看第十一章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交

potatotomatopomato泡馬豆本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第十一章原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)第二節(jié)原生質(zhì)體融合第三節(jié)以原生質(zhì)體為材料的基礎(chǔ)理論研究本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分(1)了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；(2)掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟；(3)掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法；(4)掌握原生質(zhì)體融合的方湊。本章教學(xué)目的與要求本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

1概念2設(shè)備與用具3化學(xué)試劑4酶類5原生質(zhì)體的分離與純化6原生質(zhì)體培養(yǎng)本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

1概念：1.1原生質(zhì)體（Protoplast）

指用特殊方法脫去植物細(xì)胞壁的、裸露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。沒有細(xì)胞壁，但具有活細(xì)胞的一切特征。1.2原生質(zhì)體培養(yǎng)指將植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜的培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞的全能性使其再生細(xì)胞壁，進(jìn)行細(xì)胞的分裂分化，并發(fā)育成完整植株的過程。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分1.3原生質(zhì)體培養(yǎng)的用途作為一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，應(yīng)用于植物細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的形成與功能、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)胞分化與脫分化等重大理論問題的研究。作為植物生物技術(shù)的一個(gè)重要分支，應(yīng)用于外源基因轉(zhuǎn)移、體細(xì)胞雜交、無性系變異及突變篩選。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2設(shè)備與用具除了組織培養(yǎng)的設(shè)備與用具之外，一些專門的儀器和用具：本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2.1倒置顯微鏡、熒光顯微鏡及照相設(shè)備血球計(jì)數(shù)板：檢查原生質(zhì)體或細(xì)胞培養(yǎng)密度。倒置顯微鏡:

觀察培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或三角瓶中的培養(yǎng)物。熒光顯微鏡：檢查原生質(zhì)體活性及去壁情況時(shí)，用熒光染料染色后觀察。顯微照相設(shè)備：記錄原生質(zhì)體和細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。haemocytometer

http://users.ugent.be/~pdebergh/pro/pro2_p2.htm本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分倒置顯微鏡熒光顯微鏡本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2.2細(xì)菌過濾器酶液和植物激素不能高溫高壓滅菌。用孔徑為0.45um的濾膜濾去細(xì)菌和病毒。抽濾瓶接真空泵抽濾滅菌，也可用注射器推壓過濾滅菌。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分無菌微孔過濾器無菌瓶頂過濾裝置濾膜?0.45um以下本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2.3離心機(jī)分離提純?cè)|(zhì)體用500轉(zhuǎn)／分離心3~5min，制備酶液用2500轉(zhuǎn)/分離心10min以除去殘?jiān)１疚臋n共97頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

1概念2設(shè)備與用具3化學(xué)試劑4酶類5原生質(zhì)體的分離與純化6原生質(zhì)體培養(yǎng)本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3化學(xué)試劑3.1無機(jī)化學(xué)試劑分析純?cè)噭?.2有機(jī)化學(xué)試劑1）維生素

泛酸鈣（維生素B5）、葉酸、維生素A、維生素C、維生素D、生物素、氯化膽堿、對(duì)甲基苯甲酸等。配制母液時(shí)先制備各個(gè)組分的貯液。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2）激素與組織培養(yǎng)的基本相同3）滲透壓穩(wěn)定劑

用來保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。采用糖醇系統(tǒng)，包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。濃度：-1原生質(zhì)體容易吸收葡萄糖，而蔗糖對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)不利。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分4）碳源和氮源

最常用的碳源是葡萄糖和蔗糖。有機(jī)氮源:水解酪蛋白、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸等。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3.3凝膠劑

除使用瓊脂粉外，還有瓊脂糖和一些國(guó)外同類產(chǎn)品，如日本的GellanGum。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分4酶類植物細(xì)胞壁由纖維素、半纖維素和果膠三種主要成分構(gòu)成。纖維素酶類（Cellulase）果膠酶類（Pectolyase）半纖維素酶類（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

1概念2設(shè)備與用具3化學(xué)試劑4酶類5原生質(zhì)體的分離與純化6原生質(zhì)體培養(yǎng)本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分5原生質(zhì)體的分離與純化5.1外植體的選擇

