透射電子顯微鏡1

透射電子顯微鏡

（TransmissionElectronMicroscopeTEM）

TEM具有和光鏡相似的結(jié)構(gòu)系統(tǒng),由電子槍產(chǎn)生的電子射線作為光源,由電磁透鏡代替光鏡中用玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡

TEM鏡體結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，鏡筒內(nèi)部要求高真空狀態(tài)

第一節(jié)透射電鏡結(jié)構(gòu)和工作原理

一、透射電鏡結(jié)構(gòu)二、透射電鏡工作原理★

第二節(jié)透射電鏡樣品制備技術(shù)

一、超薄切片技術(shù)★二、特殊組織樣品制備第一節(jié)透射電鏡的結(jié)構(gòu)和工作原理照明系統(tǒng)：電子槍、會(huì)聚透鏡鏡筒{成像系統(tǒng)：樣品室、物鏡、中間鏡、投影鏡觀察記錄系統(tǒng)：觀察室、底片室真空系統(tǒng)：機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵、真空管等輔助{電源系統(tǒng)：高壓電源、透鏡電源、調(diào)壓器等水冷系統(tǒng)：循環(huán)水泵等一、透射電鏡的基本結(jié)構(gòu)

（一）電子束與電磁透鏡

＆電子束在真空中運(yùn)動(dòng)的速度與加速電壓有關(guān)（陽(yáng)極）加速電壓越高，電子束的波長(zhǎng)越短(根據(jù)光學(xué)阿貝公式原理，一臺(tái)儀器的成像最高分辨率，約為它使用信息傳遞媒介波長(zhǎng)的一半。電鏡之所以能獲得很高的成像分辨率，是由于它的電子束波長(zhǎng)遠(yuǎn)較可見光的波長(zhǎng)為短）＆電磁透鏡的焦距與磁場(chǎng)（線圈組成，當(dāng)電流通過(guò)時(shí)產(chǎn)生磁場(chǎng)）強(qiáng)度有關(guān),磁場(chǎng)越強(qiáng)，焦距越短，放大倍率越高二、透射電鏡的工作原理

（二）電鏡圖像形成

任何物質(zhì)都是由原子組成的，當(dāng)均勻的電子束穿過(guò)樣品時(shí)會(huì)受到樣品上信息的處理多數(shù)電子可從原子和原子之間的空隙穿過(guò)，極少部分電子與原子核和軌道電子發(fā)生碰撞而形成散射電子散射電子能力強(qiáng)的地方透過(guò)電子數(shù)目少

打在熒光屏上所發(fā)出的光弱，顯現(xiàn)為暗區(qū)

散射電子能力弱的地方透過(guò)電子數(shù)目多

打在熒光屏上所發(fā)出的光強(qiáng)

顯現(xiàn)為亮區(qū)樣品結(jié)構(gòu)不同散射電子的能力不同，結(jié)果？

第二節(jié)透射電鏡樣品制備技術(shù)

一、常規(guī)樣品制備技術(shù)

超薄切片技術(shù)※負(fù)染技術(shù)

二、特殊樣品制備技術(shù)

電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫電鏡技術(shù)電鏡原位雜交技術(shù)等

普通光鏡切片厚度約5μm左右—石蠟切片透射電鏡切片厚度在50nm左右—超薄切片（100nm以下）

目前有關(guān)生物體的各種組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)知識(shí)大部分是超薄切片技術(shù)所提供

一、超薄切片制備技術(shù)

取材預(yù)固定后固定脫水浸透包埋修塊切片染色

超薄切片技術(shù)的基本操作程序

快

盡量保持其生活狀態(tài)，在1分鐘內(nèi)固定

小1mm3的小塊

輕不要牽拉、鋸、擠壓組織

冷

4℃保存

（一）取材

1、固定目的

把在活體狀態(tài)時(shí)的結(jié)構(gòu)盡可能完整保存下來(lái)

2、常用固定劑⑴戊二醛（glutaraldehyde）對(duì)糖原、糖蛋白、尤其是微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞基質(zhì)有較好的固定作用

⑵四氧化鋨(osmiumtetroxide,OSO4)對(duì)含蛋白質(zhì)、脂肪性物質(zhì)有良好的固定作用特別對(duì)磷脂蛋白膜的結(jié)構(gòu)有良好的保存作用

