肽類或蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)衰老的研究進展

肽類或蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)衰老的研究進展

隨著工程技術(shù)的快速發(fā)展和生物科學與化學等學科技術(shù)的緊密結(jié)合，醇類和蛋白質(zhì)類藥物逐漸成為藥物研發(fā)和臨床治療的熱點。2004年,國際上銷售額排名前200的藥物中有20%屬于多肽、蛋白質(zhì)或抗體。從2006年到2010年,美國FDA批準99種新分子實體藥物上市,其中有21%為生物類藥物。2011年,生物醫(yī)藥市場銷售總額接近1400億美元,其中重組蛋白質(zhì)或抗體藥物占71.4%;美國或歐洲批準上市的430種生物類藥物中重組蛋白質(zhì)或抗體藥物占69.8%。有研究表明,預(yù)計到2013年全世界肽類或蛋白質(zhì)藥物銷售總額達1600億美元,這一數(shù)據(jù)還將每年以7%~15%增加。目前,絕大多數(shù)肽類和其類似物的藥物為激素或具有激素作用的肽衍生物,雖然具有較強的生物學活性,但在體內(nèi)發(fā)揮藥理學作用時,也具有以下限制因素:(1)口服利用度低,通常選用注射給藥方式;(2)親水性強,不易通過生理屏障;(3)較高的構(gòu)象靈活性,有時與受體和靶標進行結(jié)合時缺乏特異選擇性,易導致副作用。除以上的因素,還有一個最為主要的限制因素為其在體內(nèi)半衰期較短。一些肽或蛋白質(zhì)類藥物的體內(nèi)半衰期僅有幾分鐘,從而導致到達靶組織的藥物濃度過低,不能發(fā)揮足夠的藥效,嚴重限制其臨床應(yīng)用。半衰期較短一般有兩方面原因造成,一是在血漿、肝臟和腎臟中存在著大量的肽酶(peptidase)和蛋白酶(protease),肽或蛋白質(zhì)在酶的作用下迅速降解;二是在血漿中分子質(zhì)量較小的肽類或蛋白質(zhì)類藥物(低于50ku),由于腎臟的過濾作用而被快速排出。延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物的半衰期,不但可以改善藥物的藥代動力學和藥效學特征,而且可以減少用藥量和用藥次數(shù),而這也是現(xiàn)在肽類或蛋白質(zhì)類藥物臨床應(yīng)用上的難題。目前,已經(jīng)開發(fā)出一系列的延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物半衰期的方法,如提高肽類或蛋白質(zhì)類藥物對酶的穩(wěn)定性來減少酶的降解;或者通過增加肽類或蛋白質(zhì)類藥物的流體力學體積(hydrodynamicvolume)和FcRn介導的再生作用來減少腎臟過濾排出(Fig1)。本綜述將根據(jù)不同延長半衰期的方法策略進行分類,并分別就不同的方法進行舉例和歸納。1提高酶的穩(wěn)定性對肽類或蛋白質(zhì)類藥物進行修飾,可以提高對酶的穩(wěn)定性,是延長肽類或蛋白類藥物半衰期的一種策略。1.1glp-1-peptica1的活性在血清、肝臟和腎臟中有多種影響肽類或蛋白質(zhì)類藥物穩(wěn)定性的外肽酶(exopeptidases),因此對其C-/N-端進行修飾可以在一定程度上提高對酶的抗性,一般末端修飾方法為N端乙?；?N-acetylation)和C端酰胺化(C-amidation)。GLP-1(glucagon-likepeptide1)是一種葡萄糖依賴的促胰島素分泌肽(glucose-dependentinsulinotropicpeptide,GIP),其具有兩種活性形式,GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。GLP-1在體內(nèi)能促進胰島β細胞分泌胰島素,抑制胰高血糖素的分泌,控制血糖,是有效治療2型糖尿病的多肽激素,但其在體內(nèi)受到二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidylPeptidaseIV,DPP-IV)的降解,其半衰期僅2min左右,臨床應(yīng)用時需要高劑量頻繁注射,嚴重影響其作為藥物的潛力。將GLP-1的N端分別進行乙?；?acetyl)和焦谷氨酸化(pyroglutamyl),發(fā)現(xiàn)其半衰期可以延長至12h以上,且具有很強的活性。在GLP-1-Fc融合蛋白的N端分別加上一個Ala或者Gly,形成A-GLP-1-Fc和G-GLP-1-Fc,半衰期由11.8h分別延長至13.5、13.7h。1.2生長素抑制劑對蛋白的酶敏感位點進行氨基酸替換,可以有效地降低酶的降解,延長半衰期。