn)化載體抗原展示型體載互性體補(bǔ)載插入型體載置型體換載雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體單鏈RNA病毒轉(zhuǎn)化載體單雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)化載體一、雙鏈

DNA

病毒轉(zhuǎn)化載體花椰菜花葉病毒（

CaMV

）：8kb

，

環(huán)狀

ds-DNA

，

8

個(gè)

ORF

，

最多可容納

250bP

外源

DNA

，

只能用于短暫表達(dá)

(transient

exPression)感染范圍窄；不整合到染色體中；外源基因表達(dá)水平高；表達(dá)時(shí)間較短；二、單鏈

RNA

病毒轉(zhuǎn)化載體TMV （煙草花葉病毒）載體優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化頻率高

;宿主范圍廣

;高拷貝，外源基因高效表達(dá)?？蓸?gòu)建抗原展示載體三、單鏈

DNA

病毒轉(zhuǎn)化載體雙生病毒：

2.5-3kb

，環(huán)狀

ss-DNA

，可感染單子葉植物。整合到染色體中；無(wú)致病性；免疫原性弱；可長(zhǎng)期表達(dá)外源基因；四、病毒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、置換型載體：

外源基因置換病毒基因組的外殼蛋白等基因、插入型載體：外源基因插入到病毒本身啟動(dòng)子下游、基因互補(bǔ)載體：

外源基因插入到有功能缺陷型病毒組分或亞組分內(nèi)，可采用

2

種交替突變的病毒，

可同時(shí)在宿主中存在、抗原展示型載體：在病毒外殼蛋白基因內(nèi)選擇性插入外源基因，將外源基因展示在病毒粒子的表面五、病毒載體與質(zhì)粒載體的比較優(yōu)點(diǎn)植物病毒或其侵染性的基因組是以一定的傳播途徑侵入寄主植物，

由其構(gòu)建的載體能把外源基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，復(fù)雜的裝配過(guò)程由細(xì)胞完成，而

Ti

質(zhì)粒載體是通過(guò)侵染轉(zhuǎn)化等復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過(guò)程而完成Ti

質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)將外源基因整合到植物核基因組上，而病毒載體感染植物后，一般不整合到植物細(xì)胞核

DNA

上，從而防止無(wú)限傳代擴(kuò)散，故比較安全可靠病毒載體感染植物細(xì)胞以后只是利用寄主細(xì)胞的功能在細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)；同時(shí)又由于病毒具有高效自我復(fù)制能力，故在轉(zhuǎn)化植物中可得到高拷貝外源基因，從而十分有利于外源基因的表達(dá)和功能的實(shí)現(xiàn)病毒能系統(tǒng)地侵染整株植物，避免了單細(xì)胞、原Th質(zhì)體或組織、器官的轉(zhuǎn)化和再Th培養(yǎng)，

能較快地獲得轉(zhuǎn)基因植物植物病毒的寄主范圍較廣，

因而由某種病毒基因組構(gòu)建的載體可用于多種不同植物的遺傳操作存在的問(wèn)題：1

、安全性2

、靶向性3

、有效性細(xì)胞毒性染色體毒性免疫毒性轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性轉(zhuǎn)導(dǎo)效率靶向性基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間表達(dá)的可調(diào)控性第四節(jié) 葉綠體轉(zhuǎn)化載體一、葉綠體基因組的特點(diǎn)高等植物的葉綠體基因組：①.

多數(shù)高等植物的

ctDNA

大約為

150kbP

：煙草ct

DNA

為

155

844bP

、水稻ct

DNA

為

134

525bP

。②.ctDNA

約能編碼

126

個(gè)蛋白質(zhì)：12%

序列是專為葉綠體的組成進(jìn)行編碼；③.

葉綠體的半自主性：有一套完整的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)，但又與核基因組緊密聯(lián)系。

如,

葉綠體中

RuBP

羧化酶的生物合成

8

個(gè)大亞基(

由葉綠體基因組編碼

)+

8

個(gè)小亞基

(

由核基因組編碼)二、

葉綠體轉(zhuǎn)化的發(fā)展三、葉綠體轉(zhuǎn)化載體的結(jié)構(gòu)左側(cè)質(zhì)體同原序列啟動(dòng)子5‘UTR

增強(qiáng)區(qū)3’UTR

終止子目的基因啟動(dòng)子3’UTR

終止子目的基因5‘UTR

增強(qiáng)區(qū)右側(cè)質(zhì)體同原序列外源基因整合的靶位點(diǎn)：

trnV

和

3’rPsl2

間,trnG

和trnfM

間，

trn1

和trnA

間四、表達(dá)調(diào)控元件（一）

NEP

和

PEP

型啟動(dòng)子調(diào)控元件16SRNA

操縱子的啟動(dòng)子

Prrn光調(diào)控的

psbA

啟動(dòng)子（二）

5’UTR 的核糖體結(jié)合位點(diǎn)噬菌體

T7

基因

10

表達(dá)序列

T7g10人工合成的

18bp

包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)的

rbcL5’UTR（三）

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（四）

3’UTR 終止子：

TrbcL,TpsbA,

Trbs16,TrrnB（五）

多基因表達(dá)元件50bp

的多順?lè)醋娱g基因表達(dá)元件煙草葉綠體轉(zhuǎn)化外源基因定點(diǎn)整合多個(gè)基因可以同時(shí)表達(dá)原核基因無(wú)需修飾改造就能直接表達(dá)蛋白表達(dá)水平高母系遺傳，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)小易于保持純系、后代不分離導(dǎo)入的外源基因性狀穩(wěn)定性高葉綠體基因組轉(zhuǎn)化的外源基因表達(dá)具有組織特異性四、