（二）固定⑶高錳酸鉀(potassiumpermangauate)

對(duì)磷脂蛋白類有特別良好的固定作用

尤其對(duì)神經(jīng)髓脂質(zhì)的保護(hù)更為顯著⑷甲醛（formaldehyde）

對(duì)酶活性的保存卻優(yōu)于戊二醛

在電鏡細(xì)胞化學(xué)中常采用

3固定方式

⑴組織塊浸泡固定取數(shù)塊1mm3的組織塊迅速浸泡于固定液中

⑵體內(nèi)原位固定

適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將動(dòng)物麻醉解剖，暴露所需的組織或器官，立即用預(yù)冷的戊二醛滴到上面直到組織適度變硬，再取數(shù)塊組織固定

⑶灌流固定

多用于腦、腎贓、視網(wǎng)膜和睪丸等組織將固定液經(jīng)血液循環(huán)灌流到動(dòng)物體內(nèi),把活細(xì)胞在原位及時(shí)固定

指將樣品內(nèi)所含的游離水分完全清除的過(guò)程(常用的脫水劑為乙醇和丙酮)

50%乙醇10～15分鐘4℃70%乙醇10～15分鐘4℃80%乙醇10～15分鐘4℃

90%乙醇10～15分鐘4℃

100%乙醇3次，每次10分鐘，室溫（三）脫水

經(jīng)脫水處理的樣品，即可用包埋劑進(jìn)行浸透

浸透利用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑使細(xì)胞內(nèi)外所有空隙都被包埋劑填充包埋浸透好的樣品塊放入灌滿包埋劑的膠囊或適當(dāng)?shù)哪＞咧薪?jīng)過(guò)紫外線照射或加溫聚合，即可制成包埋塊包埋劑環(huán)氧樹脂618、Epon812LowiscrylK4M低溫樹酯包埋劑（四）浸透與包埋

（半薄切片的意義：

1、選取超薄切片的部位

超薄切片的面積一般要小于0.5mm2，要經(jīng)過(guò)半薄切片選取有意義的部位（對(duì)腎臟、胰腺、腦、肌組織等更重要）

2、對(duì)同一部位進(jìn)行光、電鏡對(duì)比觀察

通過(guò)半薄切片可以在較大范圍內(nèi)了解組織結(jié)構(gòu)、病變部位和病理性質(zhì)，有利于更確切的認(rèn)識(shí)超薄切片中的結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系。五、半薄切片熱膨脹推進(jìn)式切片機(jī)利用金屬桿加熱產(chǎn)生的

微小長(zhǎng)度變化提供進(jìn)給

機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)用微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿

來(lái)提供微小進(jìn)給

超薄切片機(jī)(Ultrotome)六、超薄切片◆安裝包埋塊、安裝玻璃刀、調(diào)整包埋塊和刀的距離、調(diào)節(jié)水槽高度與燈光的位置、調(diào)節(jié)水槽液面、選擇切片速度及進(jìn)給厚度、片子切出后，漂浮在水槽的液面上，經(jīng)展片后撈到載網(wǎng)上

◆判斷切片厚度：一般利用切片表面反射的光和從切片下面反射光發(fā)生干涉所產(chǎn)生的干涉色為依據(jù)不同厚度的切片在顯微鏡下呈現(xiàn)不同的干涉色灰色40-50nm

銀灰色50-70nm金黃色70-90nm紫色90nm以上切片操作

電鏡圖像反差是由于電子束經(jīng)過(guò)樣品時(shí)電子散射程度不同產(chǎn)生的

散射的電子數(shù)越多，圖像越？散射的電子數(shù)越少，圖像越？◆重金屬化合物有較強(qiáng)的電子散射能力,所以經(jīng)過(guò)重金屬染色的樣品呈現(xiàn)較強(qiáng)反差

七、電子染色常用的染色劑有醋酸鈾和枸櫞酸鉛◆醋酸鈾（Uranylacetate）能與細(xì)胞內(nèi)多種成分結(jié)合，尤其對(duì)核酸核蛋白等有較強(qiáng)的結(jié)合能力◆枸櫞酸鉛(leadcitrate)能提高細(xì)胞膜系統(tǒng)及其脂類的反差