注意條件：選擇生長(zhǎng)旺盛的植物體幼嫩部分。植物的年齡、季節(jié)、光照、肥水條件等都明顯影響原生質(zhì)體的質(zhì)量。多數(shù)植物以葉肉細(xì)胞，根、下胚軸、幼葉、子葉等，溫室植株較好。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分禾本科植物：愈傷組織和懸浮細(xì)胞。最適宜的細(xì)胞是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的細(xì)胞。對(duì)植株進(jìn)行預(yù)處理，可提高原生質(zhì)體培養(yǎng)中的分裂頻率。預(yù)處理的方式:暗處理、低溫處理或預(yù)先在培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分5.2外植體滅菌與組織培養(yǎng)中的外植體滅菌相同。5.3酶解處理1)使用濃度和酶解時(shí)間

酶液的濃度和酶解時(shí)間因不同材料有所不同，一般需要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定。酶的選擇也因材料而異，愈傷組織和懸浮細(xì)胞可用活性較強(qiáng)的酶如纖維素酶OnozukaRS和果膠酶PectolyaseY23等，酶的濃度也大些。而葉片等材料，酶的濃度可小些。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分表幾種酶液的組成成分材料酶液成分小麥懸浮細(xì)胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.55mol·L-1,pH值5.6OnozukaRS2%,PectolyaseY230.2%水稻懸浮細(xì)胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.4mol·L-1,pH值5.6OnozukaR-101%,OnozukaRS0.5%,離析酶R-101%，PectolyaseY230.1%玉米懸浮細(xì)胞CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.5mol·L-1,pH值5.6OnozukaRS3%,離析酶R-100.5%PectolyaseY230.1%，半纖維素酶0.5%哈密瓜子葉CaCl2·2H2O1470mg·L-1，KH2PO495mg·L-1，MES600mg·Ｌ-1甘露醇0.4mol·L-1,pH值5.6OnozukaR-102%,離析酶R-101%本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2)酶解條件

黑暗、靜止，振蕩，以促進(jìn)酶解。酶解時(shí)間因材料而不同。不要超過24h，時(shí)間太長(zhǎng)不利于原生質(zhì)體，對(duì)以后培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂有影響。溫度25~27℃。3)滲透濃度應(yīng)試驗(yàn)不同滲透壓濃度的細(xì)胞反應(yīng)，找出適宜的滲透濃度。廣泛使用的山梨醇和甘露醇濃度為0.4~0.8mol·L-1。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分5.4原生質(zhì)體的收集和純化過濾和離心的方法進(jìn)行收集和純化。過濾:用40~100目去除雜質(zhì)。離心：75~100g離心3~5min，棄去上清液，純化：

1）再離心：先懸浮在洗液后離心，重復(fù)三次。

2）培養(yǎng)基清洗，離心，提取。調(diào)原生質(zhì)體培養(yǎng)密度:104-106/ml。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心加果膠酶和纖維素酶本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分葉片愈傷組織本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分1)形態(tài)識(shí)別

形態(tài)完整，含飽滿的細(xì)胞質(zhì)，有胞質(zhì)環(huán)流，顏色新鮮的即為存活的原生質(zhì)體。5.5活力測(cè)定本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2)

染色識(shí)別

用0.1%酚番紅或伊凡藍(lán)或熒光素雙醋酸（FDA）染色,有活力而質(zhì)膜完整的原生質(zhì)體對(duì)染料有排斥作用而不被染色，死亡的卻被染上顏色。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第一節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)

1概念2設(shè)備與用具3化學(xué)試劑4酶類5原生質(zhì)體的分離與純化6原生質(zhì)體培養(yǎng)6.1培養(yǎng)基6.2原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法6.3培養(yǎng)條件6.4原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分6.1培養(yǎng)基⑴培養(yǎng)基成分：KM－P；N6。⑵滲透壓穩(wěn)定劑：葡萄糖最好。隨胞壁再生和細(xì)胞持續(xù)分裂，其濃度須不斷降低，有利生長(zhǎng)。⑶無機(jī)鹽：降鐵、增鈣、降銨利于原生質(zhì)體培養(yǎng)。大量元素含量稍低，鈣離子濃度較高，采用有機(jī)氮源而少用銨鹽。6原生質(zhì)體培養(yǎng)本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分⑷有機(jī)成分：KM－P培養(yǎng)基中含豐富有機(jī)物質(zhì)。⑸激素：必需生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，注意其配比；調(diào)整激素要考慮后效應(yīng)。不同的植物對(duì)激素的種類和濃度要求不同。常采用1～2mg/L2,4-D或配以0.2～0.5mg/L的玉米素。⑹添加天然有機(jī)物如椰汁、酵母提取物等。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分5.3原生質(zhì)體培養(yǎng)6.2原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分常用液體淺層培養(yǎng)法和懸滴培養(yǎng)法。1）液體淺層培養(yǎng)法是將原生質(zhì)體懸浮液2～3mL于三角瓶或培養(yǎng)皿中，每天搖動(dòng)2～3次，防止原生質(zhì)體沉底。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體傷害?。蝗秉c(diǎn)：不易定位觀察原生質(zhì)體，而且分布不均勻，易造成局部原生質(zhì)體密度過高或粘聚，影響再生細(xì)胞的分裂和進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。（1）液體培養(yǎng)法：本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2)懸滴培養(yǎng)法：用滴管以0.1ml小滴接種到培養(yǎng)皿上，由于表面張力，小滴以半球形保持在培養(yǎng)皿表面。底皿加保濕液，將皿蓋蓋于底皿上，封口培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：材料少，生長(zhǎng)快，不易污染，易加入培養(yǎng)基，有利于低密度培養(yǎng)；缺點(diǎn)：原生質(zhì)體分布不均勻，集中在小滴中央，且與空氣接觸面大，液體容易蒸發(fā)，使培養(yǎng)基濃度提高。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分（2）固液雙層培養(yǎng)法

