分子生物學(xué)第05章核酸的分子操作

5.1限制性內(nèi)切酶5.2操作和標(biāo)記核酸的酶5.3分子雜交5核酸的分子操作工具酶的種類①

核酸酶：用于切割或降解核酸分子。②

連接酶：用于把核酸分子連接到一起。③

聚合酶：用于核酸分子的擴(kuò)增和拷貝。④

修飾酶：用于給核酸分子添上或減去某些化學(xué)基團(tuán)或核苷酸。

工具酶的來源

這四大類酶大都是從細(xì)菌和噬菌體中純化出來的，在細(xì)胞中它們原本就參與DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、降解外來核酸分子、修復(fù)突變的DNA分子和不同DNA分子間重組等一系列重要的生命反應(yīng)過程。在重組DNA技術(shù)中，它們被用來在人工控制的條件下（體外）工作。值得一提的是，絕大多數(shù)這類酶促反應(yīng)是無法用其它方法來替代完成的，這種不可替代性使這些工具酶在重組DNA技術(shù)中占據(jù)了極其重要的地位。

限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)50年代初有兩個實驗室在研究噬菌體的宿主范圍時相繼發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個噬菌體從其天然宿主，如E.coli的品系A(chǔ)，轉(zhuǎn)到另一個品系B時，往往不能生長。但如果進(jìn)行大量的感染，則有個別噬菌體能生存下來。研究表明，噬菌體在非天然宿主品系中不能生存，是因為噬菌體的DNA被降解了，而細(xì)菌自身的DNA卻不被降解。為了解釋這種現(xiàn)象，人們提出了限制－修飾酶假說。限制－修飾假說

限制－修飾假說認(rèn)為，細(xì)菌細(xì)胞中含有兩種酶，一種是限制性核酸內(nèi)切酶，一種是DNA甲基化酶，這兩種酶成對出現(xiàn)，二者對DNA分子有相同的識別序列。DNA甲基化酶在識別序列處特定的核苷酸上甲基化。限制性內(nèi)切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。因此，非甲基化的外來DNA會被限制性內(nèi)切酶降解。

完全甲基化和不完全甲基化

一條鏈上甲基化而另一條鏈上沒有甲基化的稱為不完全甲基化（如剛經(jīng)過半保留復(fù)制的DNA分子），兩條鏈都甲基化的稱為完全甲基化。DNA甲基化酶可以對非甲基化的及不完全甲基化的識別序列進(jìn)行甲基化。

1968年從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型限制性內(nèi)切酶，1970年分離出了Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，從而證實了上述假說。

各種類型限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)比較性質(zhì)Ⅱ型Ⅲ型Ⅰ型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能獨立的內(nèi)切酶和甲基化酶由2個亞基組成的雙功能酶由3個亞基組成的復(fù)合功能酶識別部位短小序列（大多為4~6bp），常為回文結(jié)構(gòu)5~7bp的不對稱序列不對稱序列，例如（AACN6GTGC)*切割部位同于或接近于識別部位距識別位點3’端24~26bp處非特異性，距識別部位大于1000bp限制作用所需的輔助因子Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸Ⅱ型限制性內(nèi)切酶的特點

Ⅱ型酶分子量小，為單亞基多體酶（同源二聚體），以Mg2+為輔助因子，只有切割作用，沒有修飾作用（有獨立的與之相匹配的甲基化酶）。Ⅱ型酶的識別序列一般為4~6個bp,切割位點在識別序列內(nèi)或相鄰處（Ⅱs型，shiftedcleavage），見表5－2。切割位點在識別位點相鄰處的例子如HgaⅠ，其識別序列和切割位點記為GACGC（5/10），表示切割位點為

5＇GACGCNNNNN↓3＇3＇CTGCGNNNNNNNNNN↑5＇表5－2部分Ⅱ型限制性內(nèi)切酶及其切割位點酶鹽濃度溫度識別序列及切割位點切割產(chǎn)生的末端EcoRⅠ高37℃G↓AATTC(5’突出粘性末端）---GAATTC------CTTAAG---HaeⅢ中37℃GG↓CC（平端）---GGCC------CCGG---MboⅠ高37℃↓GATC（5’突出粘性末端）---GATC------CTAG---PstⅠ中21~37℃CTGCA↓G（3’突出粘性末端）---CTGCAG------GACGTC---限制性內(nèi)切酶切割位點的多寡

如果DNA上的核苷酸順序是隨機(jī)的，則對于以4個bp為識別序列的Ⅱ型酶來說，平均44（256）個核苷酸就有一個靶序列；而對于以6個bp為識別序列的酶則平均46（4096）個核苷酸就有一個靶序列。同裂酶和同尾酶