DPP-IV能特異性切割GLP-1的His-Ala,用D-Ala替換Ala,則可以明顯提高對DPP-IV的抗性,而其生物活性與GLP-1類似,使其在體內(nèi)發(fā)揮作用的時間比GLP-1至少長30min。生長素抑制劑(somatostatin)是一個抑制胰腺內(nèi)分泌和外分泌的十四肽,其半衰期僅幾分鐘,限制了其臨床應(yīng)用。octreotide是對somatostin酶敏感的氨基酸位點進行替換、刪除等修飾后得到的多肽,從十四肽縮短到八肽,用D-氨基酸替代L-氨基酸,半衰期得到了較大提高,從幾分鐘延長至1.5h。Cetrorelix為一種促黃體激素釋放激素(luteinizinghormonereleasinghormone,LHRH)的十肽拮抗劑,其中有5個氨基酸被D-氨基酸替換且C端酰胺化,能在37℃下對一些蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶和鏈霉蛋白酶)有極強的抵抗力,其半衰期可達62.8h。1.3agrf1-29-nh2的制備將肽或蛋白質(zhì)進行環(huán)化也是一種提高酶穩(wěn)定性,延長半衰期的有效策略。將生長控制因子(growthregulatingfactor,GRF)及其類似物同時在豬血清(porcineplasma)中37℃溫育,結(jié)果GRF(1-29)-NH2半衰期只有13min,而將Asp8的側(cè)鏈與Lys12的側(cè)鏈間進行環(huán)化,其半衰期可達2h以上。Marastoni等將制備了6個氨基酸的線性的和首尾環(huán)化的T肽類似物,結(jié)果所有的復(fù)合物都有高的活性且極大的提高了在血清和腦中的穩(wěn)定性。2增大分子量的影響血液中小分子肽類和蛋白類藥物易被腎臟過濾而排出,因此增大分子量使其超過腎臟過濾的臨界值(40~50ku)是延長半衰期的重要策略,此類方法主要包括將肽或蛋白與大分子相連,如PEG、Albumin或IgG等。2.1peg分子與glp-1的連接PEG藥物修飾(PEGylation)是一種將蛋白質(zhì)、肽或非肽分子類藥物與一個或多個PEG分子化學偶聯(lián),從而增加藥物在體內(nèi)半衰期的一種方法。PEG修飾增加蛋白質(zhì)和肽類藥物的穩(wěn)定性,提高可溶性,降低免疫原性,延長在血液中的滯留時間,減少蛋白酶的降解,從而降低用藥頻率。1990年,第1個經(jīng)PEG修飾的牛腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase,ADA)Adagen獲得美國FDA批準上市,用于治療重癥綜合性免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID)。PEG修飾技術(shù)經(jīng)過20多年的發(fā)展,現(xiàn)在已經(jīng)可以應(yīng)用一系列的化學或者酶促方法將不同的蛋白質(zhì)藥物與不同數(shù)量的PEG分子偶聯(lián)。PEG分子主要與蛋白質(zhì)的氨基(aminogroup)、巰基(thiol)、羥基(hydroxyl)和酰胺基團(amidegroup)等連接,組氨酸標簽和二硫鍵也可以用來與PEG分子偶聯(lián)。Lee等用2ku的單PEG分子與GLP-1的Lys26或Lys34偶聯(lián),制成PEG2k-LysGLP-1分子,將其靜脈注射進老鼠體內(nèi),其半衰期為33min,比非PEG修飾GLP-1提高16倍。PEG修飾的GLP-1具有較高的穩(wěn)定性,主要源于PEG分子引起的空間位阻效應(yīng)。目前,已被批準上市多種PEG修飾的蛋白質(zhì)藥物,涉及酶、細胞因子和抗體,如asparaginase、interferon-α2b(INF-α2b)、granulocyte-colony-stimulatingfactor(G-CSF)、humangrowthhormone(hGH)、erythropoietin(EPO)和一個Fab片段。在這些藥物中,用不同的方法將一條或幾條分子質(zhì)量為5~40ku的PEG鏈與蛋白質(zhì)隨機或特定位點交聯(lián)。一個典型的例子是PEG修飾的interferon-α2a(Pegasysue4d2),美國FDA于2001年批準用于治療丙型肝炎。對患者進行皮下注射后,無PEG偶聯(lián)的interferon-α2a半衰期是3~8h;而interferon-α2a的4個賴氨酸(Lys31、Lys121、Lys131和Lys134)分別與1個40ku并帶有分支的PEG分子進行偶聯(lián)后,其半衰期達到65h,約提高18倍,且沒有免疫原性。半胱氨酸在蛋白質(zhì)和肽中并不常出現(xiàn),因此在不參與形成二硫鍵的半胱氨酸巰基上進行PEG修飾成為一種重要的方法。