培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進(jìn)行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。

優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)緩慢釋放本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分（3）固體培養(yǎng)法

原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37C左右）等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。優(yōu)點(diǎn)：便于定位觀察、追蹤單個(gè)原生質(zhì)體再生細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程，避免細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響。缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，混合的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質(zhì)體不容易混合均勻。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分（4）念珠培養(yǎng)法/瓊脂糖珠培養(yǎng)法

含有原生質(zhì)體的瓊脂糖培養(yǎng)基切成塊，放在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分6.3培養(yǎng)條件濕度：密封溫度：25℃密度：104-106/ml。PH值：一般為。新鮮培養(yǎng)基的添加本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分6.4原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生細(xì)胞壁再生分裂愈傷組織或胚狀體形成植株再生本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分1)細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體失去特有的球形外觀，這種變化被視為再生新壁的象征.一般原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開始再生新的細(xì)胞壁，一至數(shù)天便可形成完整的細(xì)胞壁.本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2)細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)2-7天后,開始第一次分裂,第一次分裂的時(shí)間隨植物種類、分離原生質(zhì)體的材料、原生質(zhì)體的質(zhì)量、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分原生質(zhì)體的分裂本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3)愈傷組織形成與分化2周后形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，3周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約6周后形成直徑為2mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7-10天后及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長(zhǎng)。待小愈傷組織長(zhǎng)至1mm時(shí)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步生長(zhǎng)。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分肉眼可見細(xì)胞團(tuán)愈傷組織器官發(fā)生途徑胚胎發(fā)生途徑植株4)植株再生途徑本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分植株再生途徑器官形成途徑：一步成苗,將原生質(zhì)體再生的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上。胚胎發(fā)生途徑：兩步法，先將愈傷組織培養(yǎng)在含細(xì)胞分裂素（0.5～2.0mg/L）和低濃度2,4-D(0.02～0.2mg/L)的分化培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，形成質(zhì)地較硬的胚性愈傷組織或胚狀體，再將其轉(zhuǎn)到含細(xì)胞分裂素的分化培養(yǎng)基上再生植株。

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分7a:分離原生質(zhì)體10天后第1次分裂7b,c:2和3周齡小細(xì)胞團(tuán)

7d,e:4和6周齡小愈傷組織7f:轉(zhuǎn)到B5h培養(yǎng)基前8周齡小愈傷組織8a:轉(zhuǎn)到B5H培養(yǎng)基上的小愈傷組織和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)8b:轉(zhuǎn)到Boi2y培養(yǎng)基上的球形胚8c:轉(zhuǎn)到MS培養(yǎng)基上的子葉期胚以轉(zhuǎn)化為小植株紫花苜蓿葉片原生質(zhì)體分裂、克隆體的發(fā)育及通過體細(xì)胞胚再生小植株本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第二節(jié)原生質(zhì)體融合1概念2細(xì)胞融合的方法3細(xì)胞融合的程序4應(yīng)用

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第二節(jié)原生質(zhì)體融合

1定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細(xì)胞雜交，是以原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，借用動(dòng)物細(xì)胞融合方法發(fā)展和完善的一門新型生物技術(shù)，是以體細(xì)胞為材料，通過物理、化學(xué)因子的誘導(dǎo)進(jìn)行融合，得到雜種細(xì)胞的過程。目前已從許多種內(nèi)、種間、屬間甚至科間的體細(xì)胞雜交獲得雜種細(xì)胞系或雜種植株，其中有的已用于生產(chǎn)。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分顯微鏡下的細(xì)胞融合過程

