環(huán)剝摘葉處理對(duì)6種藥用植物谷子雄花芽分期的影響

環(huán)剝摘葉處理對(duì)6種藥用植物谷子雄花芽分期的影響

果樹(shù)花芽分化是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程。根據(jù)各種果樹(shù)的研究，果樹(shù)花芽分化不僅是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)問(wèn)題，也與遺傳因素有關(guān)。噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以調(diào)控作物的花芽分化、提高產(chǎn)量,在果樹(shù)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。赤霉素(GA3)是一種促進(jìn)生長(zhǎng)的植物激素,與花發(fā)育密切相關(guān)。多效唑(PP333)是一種用途廣泛的植物生長(zhǎng)延緩調(diào)節(jié)劑,具有抑制GA3生物合成的作用。不同植物在特定時(shí)期外施GA3和PP333對(duì)成花的影響不同,同時(shí)一些響應(yīng)GA3成花調(diào)控途徑相關(guān)基因的表達(dá)量也發(fā)生變化。植物成花基因LFY是花分生組織特性基因,在成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中處于比較關(guān)鍵的位置,是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變所必需的,其表達(dá)受到有生物活性的GA3的調(diào)節(jié)。擬南芥lfy突變體植株不能順利進(jìn)行成花轉(zhuǎn)變。過(guò)表達(dá)LFY表現(xiàn)出早花、花器官變化等生理現(xiàn)象。榛子(CorylusheterophyllaF.)屬于榛科(Corylaceae)榛屬(CorylusL.)樹(shù)種,是珍貴的木本糧油資源,榛仁營(yíng)養(yǎng)豐富,含脂肪57.1%~62.1%、蛋白質(zhì)16.2%~21.12%、碳水化合物6.5%~9.3%,還含有維生素C、E、B1和多種礦物質(zhì)。榛子雌雄同株異花,雌雄比例非常低,嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)榛子成花機(jī)制的研究報(bào)道很少,鑒于此,以雜交榛為研究對(duì)象,通過(guò)環(huán)剝摘葉、噴施GA3和PP333措施,應(yīng)用田間統(tǒng)計(jì)以及熒光定量的手段,研究榛子雄花芽生理分化時(shí)期、GA3和PP333對(duì)成花的影響以及對(duì)LFY基因的表達(dá)調(diào)節(jié),以期揭示GA3影響榛子成花的內(nèi)在機(jī)制和外在條件,為調(diào)控榛子成花提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1峰林場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地試驗(yàn)于2010-2012年在北京市昌平區(qū)西郊鶩峰林場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地(北緯39°56′,東經(jīng)116°28′)進(jìn)行。供試材料為生長(zhǎng)發(fā)育正常、無(wú)病蟲(chóng)害的6年生雜交榛達(dá)維(育種代號(hào)為84-254)。1.2測(cè)試方法1.2.1年齡及生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)榛子雄花芽成花的影響采用環(huán)剝摘葉法。每次選取一個(gè)4年生骨干枝進(jìn)行環(huán)剝(剝口離地面約20cm,環(huán)剝的寬度0.2~0.5cm),在骨干枝上隨機(jī)選12個(gè)枝條(粗度在2~3cm),分成3個(gè)區(qū)組,4個(gè)枝為一個(gè)區(qū)組,隨機(jī)區(qū)組排列,每區(qū)組中選2個(gè)枝進(jìn)行摘葉處理,剩余2個(gè)枝不摘葉作為對(duì)照,將摘葉處理的所有枝條基部的葉片摘除,只留枝條頂部1個(gè)大葉,每隔約7d處理一次,共8次(2011年4月28日至2011年6月26日),枝條均進(jìn)行掛牌編號(hào)并進(jìn)行定期檢查記錄。