(一)骨組織樣品制備方法（二）培養(yǎng)細(xì)胞樣品制備方法（三）血細(xì)胞樣品制備方法（四）石蠟包埋樣品轉(zhuǎn)制方法二、幾種特殊組織的樣品制備方法

1.將新鮮骨組織鋸成2—3mm厚的骨片，立即投入固定液中24小時(shí)（4℃）。

2.漂洗后投入脫鈣液中在室溫或4℃下進(jìn)行脫鈣（正常密質(zhì)骨脫鈣時(shí)間一般為3-4周，松質(zhì)骨為7-10天，4℃脫鈣時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)）3.脫鈣后再將樣品修成1mm3大小，然后充分浸泡，再按常規(guī)方法進(jìn)入后固定、脫水、浸透包埋、半薄、超薄切片和電子染色。(一)骨組織樣品制備方法脫鈣液配制乙二胺四乙酸二鈉40-50g雙蒸餾水500ml0.2mol/LNaOH350ml雙蒸餾水加至1000ml1、將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液倒掉，加入預(yù)冷的2.5%戊二醛固定2、用橡皮刮子將全部細(xì)胞從管壁上輕輕刮下，收集在離心管內(nèi)離心（2000轉(zhuǎn)/分）15-20分鐘3、棄上清，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊取出，用棉花紙包裹起來(lái)，然后進(jìn)行漂洗等后面的程序二、

培養(yǎng)細(xì)胞樣品制備方法

負(fù)染色技術(shù)主要用于細(xì)菌、病毒、噬菌體等微生物大分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞碎片以及分離的細(xì)胞器等研究工作

又稱陰性染色，指通過(guò)重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強(qiáng)樣品外周的電子密度，使樣品顯示負(fù)反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小三、負(fù)染色技術(shù)((Negative）

當(dāng)把有些重金屬的鹽溶液與生物材料的懸浮液混合以后，重金屬的鹽類不是被樣品成分所吸收，而是沉淀到樣品四周如果樣品具有高低不平表面結(jié)構(gòu)，染液還能穿透進(jìn)表面的凹陷部分。這樣在重金屬元素沉淀的地方，散射電子的能力增強(qiáng)，因而樣品四周表現(xiàn)為暗區(qū)，而在有樣品的地方散射電子能力弱，因而表現(xiàn)為亮區(qū)。這樣便能把樣品的外形與表面結(jié)構(gòu)清楚地襯托出來(lái)目前，對(duì)其染色原理還不十分清楚，有密度反差原理和異常反差原理二種觀點(diǎn)。

（一）負(fù)染技術(shù)的原理1.染色液目前最常用的為磷鎢酸（Phosohotungstate）配制成2-4%磷鎢酸水溶液磷鎢酸的密度約為4，而生物標(biāo)本的密度為1外周染料密度與標(biāo)本密度相差4倍直徑很小的物體可被清晰地顯現(xiàn)出來(lái)

2.染色方法負(fù)染色所用的樣品全部取自懸浮液將帶有樣品的懸液，滴于有支持膜的銅網(wǎng)上，靜止數(shù)分鐘后滴上染液數(shù)秒鐘到2分鐘，隨后進(jìn)行電鏡觀察（二）負(fù)染樣品的制備

第三章重點(diǎn)

電子槍發(fā)射電子經(jīng)會(huì)聚透鏡會(huì)聚成電子束投射在樣品上，電子直接穿透樣品產(chǎn)生透射電子，透射電子帶有樣品信息，經(jīng)成像系統(tǒng)放大投射到觀察室的熒光屏上，熒光屏將電子影象轉(zhuǎn)化為可見光影象以供使用者觀察透過(guò)的電子多熒光屏亮，反之熒光屏暗，熒光屏的亮、暗程度與樣品微細(xì)結(jié)構(gòu)一一對(duì)應(yīng)，最終產(chǎn)生具有一定反差的黑白影像一、透射電鏡工作原理

LM

TEM照明源光線電子分辨率0.2μm0.1nm放大1000×150萬(wàn)×透鏡玻璃磁透鏡應(yīng)用顯微水平亞顯微