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第二節(jié)原生質(zhì)體融合1概念2細(xì)胞融合的方法3細(xì)胞融合的程序4應(yīng)用

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2細(xì)胞融合的方法自發(fā)融合：去壁的裸細(xì)胞具有彼此融合的能力，在酶解細(xì)胞壁過程中，有些原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體，原因：由于不同細(xì)胞的胞間連絲擴(kuò)展和粘連造成的。自發(fā)融合是無意義，誘導(dǎo)融合：不同來源的原生質(zhì)體細(xì)胞用物理和化學(xué)的方法誘導(dǎo)使之融合的過程。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分（1）物理方法----電融合

70年代末80年代初出現(xiàn)。

電融合原理：指利用改變電場(chǎng)誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此相連成串，再施以瞬間強(qiáng)脈沖電壓促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，達(dá)到原生質(zhì)體融合的方法。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分融合室電融合儀方法：把有一定密度的原生質(zhì)體懸浮液置于融合室，小室兩端裝有電極。在不均勻交變電場(chǎng)的作用下，使原生質(zhì)體彼此靠近、接觸，排成一條鏈，再給予一個(gè)點(diǎn)脈沖，使原生質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而導(dǎo)致融合。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分電融合誘導(dǎo)法原理示意圖本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分1）在高頻電流電場(chǎng)下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s3)50s后4）1.5min后5）6min后6）15min后，原生質(zhì)體融合完成。甜菜原生質(zhì)體電融合過程本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分（2）化學(xué)方法采用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合。優(yōu)點(diǎn)：操作方便，不需要價(jià)格昂貴的儀器。ANaNO3處理時(shí)間：Carlson（1972）獲得了世界上第一個(gè)體細(xì)胞雜種——粉藍(lán)煙草和朗氏煙草體細(xì)胞雜種，原理：中和質(zhì)膜的負(fù)電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。缺點(diǎn):異核體形成頻率不高。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分B高pH-高鈣處理方法時(shí)間：1973年Keller和Melchers用強(qiáng)堿（pH值10.5）和高鈣離子（50mmol·L-1CaCl2·2H2O）溶液在37℃下處理原生質(zhì)體融合。優(yōu)點(diǎn):雜種產(chǎn)量高，缺點(diǎn)：高pH值對(duì)細(xì)胞是有毒。C聚乙二醇（PEG）處理方法時(shí)間：

1974年高國(guó)楠等。優(yōu)點(diǎn)：異核體形成頻率高，重復(fù)性強(qiáng)，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞低毒。廣泛應(yīng)用。結(jié)合PEG法與高pH-高鈣法，效果就更好。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分PEG法原理PEG是一種帶負(fù)電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊(duì)導(dǎo)致一個(gè)原生質(zhì)體的負(fù)性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分PEG法示意圖-+-橋梁+-PEG被洗掉+-+-電荷重排+-+-+-+-膜接觸本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分最為常用。具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)---篩選---再生雜合細(xì)胞dPEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第二節(jié)原生質(zhì)體融合1概念2細(xì)胞融合的方法3細(xì)胞融合的程序4應(yīng)用

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分

原生質(zhì)體融合示意圖本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3細(xì)胞融合的程序兩種親本的原生質(zhì)體分離用理化因子誘導(dǎo)融合異核體或雜種細(xì)胞的選擇雜種細(xì)胞的培養(yǎng)及再生雜種細(xì)胞的鑒定等。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3.1兩種親本的原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體分離方法見第一節(jié)。雙子葉植物中不論是從外植體還是培養(yǎng)細(xì)胞分離的原生質(zhì)體，都是細(xì)胞融合的良好材料。單子葉植物用胚性細(xì)胞，因?yàn)楹瘫究浦参锶~肉原生質(zhì)體不能分裂。細(xì)胞融合要求新鮮的原生質(zhì)體，因?yàn)榉蛛x純化后的原生質(zhì)體5～6h就開始長(zhǎng)壁，有的則更快。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3.2原生質(zhì)體融合采用第一節(jié)中的方法進(jìn)行。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞。A與B融合過程中，能預(yù)見哪些形式的細(xì)胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B等多聚體。未融合的A，B。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分融合類型同核體：同源原生質(zhì)體的融合體;

如：A-A，B-B以及A-A-A，B-B-B等多聚體。異核體：非同源原生質(zhì)體的融合體;

