DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用培訓(xùn)課件

DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記

廣義的分子標(biāo)記（molecularmarker）是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。常用的是狹義的分子標(biāo)記概念，即DNA分子標(biāo)記。DNA分子標(biāo)記主要分為以下三類一、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)，以分子雜交為核心技術(shù)。二、DNA序列測(cè)定2DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用三、基于PCR的分子標(biāo)記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機(jī)引物擴(kuò)增和特定序列位點(diǎn)擴(kuò)增。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。隨機(jī)引物擴(kuò)增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）3DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用2、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物指紋分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:與RAPD技術(shù)不同的是引物濃度更高，長(zhǎng)度更短（5～8個(gè)bp），只有2個(gè)溫度循環(huán)（在RAPD中是3個(gè)溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、特征擴(kuò)增區(qū)段測(cè)序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標(biāo)RAPD片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)RAPD片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（一般比RAPD引物長(zhǎng)，24bp），再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來，可重復(fù)性高。4DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RFLP技術(shù)及其應(yīng)用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內(nèi)切酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性)是70年代發(fā)展起來的DNA片段分析技術(shù)。該技術(shù)不僅在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)的許多領(lǐng)域都有了成功的應(yīng)用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質(zhì)量評(píng)價(jià)方面也有許多應(yīng)用。5DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用基本原理

生物在進(jìn)化過程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，當(dāng)這種改變涉及到限制性酶切位點(diǎn)時(shí)，酶切后產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度將發(fā)生變化，限制性片段的長(zhǎng)度在不同個(gè)體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡(jiǎn)稱RFLP)6DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCT7DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用8DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用DNA多態(tài)性根據(jù)其產(chǎn)生的兩種基本方式堿基對(duì)突變類型(基因點(diǎn)突變),即限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上發(fā)生了單個(gè)堿基替換(轉(zhuǎn)換或顛換)，使原有切點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的切點(diǎn)。結(jié)構(gòu)重排型，這是由DNA內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所引起的。9DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用10DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RFLP與鐮狀細(xì)胞貧血11DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用基本實(shí)驗(yàn)步驟靶DNA的準(zhǔn)備核酸探針的標(biāo)記雜交顯示12DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RFLP的優(yōu)點(diǎn)及局限性

優(yōu)點(diǎn)：(1)普遍存在(2)穩(wěn)定性(3)共顯性(4)探針與限制酶的組合數(shù)量無限局限性：（1）用RFLP僅能檢測(cè)出影響到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的突變（2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多（3）RFLP分析技術(shù)要求DNA無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別（4）限制性內(nèi)切酶價(jià)格較貴

13DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RFLP用于親緣關(guān)系分析“Ladder”14DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RFLP在中藥材鑒別中的應(yīng)用

（一）近緣種的鑒別如：海馬的PCR-RFLP分析

（二）藥用植物親緣關(guān)系的研究如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與生物堿分布的關(guān)系

15DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RAPD技術(shù)及其應(yīng)用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由杜邦公司W(wǎng)illiams和Welsh兩個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)展起來的一項(xiàng)DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)高效、靈敏、簡(jiǎn)便、快速，一經(jīng)出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關(guān)系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農(nóng)作物育種等研究領(lǐng)域。近年，RAPD技術(shù)又進(jìn)入了中藥材的鑒別研究領(lǐng)域，并得到廣泛應(yīng)用，已成為目前用于中藥材鑒定報(bào)道最多的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)。16DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RAPD技術(shù)基本原理RAPD的核心技術(shù)是PCR反應(yīng)，但又不同于經(jīng)典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Williams稱之為RAPD，引物通常為10個(gè)堿基；Welsh稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物為20～30個(gè)堿基。對(duì)于任一引物，如在一定范圍內(nèi)模板DNA上有與之互補(bǔ)的反向重復(fù)序列時(shí)，就可擴(kuò)增出此范圍的DNA片段。17DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA18DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用基本實(shí)驗(yàn)步驟

