幽門螺桿菌在胃癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制

幽門螺桿菌在胃癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制【摘要】目的：探討Hp可能的致癌機(jī)制.方法：采用WarthinStarry嗜銀染色法檢測胃癌組織39例，胃黏膜不典型增生24例和慢性胃炎組織33例中的Hp感染情況；采用PCR法檢測上述標(biāo)本中HpcagA；采用免疫組化SP法檢測組織中iNOS,VEGF,cerbB2和ras癌基因產(chǎn)物p185和p21的表達(dá).結(jié)果：Hp,HpcagA,iNOS,VEGF,p185和p21在不典型增生和胃癌組織中的表達(dá)顯著高于慢性胃炎組織；Hp陽性慢性胃炎、不典型增生和胃癌組織中iNOS,VEGF和p21的表達(dá)顯著高于Hp陰性組，Hp陽性不典型增生及胃癌組織中p185的表達(dá)顯著高于Hp陰性組；慢性胃炎、不典型增生和胃癌組織中Hp與iNOS，VEGF和p21表達(dá)呈正相關(guān)，不典型增生和胃癌組織中Hp與p185表達(dá)呈正相關(guān).結(jié)論：Hp的致癌作用與其HpcagA的過度表達(dá)，增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞中iNOS和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞癌基因cerbB2和ras的活化密切相關(guān).

【關(guān)鍵詞】胃腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子類；一氧化氮合酶；癌基因；螺桿菌，幽門；細(xì)胞毒素相關(guān)基因

0引言

幽門螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1，2］，但Hp確切的致癌機(jī)制尚不清楚.我們通過對慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌組織中Hp和細(xì)胞毒素相關(guān)基因陽性株感染率，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，血管內(nèi)皮生長因子，cerbB2和ras癌基因產(chǎn)物p185和p21蛋白表達(dá)情況及Hp與iNOS,VEGF,p185和p21蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究，探討Hp可能的致癌機(jī)制.

1材料和方法

材料

解放軍第5醫(yī)院200201/200312纖維內(nèi)窺鏡活檢存檔蠟塊標(biāo)本96例，胃癌39例，男32例，女7例，平均年齡歲；胃黏膜不典型增生24例，男17例，女7例，平均年齡歲；慢性胃炎33例，男14例，女19例，平均年齡歲.

方法

標(biāo)本40g/L甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片.Hp感染采用WarthinStarry嗜銀染色，Hp呈棕黑色，彎曲成弧形、S形或海鷗狀，多位于胃粘膜表面和/或胃小凹及胃癌旁黏膜腺窩內(nèi).HpcagA基因的檢測采用PCR法.cagA引物序列：引物1：5′GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG3′，引物2：5′CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA3′，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；TagDNA酶、PCR染液購自北京賽百圣基因技術(shù)有限公司；dNTP購自南京生興生物技術(shù)有限公司.取石蠟塊切片3片，經(jīng)二甲苯脫蠟后，消化液消化，酚氯仿抽提DNA，-20℃?zhèn)溆?PCR反應(yīng)體系為50μL，包括DNA模板2μL,cagA引物1μL,cagA引物2μL,TagDNA酶μL,10×Tag緩沖液5μL,PCR染液5μL,dNTP1μL,ddH2O35μL.PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min后，95℃變性60s,50℃退火60s,72℃延伸60s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min.反應(yīng)結(jié)束后取13μL擴(kuò)增水相用15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在349bp出現(xiàn)電泳帶為陽性，否則為陰性.

iNOS,VEGF,p185和p21的表達(dá)采用免疫組化SP法.實(shí)驗(yàn)試劑iNOS兔抗人多克隆抗體、人抗兔免疫組化試劑盒、iNOS陽性對照片購自武漢博士德公司；VEGF,p185和p21鼠抗人mAb，免疫組化試劑盒及DAB顯色液，iNOS，VEGF，p185和p21陽性對照片購自福州邁新生物技術(shù)有限公司.陰性對照以PBS代替第一抗體，操作方法均按試劑盒說明書進(jìn)行.iNOS和VEGF主要為細(xì)胞質(zhì)著色，p185和p21癌基因蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，以上部位出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，以陽性細(xì)胞數(shù)所占比例分為“-”：陽性細(xì)胞數(shù)5%；“+”：5%≤陽性細(xì)胞數(shù)25%；“”：25%≤陽性細(xì)胞數(shù)50%.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，胃黏膜組織Hp和HpcagA+表達(dá)情況，Hp與iNOS,VEGF,p185和p21表達(dá)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，iNOS,VEGF,p185和p21表達(dá)情況采用秩和檢驗(yàn)，Hp與iNOS,VEGF,p185和p21表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析.

