流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞技術(shù)和流式細(xì)胞儀第一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日本章內(nèi)容提要

概述

第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理

第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類與結(jié)構(gòu)

第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)

第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除

第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用

本章內(nèi)容小結(jié)第二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

流式細(xì)胞儀的定義流式細(xì)胞術(shù)的定義生物學(xué)顆粒的內(nèi)容流式細(xì)胞儀的發(fā)展史第三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

流式細(xì)胞儀的定義:流式細(xì)胞儀是以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。

第四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

流式細(xì)胞術(shù)的定義:應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù)。

第五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

生物學(xué)顆粒包括大的免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)菌、霉菌、染色體、真核細(xì)胞、雜交細(xì)胞、聚集細(xì)胞等，所檢測(cè)的生物顆粒的理化性質(zhì)包括細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、胞漿顆粒化程度、DNA含量、總蛋白質(zhì)含量、細(xì)胞膜完整性和酶活性等。第六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

1934年：Moldavan1967年：VanDilla和LosAlamos

1965年：Kamentsky

1969年：Fulwyler利用Sweet

80年代

90年代第七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

1934年Moldavan使懸浮的血紅細(xì)胞從一個(gè)毛細(xì)玻璃管中流過，每個(gè)通過的細(xì)胞可被一個(gè)光電裝置記錄下來，這可謂流式細(xì)胞儀的最初模型。第八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

1965年Kamentsky用紫外吸收和可見光散射兩個(gè)參數(shù)同時(shí)測(cè)量未染色的細(xì)胞，給出了細(xì)胞中核酸的含量和細(xì)胞大小，奠定了多參數(shù)流式細(xì)胞測(cè)量的基礎(chǔ)。第九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

1967年VanDilla和LosAlamos采用了Crosland-Taylor設(shè)計(jì)的層流流動(dòng)室和氬離子激光器開發(fā)出了液流束、照明光軸，檢測(cè)系統(tǒng)三者互相垂直的流式細(xì)胞儀，成為目前各種流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x的基礎(chǔ)。

第十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

1969年Fulwyler利用Sweet的靜電墨水噴射液滴偏轉(zhuǎn)技術(shù)，建立了流式細(xì)胞分選術(shù)。Ehrlich和Wheeless利用飛點(diǎn)掃描技術(shù)和縫掃描技術(shù)使零分辨率的流式細(xì)胞儀變成了低分辨率的流式細(xì)胞儀。第十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

80年代以來，流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)采集、存儲(chǔ)、顯示、分析日趨完善，隨著樣品制備方法的增多，新的熒光染料和細(xì)胞標(biāo)記物的出現(xiàn)，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大。

第十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日概述

進(jìn)入90年代，標(biāo)本制備儀和自動(dòng)進(jìn)樣器的問世，以及適合臨床應(yīng)用的單克隆抗體的增加，使流式細(xì)胞儀不僅出現(xiàn)在大專院校和科研單位，它也逐漸進(jìn)入醫(yī)院的中心實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)科。第十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理

一、生物學(xué)顆粒分析原理

二、細(xì)胞分選原理第十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理1.樣品的進(jìn)入流動(dòng)室：將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，沿流動(dòng)室的軸心向下流動(dòng)。第十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理2.鞘液的作用：流動(dòng)室軸心至外壁的鞘液也向下流動(dòng)，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測(cè)量區(qū)。第十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理3.信號(hào)的產(chǎn)生與接收：染色的細(xì)胞在測(cè)量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。這些信號(hào)分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。第十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)流式細(xì)胞儀的工作原理當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場(chǎng)時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。第十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類

（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

（二）激光光源與光束成形系統(tǒng)

（三）光學(xué)系統(tǒng)

（四）信號(hào)檢測(cè)與分析

（五）細(xì)胞分選器二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)第十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易掌握?？蒲行图扔蟹治龉δ苡钟蟹诌x功能，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來。第二十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)一、流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細(xì)胞儀和狹縫掃描流式細(xì)胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，可計(jì)算出細(xì)胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。

第二十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類與結(jié)構(gòu)

狹縫掃描流式細(xì)胞儀

被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時(shí)各部分被依次掃描。第二十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)二、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)（一）流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。

第二十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)

由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的。

第二十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)

由于激光焦點(diǎn)處能量分布為正態(tài)分布（見圖），中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時(shí)，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同。

第二十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（二）激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是一種相干光源，它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。