具有相同識別序列的酶稱為同裂酶（isoschizomers），切割位點可以相同也可以不同。如MboⅠ和Sau3AⅠ的識別序列和切割位點均為↓GATC，XmaⅠ的識別序列和切割位點為C↓CCGGG，而具有與其相同識別序列的SmaⅠ的切割位點為CCC↓GGG。

識別序列不同，但切出的粘性末端相同的酶稱為同尾酶（isocaudamers）。例如

BamHⅠ

G↓GATCC

BglⅡ

A↓GATCT

BclⅠ

T↓GATCA

Sau3AⅠ

↓GATCⅡ型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件①反應(yīng)溫度和時間：37℃保溫適當(dāng)長的時間，保溫時間一般從半小時到數(shù)小時，可通過預(yù)備實驗確定或按文獻(xiàn)資料進(jìn)行。②反應(yīng)體積：一般為幾十μl。③底物DNA：用無DNase的RNase除去可能污染的RNA；用乙醇多次沉淀可除去各種雜質(zhì)（如酚、SDS、EDTA等），最后吹干乙醇并溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。Ⅱ型限制性內(nèi)切酶所需反應(yīng)條件④反應(yīng)系統(tǒng)：緩沖液應(yīng)過濾除菌或高壓滅菌，根據(jù)不同的限制性內(nèi)切酶選擇高、中、低鹽濃度。當(dāng)用兩種以上的限制性內(nèi)切酶切割時，應(yīng)先用需低鹽濃度的酶，再用需高鹽濃度的酶。所加酶量要適當(dāng)。1單位酶的定義：在限定的溫度（一般為37℃）和緩沖液條件下，在20μl反應(yīng)液中，1小時消化1μgDNA所需的酶量。

限制性內(nèi)切酶的命名

第一個大寫字母（斜體）為產(chǎn)酶微生物屬名的第一個字母，第二、三兩個小寫字母（斜體）為種名的前兩個字母，第四個大寫或小寫字母（正體）為變種或株系名的第一個字母，最后的羅馬數(shù)字為序號（從同一種微生物中分離出了幾種限制性內(nèi)切酶時按發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序編號）。流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）Rd株：HindⅢ大腸桿菌（Escherichiacoli）Ry13株：EcoRⅠ淀粉液化芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）H株：BamHⅠ核酸的凝膠電泳

為了檢測酶切后DNA片段的大小，必須進(jìn)行凝膠電泳分離。往電泳體系中加溴化乙錠或電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，就可以在紫外光下看到DNA帶，靈敏度可達(dá)5ng。RNA電泳也可用溴化乙錠染色，但靈敏度低得多。

DNA凝膠電泳常以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，前者用于較大片段的分離，后者用于較小片段的分離和序列測定。溴化乙錠結(jié)構(gòu)式表5－3凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍凝膠種類凝膠濃度（%）分離線性DNA的有效范圍二甲苯青溴酚藍(lán)瓊脂糖0.30.60.91.21.52.05~60kb1~20kb0.5~7kb0.4~6kb0.2~4kb0.1~3kb1000bp150bp聚丙烯酰胺3.55.08.012.020.0100~2000bp80~500bp60~400bp40~200bp6~200bp460bp260bp160bp70bp45bp100bp65bp45bp20bp15bpDNA大小與遷移距離的關(guān)系

在一定范圍內(nèi)，DNA分子遷移的距離與其核苷酸對（bp）的對數(shù)成反比。DNA分子的狀態(tài)與遷移速度的關(guān)系

在無EB下電泳，cccDNA泳動速度最快，linear

DNA次之，ocDNA最慢。隨著EB濃度的增加，更多的EB結(jié)合到DNA上，cccDNA分子的負(fù)超螺旋逐漸解開，其分子半徑增加，遷移速率減小。達(dá)到游離染料的臨界濃度時，不再有超螺旋，cccDNA分子的遷移速率達(dá)最小值。繼續(xù)增加EB，便形成正超螺旋，DNA分子變得更加致密，遷移速率迅速增加。對絕大多數(shù)cccDNA分子而言，游離EB的臨界濃度介于0.1～0.5μg/ml。由于電荷的中和，以及EB賦予DNA較大的剛性，隨著EB濃度的增加，linearDNA和ocDNA的遷移速率也有不同程度的減小。

大分子DNA的電泳分離

在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，有效分離天然DNA分子的大小最大只能到15～20kb。更大的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速率相同。此時凝膠不能再按分子大小分離DNA，DNA分子像通過彎管一樣，以其一端指向電場的一極而通過凝膠，這種遷移模式謂之“爬行”。脈沖電泳