最近,Balan等研究出一種新型的PEG交聯(lián)方法,可以直接將PEG分子連接到IFN(Interferonα-2b)二硫鍵上,利用雙烷基化PEG試劑將還原后的IFN二硫鍵(Cys29-Cys138、Cys1-Cys98)的兩個巰基分別烷基化形成三碳橋,PEG通過三碳橋與蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)。這種三碳橋能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),將IFN的半衰期從1h延長到12h,且不影響生物活性。另外,基因工程的發(fā)展可將蛋白質(zhì)或者肽鏈任意位置的非重要氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?再與PEG偶聯(lián)。certolizumabpegol(Cimziaue4d2)是一種通過Fab’末端游離的巰基與40kuPEG連接的藥物,有抗腫瘤刺激因子alpha(antiTNF-α)功能,用于治療克羅恩病(Crohn’sdisease)。皮下注射后,certolizumabpegol在人體內(nèi)半衰期為14d,相比Fab(其半衰期12~18h),其半衰期大大延長。2.2ctp的加入和對大鼠血漿保水性的影響許多蛋白質(zhì)都帶有N-/O-連寡糖鏈,研究發(fā)現(xiàn),這些糖基能夠影響蛋白質(zhì)的半衰期。因此可以通過對蛋白質(zhì)的特定位點進行糖基化,引入額外的N-/O-連寡糖鏈延長蛋白質(zhì)藥物的半衰期,現(xiàn)在已有幾種蛋白質(zhì)藥物通過糖基化而延長了其半衰期。人絨毛膜促性腺激素β(humanchorionicgonadotropinbeta,HCGβ)亞基有一個28個氨基酸的CTP(carboxyl-terminalpeptide,CTP),CTP上有4個O-連寡糖鏈。利用定點突變的方法將CTP去掉,發(fā)現(xiàn)對受體的結(jié)合沒有影響,但是卻明顯降低活性和縮短半衰期。研究發(fā)現(xiàn),寡糖鏈末端的唾液酸(sialicacids)可能是延長蛋白質(zhì)半衰期的重要因素。同時,攜帶越多負電荷的糖蛋白其半衰期越長,這可能與減少了腎小球的濾過有關(guān)。因此,將帶有唾液酸化O-連寡糖鏈的CTP加入到其他激素的末端,是延長半衰期的一種策略。人生長激素(humangrowthhormone,hGH)是治療兒童生長障礙的重要藥物,但是其半衰期較短(在人體內(nèi)12min)。在hGH兩端加上CTP,形成CTP-hGH-CTP-CTP復(fù)合物,將該復(fù)合物分別靜脈注射和皮下注射入大鼠體內(nèi),其半衰期分別為6.9h和9h,比biotropin(一種重組hGH藥物)長4~5倍,且CTP對活性并無影響。促卵泡生成素(follitropin-stimulatinghormone,FSH)可應(yīng)用于輔助生殖技術(shù),將CTP加到FSH的C端,形成FSH-CTP復(fù)合物,在人體內(nèi)其半衰期可以達到78.5~120.9h,比Puregon(重組FSH)長2~3倍,且不影響與受體的結(jié)合,免疫原性較小。目前,FSH-CTP已被批準上市。CTP易連接到許多蛋白質(zhì)藥物的兩端,可以穩(wěn)定蛋白質(zhì),延長半衰期,且沒有毒性,生物活性不會丟失,因此,連接CTP是一種延長肽類或蛋白類藥物較好的方法。另外,通過基因突變的方法也可以在蛋白質(zhì)內(nèi)引入寡糖鏈。重組EPO(recombinanthumanEPO,rhuEPO)在臨床上用于治療貧血癥。但rhuEPO面臨的主要問題是其半衰期僅有8h,需頻繁注射。紅細胞刺激蛋白dabepoetinalfa(Aranespue4d2,作用與EPO相似)是在EPO基礎(chǔ)上對30和88位進行突變后連接了兩個N-連寡糖鏈的產(chǎn)物,靜脈注射后體內(nèi)半衰期為25h,是rhuEPO的3倍。而另一種策略,CTP加在EPO的C端,也可將半衰期增加2~3倍。利用基因突變的方法在IFN-α氨基酸序列中引入4個糖基化位點,半衰期比無糖基化IFN-α的可延長25倍。2.3x費用誘導氨基酸在大腸桿菌中的表達隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,用一條親水性和柔和性強的肽鏈代替PEG與肽類或蛋白質(zhì)類藥物進行連接,可以極大的延長半衰期。這個過程可以通過基因融合技術(shù)實現(xiàn),從而避免了化學交聯(lián)和額外的純化步驟,并且連接的肽鏈在體內(nèi)可以完全降解。