如：A-B多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分1）遺傳互補(bǔ)篩選法：原理：利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型篩選結(jié)果：兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細(xì)胞長(zhǎng)成植株呈綠色，并能成長(zhǎng)。3.3異核體或雜種細(xì)胞的選擇本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分2）抗性互補(bǔ)篩選法：原理：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對(duì)抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。如：

親本1：對(duì)放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個(gè)世代

親本2：對(duì)放線菌素D很敏感，但能在MS上生長(zhǎng)篩選結(jié)果：雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而親本和其它細(xì)胞死亡本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3）利用物理特性篩選法：原理：根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。親本1：用異硫氰酸熒光素染色原生質(zhì)體親本2：葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體篩選結(jié)果：在熒光顯微鏡下，親本1為紅色，親本2為綠色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分4）利用生長(zhǎng)特性篩選法：原理：利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長(zhǎng)，篩選結(jié)果：其融合細(xì)胞雙親互補(bǔ)可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分3.4雜種細(xì)胞的培養(yǎng)及再生可參考本章第一節(jié)。3.5雜種細(xì)胞或雜種植株的鑒定不同基因型親本融合形成的體細(xì)胞雜種與其親本比較具有一些明顯不同的遺傳特征，表現(xiàn)為細(xì)胞分裂和染色體數(shù)目不穩(wěn)定性、雜種植株的不育性等。

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第79頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分形態(tài)學(xué)分析——考察雙親植物，觀察其株高、株型、葉片大小、形狀、氣孔的大小與多少，花的形狀、大小及顏色等。細(xì)胞學(xué)分析——進(jìn)行染色體數(shù)的計(jì)算及形態(tài)觀察。18條染色體36條染色體本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第80頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分生物化學(xué)或分子生物學(xué)分析——1）同功酶譜分析，如酯酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶等的同功酶；2）RuBp羧化酶分析和FractionI蛋白分析；3）葉綠體DNA、線粒體DNA、核DNA的分析，采用Southern雜交和RELP圖譜分析。RAPD帶型（隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA）本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第81頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分抗性分析——檢測(cè)是否存在雙親中所具有的某些抗性性狀。育性分析——檢查花粉粒的大小、形狀、活性、能否開花結(jié)果，有無種子等。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第82頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分異核體：親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種、屬間融合形成的雜種體細(xì)胞一般不發(fā)生核融合，形成異核體。

異核體常常不發(fā)生細(xì)胞分裂、或細(xì)胞分裂不同步導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗、或細(xì)胞分裂幾次后停止生長(zhǎng)、或形成幾十個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)后停止生長(zhǎng)，致使親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種、屬間形成雜種幾率極低。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第83頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分

非對(duì)稱雜交：一方親本的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)與另一方親本的少量核物質(zhì)（1～2條染色體）和全部細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞質(zhì)雜交：一方親本的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)及另一方親本的全部細(xì)胞質(zhì)融合，有可能使兩種來源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起，這種雜種叫細(xì)胞質(zhì)雜種。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第84頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分胞質(zhì)雜種的產(chǎn)生各種途徑：

一個(gè)正常的原生質(zhì)與一個(gè)去核的原生質(zhì)體融合；

一個(gè)正常的原生質(zhì)體和一個(gè)核失活原生質(zhì)體的融合；

在異核體形成之后2個(gè)核中有1個(gè)消失；

在較晚的時(shí)期染色體選擇性地消除。本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第85頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分第二節(jié)原生質(zhì)體融合1概念2細(xì)胞融合的方法3細(xì)胞融合的程序4應(yīng)用

本文檔共97頁(yè)；當(dāng)前第86頁(yè)；編輯于星期二\17點(diǎn)51分生物種類細(xì)胞來源成功年代煙草兩個(gè)種間苷藍(lán)——青菜大豆——馬唐草矮牽?！埫婊ù篼湣ㄉ篼湣蠖剐←湣珷颗Ｓ筒恕蠖褂衩住蠖勾蠖埂巴愣勾篼湣Q豆大豆——草香木犀酵母菌——雞大豆——煙草大豆——秋水仙人——胡蘿卜番茄——馬鈴薯葉——葉葉——根愈傷組織——葉葉——花瓣種子——種子葉——懸浮細(xì)胞葉——花瓣葉——懸浮細(xì)胞葉——懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞——懸浮細(xì)胞葉——根懸浮細(xì)胞——葉原生質(zhì)體——血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞——葉懸浮細(xì)胞——葉腹水癌細(xì)胞——原