2結(jié)果

胃黏膜不典型增生和胃癌組織中Hp和HpcagA+株感染率顯著高于慢性胃炎組織；不典型增生和胃癌組織中iNOS,VEGF,p185和p21的表達(dá)顯著高于慢性胃炎組織；Hp陽性慢性胃炎、不典型增生和胃癌組織中iNOS，VEGF和p21的表達(dá)顯著高于Hp陰性組，Hp陽性不典型增生及胃癌組織中p185的表達(dá)顯著高于Hp陰性組；慢性胃炎、不典型增生和胃癌組織中Hp與iNOS,VEGF和p21表達(dá)呈正相關(guān)，不典型增生和胃癌組織中Hp與p185表達(dá)呈正相關(guān).表1胃黏膜組織Hp和HpcagA(+)株感染率表2胃黏膜組織iNOS,VEGF,p185和p21的表達(dá)表3胃黏膜組織Hp與iNOS,VEGF,p185和p21表達(dá)的關(guān)系表4Hp與iNOS,VEGF,p185和p21表達(dá)的相關(guān)分析

3討論

Hp感染后可能是通過其產(chǎn)生的細(xì)胞毒素，使組織損傷，胃黏膜上皮惡性轉(zhuǎn)化.CagA表達(dá)的cagA蛋白是Hp產(chǎn)生的主要細(xì)胞毒素.CagA陽性的菌株感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［3，4］.本研究結(jié)果顯示，胃黏膜不典型增生和胃癌組織中Hp和HpcagA+株感染率顯著高于慢性胃炎組織，證實(shí)Hp感染是慢性胃炎向胃黏膜不典型增生及胃癌發(fā)展的重要啟動(dòng)因子，cagA的存在與Hp的致癌作用密切相關(guān).iNOS通過促進(jìn)細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤血管形成，增加腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等機(jī)制參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程［5］.VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞的特異有絲分裂原，可特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖并增加血管通透性，與胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6］.我們研究發(fā)現(xiàn)，不典型增生和胃癌組織中iNOS和VEGF的表達(dá)顯著高于慢性胃炎組織；Hp陽性慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌組織中iNOS和VEGF的表達(dá)顯著高于Hp陰性組；慢性胃炎、胃粘膜不典型增生及胃癌組織中Hp感染與iNOS和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān).表明iNOS和VEGF在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起促進(jìn)作用；Hp感染可增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞中iNOS和VEGF的表達(dá).在正常情況下癌基因cerbB2和ras處于非激活狀態(tài),與細(xì)胞生長分化過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān).當(dāng)受到某些致癌因素作用后,其構(gòu)型改變或表達(dá)失控而被激活，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙，引起胃癌發(fā)生［7，8］.癌基因cerbB2和ras通過其產(chǎn)物基因蛋白p185和p21來表達(dá)其功能.本結(jié)果顯示，不典型增生和胃癌組織中p185和p21的表達(dá)顯著高于慢性胃炎組織，證實(shí)癌基因cerbB2和ras的擴(kuò)增導(dǎo)致p185和p21蛋白過度表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān).我們還發(fā)現(xiàn)，Hp陽性胃黏膜不典型增生及胃癌組織中p185蛋白的表達(dá)顯著高于Hp陰性組；胃黏膜不典型增生及胃癌組織中Hp與p185蛋白表達(dá)呈正相關(guān).Hp陽性慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌組織中p21蛋白的表達(dá)顯著高于Hp陰性組，慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌組織中Hp與p21蛋白的表達(dá)呈正相關(guān).說明Hp感染可引起胃黏膜細(xì)胞的癌基因cerbB2和ras活化或突變，使細(xì)胞增殖加快，促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展.

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