9月初調(diào)查統(tǒng)計(jì)成花情況(雄花序數(shù)占處理芽總數(shù)的百分比)。榛子雄花芽生理分化始期為摘葉組開(kāi)始有雄花序形成的日期,在此時(shí)期摘葉處理已經(jīng)不能夠抑制小部分雄花芽成花轉(zhuǎn)變;摘葉組雄花序形成百分率變化不顯著的時(shí)期為雄花芽生理分化結(jié)束期。1.2.2榛子生殖年生多元回復(fù)突變株的篩選2010年5月1日和8日分別噴施800mg/LPP333(四川國(guó)光農(nóng)化有限公司生產(chǎn))和100mg/LGA3(上海同瑞生物科技有限公司生產(chǎn)),以清水為空白對(duì)照,噴施至整株葉片滴水為止。在2011年4月18日、4月22日分別噴施100mg/LGA3和1g/LPP333。單株小區(qū)處理,重復(fù)3次,隨機(jī)區(qū)組排列。翌年3月30日統(tǒng)計(jì)榛子雌雄花的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)選取3棵長(zhǎng)勢(shì)相同的雜交榛,每個(gè)處理共選取100個(gè)1年生小枝,統(tǒng)計(jì)每個(gè)枝條的長(zhǎng)度,枝上雌花、雄花序個(gè)數(shù)。利用Excel、SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。2012年4月28日開(kāi)始至6月26日取葉片,日期分別為04-28、05-06、05-13、05-20、05-28、06-06、06-13、06-26,液氮速凍后備用。1.2.3熒光定量pcr方法用改良的CTAB法分別提取各時(shí)期葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄按照TOYOBOFirstStrandcDNASynhesisKitRevertraAce-β(CodeNo.FSK-100)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以榛子18SrRNA為內(nèi)參,按照Thermo公司ThermoScientificDyNAmocolorflashSYBRGreenqPCRKit(F-416)說(shuō)明書(shū),在AppliedBiosystems7500Real-timePCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR,采用△△CT方法分析不同時(shí)期和處理LFY基因的相對(duì)表達(dá)量。目的基因和內(nèi)參PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度都為146bp。內(nèi)參基因引物:18Sfw:5′-AGACACTCGTGCCTTCTTGCC-3′;18Srv:5′-CCGTTGCCGAGAGTCGTTATG-3′。目的基因引物:LFYfw:5′-GTTTAGGTATGCGAAGAAGGCTG-3′;LFYrv:5′-CCCACATTTTCTCCTCTTTCCTT-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。2結(jié)果與分析2.1芽雄花芽分化的變化9月份對(duì)各組處理的成花情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明(表1),第1次(4月28日)進(jìn)行環(huán)剝摘葉的芽并非全部都形成葉芽,己經(jīng)有2.2%的雄花芽度過(guò)了花芽生理分化始期,5月6-28日摘葉處理的芽雄花序形成百分率在7.9%~23.4%,從5月28日到6月26日摘葉處理的枝條芽雄花序形成百分率在23.4%~28.5%,之后摘葉已不能抑制絕大部分花芽的形成,這說(shuō)明4月28日已有小部分花芽度過(guò)了花芽分化的臨界期,隨著處理時(shí)間的推遲雄花序形成百分率逐漸增多,而5月28日大部分花芽已度過(guò)了花芽分化的臨界期即生理分化期,說(shuō)明以后雄花序數(shù)量基本不再增加。結(jié)合前人的研究可以推斷,榛子的大部分雄花芽是在4月22日和5月28日之間度過(guò)雄花芽生理分化期的,之后進(jìn)入形態(tài)分化時(shí)期。