模板DNA的制備PCR擴(kuò)增，通常RAPD擴(kuò)增條件為：93℃預(yù)變性200s，開始如下循環(huán)：94℃變性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；經(jīng)過40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min，循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物20μl反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況RAPD圖譜的數(shù)據(jù)處理19DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RAPD分析的優(yōu)越性和不足優(yōu)越性：(1)無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設(shè)計(jì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的引物，引物隨機(jī)合成或是任意選定的,長(zhǎng)度一般為9-10個(gè)寡核苷酸；(2)擴(kuò)增沒有特異性；(3)退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對(duì)，同時(shí)也允許了適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對(duì)，以擴(kuò)大引物在基因組DNA中配對(duì)的隨機(jī)性。(4)簡(jiǎn)便易行，省力省時(shí)。（5）檢測(cè)靈敏方便；（6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自動(dòng)化。20DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用不足：（1）重復(fù)性不高。RAPD在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)使用的是低溫復(fù)性(通常為36℃),特異性不高,引物與模板間有較高的錯(cuò)配率,結(jié)果容易受到多種因素的影響,不同的實(shí)驗(yàn)室這間有時(shí)不能重復(fù)；（2）對(duì)模板DNA質(zhì)量要求高，操作要求嚴(yán)格，檢驗(yàn)成本相對(duì)較高；（3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴(kuò)增產(chǎn)物；（4）RAPD標(biāo)記難以區(qū)分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。21DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用M12345678910111213141516不同Mg2+和dNTP濃度對(duì)RAPD帶型的影響22DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用123456789101112M不同Taq和Primer濃度對(duì)RAPD帶型的影響23DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用M12345678910111213

M13141516171819202122232425不同循環(huán)量和模板DNA濃度對(duì)RAPD帶型的影響24DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用

M123456CK789101112

不同復(fù)性溫度對(duì)RAPD帶型的影響25DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用圖4不同復(fù)性溫度對(duì)RAPD帶型的影響Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperature

M123456CK789101112

不同復(fù)性溫度對(duì)RAPD帶型的影響26DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用RAPD分析在中藥研究中的應(yīng)用

道地藥材的評(píng)價(jià)

例：當(dāng)歸藥材道地性的RAPD分析野生與栽培種及不同農(nóng)家品種親緣關(guān)系分析例：人參及山參RAPD指紋動(dòng)物藥的鑒定

例：蛇類藥材分子遺傳標(biāo)記鑒別的研究27DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP技術(shù)及其應(yīng)用

擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術(shù)，AFLP是近幾年來繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。被譽(yù)為新一代的分子標(biāo)記技術(shù)，近年來已得到廣泛的應(yīng)用。28DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP基本原理

AFLP的基本原理是對(duì)基因組DNA限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。先將基因組DNA用限制性酶消化，產(chǎn)生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（artificialadapter）,與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴(kuò)增反應(yīng)的模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。AFLP反應(yīng)的結(jié)果是主要擴(kuò)增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。29DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用基本實(shí)驗(yàn)步驟

模板的制備：即DNA酶切及人工接頭的連接（RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters）限制性片段的選擇性擴(kuò)增（Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments）擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析（Gelanalysisoftheamplifiedfragments）30DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP的實(shí)驗(yàn)過程31DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP反應(yīng)流程：AFLP反應(yīng)程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴(kuò)增及凝膠電泳分析這3個(gè)基本步驟。各步驟具體的過程有：首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。DNA片段的預(yù)擴(kuò)增。在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。

32DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用為什么用雙酶解?適合PCR擴(kuò)增的效率與變性膠的分辨率減少PCR擴(kuò)增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標(biāo)記單鏈成為可能增加PCR擴(kuò)增的靈活性增加使用引物的靈活性33DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用為什么要預(yù)擴(kuò)增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配降低背景噪音34DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用35DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLPs36DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用37DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用38DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用熒光標(biāo)記全自動(dòng)AFLPForABI377DNASequencerandAFLPKits39DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP技術(shù)特點(diǎn)擴(kuò)增效率高，多態(tài)性比例高AFLP標(biāo)記穩(wěn)定可靠，不受基因組來源和復(fù)雜度的影響，沒有種屬特異性AFLP技術(shù)較簡(jiǎn)便易行，不需要Southern雜交，不需要預(yù)先知道DNA的順序信息，對(duì)模板濃度的變化不敏感，允許一定程度的共擴(kuò)增，且只需要極少量的DNA材料AFLP是一項(xiàng)專利技術(shù)，受專利權(quán)保護(hù)，其分析試劑盒價(jià)格偏高40DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用AFLP在分子中藥中的應(yīng)用AFLP技術(shù)可產(chǎn)生豐富而穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記，它可以用于藥用植物遺傳分析的各個(gè)方面，如分類、系統(tǒng)發(fā)育、品種鑒別、遺傳圖譜構(gòu)建及目的基因的定位等例：AFLP法構(gòu)建人參、西洋參基因組DNA指紋圖譜

42DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記分析（SSR）微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復(fù)單位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。如果能夠?qū)⑦@些變異揭示出來，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個(gè)體間的多態(tài)性。SSR標(biāo)記又稱為sequencetaggedmicrosatellitesite,簡(jiǎn)寫為STMS，是目前最常用的微衛(wèi)星標(biāo)記之一。由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段克隆、測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列就可以人工合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來。由于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元在數(shù)量上的變異，個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化就產(chǎn)生長(zhǎng)度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)，每一擴(kuò)增位點(diǎn)就代表了這一位點(diǎn)的一對(duì)等位基因。由于SSR重復(fù)數(shù)目變化很大，所以SSR標(biāo)記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性。

43DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用SSR位點(diǎn)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)約50%呈多態(tài)性共顯性數(shù)目多且在基因組中均勻分布多數(shù)位點(diǎn)呈選擇中性，符合群體遺傳學(xué)了理論技術(shù)上適合用PCR分析半自動(dòng)化，結(jié)果可靠部分降解的DNA樣品也可用適合于等位酶變異小的居群水平的研究44DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用SSR位點(diǎn)標(biāo)記的缺點(diǎn)可用的位點(diǎn)數(shù)目少設(shè)計(jì)引物的費(fèi)用高，耗時(shí)長(zhǎng)物種專一性在說明群體分化和物種分化時(shí)可能產(chǎn)生錯(cuò)誤45DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用SSR標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域遺傳圖譜的構(gòu)建連鎖分析特殊的基因（如感病基因）姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號(hào)樣品分析、雜種分析）物種和居群的遺傳多樣性群體遺傳學(xué)分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體分化、遷移與基因流動(dòng)）傳粉生物學(xué)與散布生物學(xué)（如花粉和種子的散布、交配系統(tǒng)）保護(hù)生物學(xué)46DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用Comparisonamonggeneticmarkers47DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用由微衛(wèi)星衍生的微衛(wèi)星標(biāo)記微衛(wèi)星引物PCR(MP-PCR)也叫單引物擴(kuò)增RCP(singleamplificationPCR,簡(jiǎn)寫為SPAR)該方法是利用單個(gè)微衛(wèi)星的人工合成寡核苷酸片段為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？梢韵胂?，如果兩個(gè)反向排列的微衛(wèi)星出現(xiàn)于同一可擴(kuò)增的范圍內(nèi)，這兩個(gè)反向排列的微衛(wèi)星間的序列就可擴(kuò)增出來，因而該方法稱為微衛(wèi)星引物PCR。用此方法擴(kuò)增出來的是兩個(gè)反向排列的微衛(wèi)星之間的序列，并非微衛(wèi)星位點(diǎn)本身。實(shí)踐證明，用該方法對(duì)三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增效果較好，而對(duì)二核苷酸位點(diǎn)重復(fù)的擴(kuò)增效果較差。48DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用ISSR(Intersimplesequencerepeat)這是Zietkiewitcz等(1994)發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記。與SSR標(biāo)記相反，該法是直接利用同位素標(biāo)記的SSR序列為引物，用PCR的方法擴(kuò)增兩個(gè)SSR之間的單拷貝序列。為增加特異性，設(shè)計(jì)引物時(shí)在引物的5′端和3′端分別引入1～2個(gè)選擇性堿基，引物長(zhǎng)度16～18bp，擴(kuò)增產(chǎn)物通過放射自顯影顯現(xiàn)，這樣其擴(kuò)增物就是MP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的一部分，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。ISSR引物的開發(fā)不象SSR引物一樣需測(cè)序獲得SSR兩測(cè)的單拷貝序列，開發(fā)費(fèi)用降低。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不象SSR標(biāo)記一樣具有較強(qiáng)的種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測(cè)非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記，已用于遺傳作圖、品種鑒定等研究。

49DNA分子遺傳標(biāo)記在中藥中的應(yīng)用DNA測(cè)序技術(shù)及其應(yīng)用

DNA測(cè)序原理及方法優(yōu)點(diǎn)及不足

優(yōu)點(diǎn)：DNA測(cè)序技術(shù)重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確清楚，而且可以利用已測(cè)物種的DNA序列建立“對(duì)照序列”文庫，避免設(shè)立對(duì)照品。新測(cè)定的DNA序列也可加入此對(duì)照文庫中，供他人參考