1983年，Schwartz等提出了脈沖電場凝膠電泳的設(shè)計思想，從而找到了解決這一問題的辦法。這一方法在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大DNA分子便滯留在爬行管里，直至沿新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。若DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA分子就可以按其大小分開。分子越大，轉(zhuǎn)向所需的時間越長，總的遷移距離就越短，從而達(dá)到分離的目的。

交變脈沖垂直定向電場電泳

Schwartz和Cantor（1984）最先設(shè)計的脈沖電場凝膠電泳裝置采用了交變脈沖垂直定向電場和線電極。non-uniformfield（200V）intheN-Sdirectionuniformfield（85V）intheE-Wdirection電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，F(xiàn)IGE

Carle等（1986）設(shè)計的裝置為利于單個電場的周期性倒轉(zhuǎn)（電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳，field-inversiongelelectrophoresis，F(xiàn)IGE），舍棄了正交排列的兩個電場。電場在兩個方向上都是均一的，而正向脈沖稍長于反向脈沖，從而導(dǎo)致了DNA沿相當(dāng)筆直的軌跡運動。應(yīng)用微處理機(jī)增加電泳時脈沖的絕對長度并保持正反象脈沖的比例不變，可以使分辨力達(dá)到最大。FIGE可分辨長達(dá)2000kb的DNA片段。

10.5V/cm，λ/XhoⅠ兩個片段，15kb和33.5kb，在正向0.5sec，反向0.25sec分得很開；T5125kb，T4170kb，在正向3sec，反向1sec分得很開。電場倒轉(zhuǎn)凝膠電泳的分離效果垂直凝膠脈沖電泳

Gardiner等（1986）使用的是垂直凝膠裝置，鉑絲電極裝在凝膠的兩個對邊上。DNA先向一組電極移動，電場轉(zhuǎn)換后則向另一組電極移動。這種“之”字形運動的凈結(jié)果是從加樣孔指向凝膠底部的直線。由于凝膠中的所有泳道均處在相同的電場下，所以DNA的條帶不會發(fā)生水平變形。這種系統(tǒng)的分辨上限大約為9000kb。鉗位均勻電場脈沖電泳

鉗位均勻電場電泳（CHEF）中，由多個在水平凝膠的周圍沿正方形或六邊形排列的電極產(chǎn)生電場，這些電極都被鉗制在預(yù)定的電位上。正方形排列的電極產(chǎn)生的電場互成90°，六邊形排列的電極產(chǎn)生的電場雖凝膠的位置和電極極性的不同而互成120°或60°。結(jié)合運用低電場強度（1.3V/cm）、低濃度瓊脂糖（0.6%）、延長轉(zhuǎn)換間隔（1小時）和延長電泳時間（130小時）等條件，有可能分離長達(dá)5000kb的DNA分子。鉗位均勻電場電泳的電極分布（CHEF）

物理圖譜的定義

標(biāo)明限制性內(nèi)切酶在DNA分子上的切割位點和切割位點間距離的圖譜，稱為DNA的物理圖譜，又叫限制性圖譜。圖5－1多限制酶消化法制作物理圖譜圖5－2部分消化法制作物理圖譜

ADDDB0.52.21.31.032P5.0kb4.02.70.5DNA聚合酶的性質(zhì)酶3＇→5＇外切酶5＇→3＇外切酶聚合反應(yīng)速率持續(xù)合成能力大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ低有中低大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）低無中低逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中T4DNA聚合酶高無中低天然T7DNA聚合酶高無高高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶（測序酶）低或無無高高TaqDNA聚合酶無有高高測序酶

化學(xué)修飾T7DNA聚合酶是將天然T7DNA聚合酶與O2、低濃度的Fe

2+

一起保溫數(shù)天，修飾T7DNA聚合酶的N端結(jié)構(gòu)域，使其喪失99%以上的3＇→5＇外切酶活性，而聚合酶活性不受影響，稱為測序酶（sequenase）。后來又發(fā)展出了基因工程手段產(chǎn)生出一種改進(jìn)的測序酶（測序酶2.0版），它完全喪失了3＇→5＇外切酶活性。DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性切口平移標(biāo)記核酸探針

帶有易檢測標(biāo)記的、已知其序列或來源的DNA片段稱為探針。探針的用途是通過堿基互補探尋能夠與之雜交的未知DNA片段。

先用DNaseⅠ（牛胰）輕微作用于DNA（在Mg

2+存在下），在雙鏈DNA上產(chǎn)生一些切口，然后用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ及4種dNTP（其中1種帶有32P標(biāo)記）進(jìn)行切口平移標(biāo)記。此法利用的是該酶的聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性。圖5－4切口平移法制備32P標(biāo)記的探針Klenow片段的產(chǎn)生