葉綠體轉(zhuǎn)化相對(duì)于核轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢(shì)五、葉綠體基因工程的應(yīng)用生物反應(yīng)器農(nóng)作物遺傳育種，改良農(nóng)藝性狀理論研究1. 葉綠體生物反應(yīng)器研究將植物葉綠體作為生物反應(yīng)器進(jìn)行生物制藥、表達(dá)藥用蛋白和疫苗，

具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它可以大大降低生產(chǎn)和運(yùn)輸成本、外源蛋白穩(wěn)定性高、易于純化等。這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使葉綠體基因組成為生產(chǎn)食用蛋白和人類藥用蛋白的理想平臺(tái)。2. 應(yīng)用于農(nóng)作物遺傳育種提高作物抗性抗旱基因、抗病原體蛋白基因、抗蟲基因、抗除草劑基因、耐鹽基因等一些重要的與抗逆相關(guān)的基因已經(jīng)實(shí)現(xiàn)葉綠體中的高表達(dá)提高作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值葉綠體參與了許多代謝反應(yīng)

,

如氨基酸、脂肪酸、淀粉等物質(zhì)的生物合成。因此

,

通過(guò)葉綠體遺傳工程技術(shù)

,

改造控制這些反應(yīng)的酶系統(tǒng)

,

或者直接將有意義的外源基因?qū)肴~綠體

,

將有可能實(shí)現(xiàn)葉綠體中高表達(dá)人類必需的氨基酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

,

從而提高作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。提高作物產(chǎn)量葉綠體能夠把光能轉(zhuǎn)換成對(duì)作物有用的化學(xué)能

,

而化學(xué)能是作物生物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)能量來(lái)源。所以

,

通過(guò)改善葉綠體的光合性能

,

比如對(duì)光合作用關(guān)鍵酶

Rubisco

進(jìn)行改造

,

能夠提高光合效率

,

進(jìn)而增加農(nóng)作物產(chǎn)量。3. 促進(jìn)基礎(chǔ)理論研究葉綠體基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制；核質(zhì)基因的互作機(jī)制；光合作用的機(jī)理；葉綠體基因的功能鑒定和葉綠體進(jìn)化等；第五節(jié)

遺傳轉(zhuǎn)化常用的選擇標(biāo)記基因及及無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，僅僅只有極少數(shù)植物受體細(xì)胞能獲得外源基因，而其中目的基因被整合到受體植物基因組并實(shí)現(xiàn)表達(dá)的細(xì)胞就更少因此，需要盡早對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行選擇，常用的且最簡(jiǎn)便的方法是使用特異性選擇標(biāo)記基因一、選擇標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因的特性：不存在于靶標(biāo)植物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或酶基因小，易于分子克隆可以利用表達(dá)元件在植物中充分表達(dá)檢測(cè)容易，并且能夠定量分析抗Th素選擇標(biāo)記基因除草劑選擇標(biāo)記基因安全選擇標(biāo)記基因二、報(bào)告基因報(bào)告基因系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、常用來(lái)判斷外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織）并檢測(cè)其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因理想的報(bào)告基因的最基本要求：）受體細(xì)胞中不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因的活性）它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞）具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測(cè) 特性常用報(bào)告基因-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）螢光素酶基因（

Luc

）綠色熒光蛋白（

GFP

）基因-

葡萄糖醛酸糖苷酶（

GUS

）

:編碼酶的作用底物是無(wú)色的

X-

葡萄糖苷酸（

X-glucuronide), 將它變成深藍(lán)色的

5-

溴

-4-

氯靛藍(lán)在一定條件下與底物

X-Gluc

發(fā)Th作用，

產(chǎn)Th蘭色沉淀反應(yīng)，既可用分光光度計(jì)測(cè)定又可以直接觀察植物組織形成的蘭色斑點(diǎn)當(dāng)加入

4-

甲基傘形酮基葡萄糖苷酸（

MUG

）

底物時(shí)，產(chǎn)Th

4-

甲基傘形酮，發(fā)熒光。因而可以用熒光光譜法測(cè)定熒光素酶

Luc

基因

:最常用的是來(lái)自螢火蟲的螢光素酶基因

,

在有氧的條件下，螢光素酶就會(huì)催化螢光素進(jìn)行氧化反應(yīng)，產(chǎn)Th

AMP

、

CO2

和黃綠色螢光綠色熒光蛋白基因（

GFP

）

:Vitoria來(lái)源于發(fā)光Th物水母（

Aequorea）體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白在水母體內(nèi)，水母蛋（

aequorin

）

與Ca2+

結(jié)合時(shí)會(huì)自發(fā)藍(lán)光，

GFP

受此藍(lán)光激發(fā)而發(fā)出綠色熒光在實(shí)驗(yàn)室條件下，

用標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光或者藍(lán)光照射時(shí)，

GFP

受激發(fā)也能發(fā)出綠色熒光Movie

2三 無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（一）位點(diǎn)特異性重組（二）同源重組（三）共轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（四）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（一）

位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)是指通過(guò)重組酶作用于兩個(gè)特定

DNA

序列實(shí)現(xiàn)重組。該系統(tǒng)由重組酶及其識(shí)別位點(diǎn)組成，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)正向排列時(shí)，重組酶可專一性地催化切除兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間的序列。FLR

／

FRTS

重組系統(tǒng)Cre

／

LoxP

系統(tǒng)R

／

RS

系統(tǒng)FRT 是重組酶

FLP

的特異作用位點(diǎn)，

LoxP

位點(diǎn)是重組酶

Cre

的特異作用位點(diǎn)，

RS

是R

的識(shí)別位點(diǎn)。來(lái)源于

P1

噬菌體的

Cre

重組酶為

34.1KDa

，

由

4

個(gè)亞基組成（

2

個(gè)