第二十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（三）光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長(zhǎng)通濾光片長(zhǎng)通濾光片使特定波長(zhǎng)以上的光通過。2.短通濾光片特定波長(zhǎng)以下的光通過。3.帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光通過第二十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。第二十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析

1.散射光信號(hào)散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。第二十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析

2.熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。第三十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析2.熒光信號(hào)

（1）熒光信號(hào)線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測(cè)時(shí)通常使用對(duì)數(shù)放大器。第三十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析2.熒光信號(hào)

（2）熒光信號(hào)的面積和寬度熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)DNA倍體測(cè)量時(shí)采用面積，這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號(hào)的寬度常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。第三十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（四）信號(hào)檢測(cè)與分析2.熒光信號(hào)

（3）光譜重疊的校正當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。第三十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)

從右圖中可以看出，陰影為探測(cè)器檢測(cè)光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PE光譜，而PE探測(cè)器則檢測(cè)到較多的FITC光譜。

第三十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)

圖中點(diǎn)A通過透鏡f成像在A’處，而點(diǎn)B通過透鏡f成像在B’處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號(hào)，從而確保了A點(diǎn)光源進(jìn)不了B’點(diǎn)處，B點(diǎn)光源也進(jìn)不了A’點(diǎn)處。

第三十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器1．小水滴的形成壓電晶體帶動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)，液流形成水滴。噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時(shí)，信號(hào)頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個(gè)水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個(gè)，則平均每40個(gè)水滴中只有一個(gè)水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。

第三十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器2．邏輯電路

為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測(cè)量區(qū)時(shí)判斷出哪個(gè)細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個(gè)邏輯信號(hào)，此信號(hào)驅(qū)動(dòng)充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。第三十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（五）細(xì)胞分選器3．水滴的充電與偏轉(zhuǎn)

當(dāng)水滴從流束上將要斷開時(shí)給整個(gè)流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對(duì)平行板電極形成的靜電場(chǎng)時(shí)，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。第三十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)（六）FCM測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(duì)(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光標(biāo)記物參數(shù)數(shù)量在逐漸增多。采用ListMode方式可大量節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。第三十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)

一、熒光測(cè)量靈敏度二、儀器的分辨率三、前向角散射光檢測(cè)靈敏度四、FCM分析速度五、FCM分選指標(biāo)第四十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)一、熒光測(cè)量靈敏度靈敏度的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)。一般以能檢測(cè)到單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測(cè)小于100個(gè)熒光分子的指標(biāo)。第四十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)二、儀器的分辨率分辨率是衡量?jī)x器測(cè)量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的平均值)第四十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)三、前向角散射光檢測(cè)靈敏度前向角散射光檢測(cè)靈敏度是指能夠檢測(cè)到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測(cè)量到0.2μ～0.5μ左右。第四十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)四、FCM分析速度分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)就會(huì)丟失，這段時(shí)間稱為儀器的死時(shí)間。死時(shí)間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個(gè)/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個(gè)細(xì)胞。第四十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第三節(jié)流式細(xì)胞儀的主要性能指標(biāo)五、FCM分選指標(biāo)分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。第四十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

流式細(xì)胞分析儀器是一項(xiàng)集多學(xué)科知識(shí)綜合應(yīng)用的復(fù)雜儀器，除了對(duì)儀器各方面性能指標(biāo)有嚴(yán)格的要求以外，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理方面也需要有豐富的基礎(chǔ)理論及操作經(jīng)驗(yàn)。

一、檢測(cè)樣品制備的重要性

二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色

三、FCM操作技術(shù)的質(zhì)量控制第四十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

一、檢測(cè)樣品制備的重要性因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀測(cè)量的是每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號(hào)，如果兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過多，都會(huì)影響信號(hào)的收集及所收集信號(hào)的真實(shí)性，所以制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。第四十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色散射光信號(hào)是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號(hào)。熒光信號(hào)來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。第四十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

三、流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制在臨床檢測(cè)中，應(yīng)對(duì)各個(gè)工作環(huán)節(jié)和儀器性能進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。

1．光路與流路校正

2．PMT校準(zhǔn)

3．絕對(duì)計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)第四十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

1．光路與流路校正主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測(cè)時(shí)的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。

第五十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

2．PMT校準(zhǔn)

流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時(shí)間的增加，其放大功率會(huì)有所改變，對(duì)樣品檢測(cè)的靈敏度會(huì)產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時(shí)進(jìn)行電壓補(bǔ)償。第五十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)流式細(xì)胞儀應(yīng)用的技術(shù)要求