用枯草桿菌蛋白酶裂解完整的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，得到C端70%的分子量為76kD的片段，稱為Klenow片段。Klenowfragment具有聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性，沒有5＇→3＇外切酶活性。5＇→3＇外切酶活性位于全酶N端分子量為36kD的小片段中。現(xiàn)已用基因工程的方法直接生產(chǎn)Klenow片段（Klenow酶）。隨機(jī)引物標(biāo)記法制備探針

先使待標(biāo)記的雙鏈DNA變性成單鏈，再與6bp長的隨機(jī)引物混合物一起退火，加Klenow酶和4種dNTP（其中1種帶有32P標(biāo)記）合成模板的互補鏈。互補鏈從引物的3＇端延伸。圖5－5采用Klenow酶的隨機(jī)引物標(biāo)記法逆轉(zhuǎn)錄酶

已經(jīng)商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：一種是來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV），稱為禽源逆轉(zhuǎn)錄酶。它包括兩條多肽鏈，α鏈65kD，β鏈95kD，具有逆轉(zhuǎn)錄活性及很強的RNaseH活性（降解DNA:RNA雜交雙鏈中的RNA）。另一種是從一株能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒（mouseleucocytosisvirus,Mo-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離得到的，稱為鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶。它是分子量為84kD的單鏈蛋白，具有逆轉(zhuǎn)錄活性和相對較弱的RNaseH活性。逆轉(zhuǎn)錄酶

由于RNaseH活性對RNA模板有破壞作用，因此禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑中高水平的RNaseH活性往往趨向于抑制cDNA的產(chǎn)量，并限制cDNA合成的長度。然而，與鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶相比，禽源逆轉(zhuǎn)錄酶能更有效地拷貝較復(fù)雜的mRNA。T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶與Klenow酶相似，它們都具有5＇→3＇聚合酶活性及3＇→5＇外切酶活性，而且3＇→5＇外切酶活性對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA更強。T4DNA聚合酶的外切核酸酶活性要比Klenow酶強200倍。T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶用于補平或標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的3＇凹端，還用于對帶有3＇突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。（先切3＇突出端成凹端，再補上。這一從凹端或平端上循環(huán)往復(fù)地去除和加上3＇端核苷酸的反應(yīng)又稱為置換反應(yīng)。）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

催化的反應(yīng)（同聚物加尾）

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量（34kD）的堿性蛋白質(zhì)，由一個26kD的大亞基和一個8kD的小亞基組成。底物是dNTP和具有3＇羥基的單鏈DNA或具有3＇羥基突出末端的雙鏈DNA。此酶簡稱末端轉(zhuǎn)移酶。它將dNTP加到3＇末端羥基上，可用來加多聚核苷酸尾。堿性磷酸酶

催化單鏈或雙鏈DNA、RNA5＇端的磷酸基團(tuán)水解，成為5＇－OH。它也能催化NTP和dNTP5＇磷酸的水解。兩種堿性磷酸酶

有兩種堿性磷酸酶，即來自大腸桿菌的細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和小牛腸堿性磷酸酶（CIP）。CIP在SDS中加熱至68℃可完全失活，而BAP對去垢劑和高溫的耐受性更強，不便于反應(yīng)后除去酶活性。用CIP催化的反應(yīng)一般在pH9.3進(jìn)行。堿性磷酸酶的用途堿性磷酸酶用于：①DNA或RNA5＇端標(biāo)記32P時，除去原有的5＇磷酸；②除去載體DNA的5＇磷酸以防自身連接，而不影響帶有5＇磷酸的外源DNA片段與載體的連接。T4多核苷酸激酶

T4多核苷酸激酶催化的前向反應(yīng)（正向反應(yīng)）是將ATP的γ磷酸轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5＇－OH上，用于標(biāo)記5＇端（用γ－32PATP）。銨離子和磷酸是此反應(yīng)的抑制劑，所以應(yīng)該用Tris緩沖液（pH7.4~8.0）。該酶還可以在高濃度ATP和ADP存在下催化交換反應(yīng)，使ATP的γ－磷酸與DNA、RNA5＇端的磷酸基團(tuán)交換。此反應(yīng)的首選反應(yīng)緩沖液是咪唑緩沖液（pH6.4）。此法標(biāo)記效率較低，不如正向反應(yīng)常用。

T4多核苷