2.2pp333對(duì)安氏偽造材料參數(shù)的影響2010年和2011年分別對(duì)雜交榛子整株噴施GA3和PP333,統(tǒng)計(jì)1年生小枝上雌雄花的數(shù)量。根據(jù)2010年的試驗(yàn)結(jié)果(表2),發(fā)現(xiàn)GA3顯著促進(jìn)雄花序分化,降低雌雄分化比例。而外施PP333雖然使雌花芽增加但是差異不顯著。根據(jù)2011年的試驗(yàn)結(jié)果(表3),外施GA3使雄花序數(shù)量顯著增加,PP333顯著增加雌花芽的數(shù)量,提高雌雄分化比例。GA3和PP333處理葉芽數(shù)量的差異不顯著。綜合2a結(jié)果初步認(rèn)為:GA3顯著促進(jìn)雄花序分化,降低雌雄分化比例。2a中PP333促進(jìn)雌花芽的顯著性效應(yīng)不同,可能與施用PP333的時(shí)間、濃度等差異有關(guān)。兩處理對(duì)葉芽數(shù)量的影響均不顯著。2.3榛子lfy表達(dá)變化采用改良的CTAB法,分別提取榛子雄花芽分化不同時(shí)期葉片總RNA,電泳結(jié)果如圖1所示,條帶清晰,無(wú)降解,純度高,能夠滿足后續(xù)的試驗(yàn)要求。采用熒光定量檢測(cè)榛子LFY的表達(dá)變化情況。清水對(duì)照的榛子葉片熒光定量結(jié)果顯示(圖2-CK):LFY在榛子雄花芽生理分化整個(gè)時(shí)期都有表達(dá),生理分化初期表達(dá)量低,之后表達(dá)量升高,5月28日達(dá)到最高,形態(tài)分化初期表達(dá)量降低。GA3和PP333處理榛子葉片熒光定量結(jié)果顯示(圖2-GA3和圖2-PP333):與對(duì)照相比,GA3處理使葉片中LFY的表達(dá)增加,而PP333處理抑制了榛子LFY的表達(dá)。3ga3和pp333對(duì)植物成花的促花作用成花誘導(dǎo)期是有花植物發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)折時(shí)期,同時(shí)也是調(diào)控植物形成花芽的關(guān)鍵時(shí)期。環(huán)剝能截留可塑性物質(zhì)使?fàn)I養(yǎng)不流入根部或其他枝條而用于花芽的形成,而摘葉可以阻止花芽分化。本研究通過(guò)環(huán)剝摘葉的方法確定了北京地區(qū)榛子雄花芽生理分化的時(shí)期大致是4月22日至5月28日,為生產(chǎn)實(shí)踐中雜交榛成花調(diào)控提供參考。GA3是影響植物成花的外部因素之一,也是人工調(diào)控植物成花的有效手段。目前在果樹(shù)上相關(guān)研究有很多:比如在蘋(píng)果的研究中發(fā)現(xiàn)GA3有抑花作用,PP333促進(jìn)花芽分化;低質(zhì)量濃度的GA3(30mg/L和50mg/L)促進(jìn)銀杏雌株花芽分化,PP333(100mg/L和1g/L)具有促花作用,與對(duì)核桃、野生榛子、荔枝的研究結(jié)果一致。對(duì)大多數(shù)木本植物的研究得出GA3抑花,PP333促花,而板栗的研究結(jié)果則相反。榛子為雌雄同株異花植物,成花特性較為特殊,本研究結(jié)果表明,在雜交榛達(dá)維上施用100mg/LGA3顯著提高其1年生小枝上雄花序的數(shù)量,降低雌雄分化比例。PP333使雌花芽的數(shù)量增加,雌雄分化比例升高,1g/LPP333作用效果更加顯著。這與王文波在野生榛子上的研究結(jié)果一致。短日條件下GA3可通過(guò)調(diào)節(jié)擬南芥LFY基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控開(kāi)花。外源供給GA3可促進(jìn)LFY基因的表達(dá);在對(duì)劍麻的研究中發(fā)現(xiàn)GA3處理后成花相關(guān)基因LFO/LFY的表達(dá)量增加。然而也有相反的結(jié)論:GA3處理顯著抑制了桃、早食枳等的成花誘導(dǎo)和進(jìn)一步的正常分化,抑制了成花關(guān)鍵基因LFY的正常表達(dá)。本研究通過(guò)對(duì)雜交榛葉面噴施GA3和PP333,研究雄花芽生理分化葉片中成花關(guān)鍵基因LFY的表達(dá)變化情況,結(jié)果表明,GA3促進(jìn)了葉片中成花轉(zhuǎn)變關(guān)鍵基因L