3．絕對(duì)計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)

為保證儀器在計(jì)數(shù)時(shí)的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測(cè)定時(shí)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，從而獲得絕對(duì)計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。第五十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除一、儀器的維護(hù)1.激光電源的波動(dòng)范圍應(yīng)小于±10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在18℃～24℃，相對(duì)濕度小于85%。4.安裝單獨(dú)的可靠的地線。5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。第五十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法清洗液高度錯(cuò)誤清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液傳感器失靈與公司聯(lián)系數(shù)據(jù)處理速率錯(cuò)誤數(shù)據(jù)太大，難以處理稀釋樣品文件名錯(cuò)誤輸入的文件名與系統(tǒng)沖突輸入另一個(gè)文件名二、常見故障及排除第五十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法存取數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤流式細(xì)胞儀不能存取數(shù)據(jù)關(guān)開計(jì)算機(jī)重試程序錯(cuò)誤軟件不能執(zhí)行該程序選擇主菜單上的重建項(xiàng)程序號(hào)太大程序號(hào)不能大于32取消一些程序，再輸入相應(yīng)號(hào)碼沒有激光束激光器關(guān)閉檢查電源，開激光器二、常見故障及排除第五十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法激光器開啟錯(cuò)誤

激光器門打開

關(guān)激光器門

參數(shù)太多

選擇的參數(shù)應(yīng)小于8個(gè)

取消某些參數(shù)，重新選擇

參數(shù)不存在

程序中無此參數(shù)

重新建立程序

二、常見故障及排除第五十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)FCM的維護(hù)及常見故障的排除故障信息引起故障的原因解決方法樣品壓力錯(cuò)誤因?yàn)闃悠饭軌牧?，樣品不能被壓入流?dòng)室換一個(gè)樣品管建立樣品壓力錯(cuò)誤流式細(xì)胞儀連接錯(cuò)誤檢查連接，開關(guān)機(jī)重試鞘液高度錯(cuò)誤鞘液太少補(bǔ)充鞘液二、常見故障及排除第五十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用六、FCM對(duì)自身免疫性疾病HLA抗原的分析二、流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用三、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用四、流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用五、流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測(cè)中的分析七、流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用第五十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實(shí)踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫檢測(cè)、研究細(xì)胞周期等方面都起著相當(dāng)重要的作用。第五十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用二、流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。FCM在血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。第六十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用三、流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)研究中，應(yīng)用最頻繁也最普通的是細(xì)胞周期分析，研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系，包括細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比和細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定等內(nèi)容。對(duì)同一細(xì)胞的參數(shù)測(cè)定技術(shù)則導(dǎo)致了對(duì)細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。

第六十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用四、流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用近年來熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體，為流式細(xì)胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學(xué)的研究水平，并為流式細(xì)胞技術(shù)在腫瘤學(xué)的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。第六十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用五、流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測(cè)中的分析流式細(xì)胞術(shù)用于AIDS免疫功能的檢測(cè)是最重要的檢測(cè)手段，采用三參數(shù)熒光標(biāo)記計(jì)數(shù)可對(duì)T淋巴細(xì)胞及亞群進(jìn)行分析，并通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞亞群可以對(duì)HIV感染者或AIDS發(fā)病者進(jìn)行區(qū)別。

第六十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用六、FCM對(duì)自身免疫性疾病HLA抗原的分析利用FCM可以進(jìn)行HLA-B27／HLA-B7雙標(biāo)記抗體檢測(cè)HLA-B27陽性細(xì)胞，同時(shí)又可排出交叉反應(yīng)。通常58％～97％的強(qiáng)直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅2％～7％可檢出這種抗原。FCM檢測(cè)HLA-B27快速、特異、敏感，為強(qiáng)制性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。第六十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六節(jié)流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用七、流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥物的作用機(jī)制方面應(yīng)用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，可通過測(cè)DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進(jìn)行觀察。第六十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日本章小結(jié)

本章簡(jiǎn)要介紹了流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀的基本概念。論述了流式細(xì)胞儀的基本原理、流式細(xì)胞儀的分類和基本結(jié)構(gòu)、主要性能指標(biāo)、操作技術(shù)的質(zhì)量控制、流式細(xì)胞儀的維護(hù)及常見故障的排除以及流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用。第六十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日本章小結(jié)

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