Amunix公司最近研發(fā)了一種XTEN技術(shù),該技術(shù)依賴于由Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr6種氨基酸組成的不同長度的肽鏈,無特定構(gòu)象,稱為XTEN序列。將肽或蛋白質(zhì)藥物與XTEN序列以基因融合方法進行連接,能增加前者的可溶性和穩(wěn)定性,且具有低免疫原性、產(chǎn)物純度高和能夠完全生物降解的特點。exenatide是一個由39個氨基酸組成的肽,其作用類似于GLP-1,能治療2型糖尿病,其分子質(zhì)量較小,易被腎臟清除,在人體內(nèi)的半衰期只有2.4h,需每天注射兩次。將編碼864個氨基酸肽鏈基因融合到exenatide基因的3’端,大腸桿菌中成功表達Exentide-XTEN864融合蛋白,皮下注射食蟹猴(cynomolgusmonkeys,5kg)發(fā)現(xiàn),其半衰期延長至60h,且保持了80%的生物活性;為估算在人體內(nèi)的半衰期,分別用小鼠(0.025kg)、大鼠(0.25kg)和狗(12kg)進行實驗,得到標準曲線,從而推斷出在75kg的人體內(nèi)的半衰期為139h。若一次性注射100mg,可有效控制血糖至少30d。該藥物目前已經(jīng)進入臨床Ⅰ期研究階段。因此,XTEN技術(shù)是一種可以使肽類藥物半衰期延長的有效方法。XL-protein公司利用重復(fù)的Pro、Ala和Ser構(gòu)建了無規(guī)則卷曲的蛋白結(jié)構(gòu),這種技術(shù)稱為PASylation;用上述3種氨基酸組成了200~600個氨基酸殘基的PAS序列,并通過基因融合的方法將蛋白質(zhì)或肽類藥物與之連接,增大了體積,從而阻止了腎臟的快速濾過,延長了半衰期。目前,已將此PAS序列與Growthhormone、Interferon和Fab片段連接,可使其半衰期延長10~100倍。Schlapschy等利用富含Gly的同源氨基酸聚體(homo-amino-acidpolymers,HAP)(Gly4Ser)n形成無規(guī)則卷曲的長鏈,可以與肽或蛋白質(zhì)結(jié)合延長其半衰期。如將(Gly4Ser)40與Fab形成融合蛋白,能將Fab的半衰期從2h延長到6h,且其活性沒有受到HAP鏈的影響。3sa和igg-fc的機制人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)和IgG是人體血液中的兩種含量最豐富的蛋白質(zhì),占血漿總蛋白含量的80%-90%,且其具有較長的半衰期,可分別達19d和21d。研究發(fā)現(xiàn),半衰期較短的肽類或者蛋白質(zhì)類藥物可以通過與HSA或者IgGFc片段通過化學交聯(lián)或者基因融合的方法相連,從而明顯延長其半衰期。通過HSA和IgG延長半衰期主要有兩個方面的原因,一是HSA和IgG明顯增加肽類或者蛋白質(zhì)類藥物的體積,降低腎臟的快速清除;二是在血液中,HSA和IgGFc能夠通過新生兒Fc受體(neonatalFcreceptor,FcRn)介導的再生作用來延長半衰期。FcRn是一種膜蛋白受體,其主要負責轉(zhuǎn)運母體IgG向新生兒血液中,使新生兒獲得免疫力;FcRn主要存在于上皮細胞和內(nèi)皮細胞,但在肝臟、腎臟和腸細胞也有分布。在血液中,HSA和IgGFc能夠與FcRn以一種pH依賴的方式結(jié)合,即IgG和Albumin經(jīng)胞吞作用被細胞吸收后,在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中與FcRn結(jié)合,既可免受溶酶體的降解,又可在生理pH時釋放并重新返回到血漿中,從而明顯延長半衰期。3.1glp抑制劑的使用HSA是血液中含量最多的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量為67ku,由肝臟合成,其半衰期為19d?，F(xiàn)已有多種蛋白質(zhì)或者肽與HSA結(jié)合而大大延長了體內(nèi)半衰期(Tab1)。肽及蛋白質(zhì)與HSA連接主要通過兩種途徑:化學交聯(lián)或融合基因表達?；瘜W交聯(lián)是指肽與HSA表面Cys34的巰基以共價鍵的方式進行連接。如CJC-1134-PC是Exendin-4通過羧基端與HSACys34連接,使Exendin-4的半衰期由2.4h延長至8d?；蛉诤霞夹g(shù)可將肽或蛋白質(zhì)連在HSA的氨基端或羧基端,形成一個體積較大、不容易被腎臟過濾清除的融合物,從而延長半衰期。目前已利用基因融合技術(shù)與HSA連接的生物類制劑有GLP-1、interferonα2b、白介素2(interleukin-2)和粒細胞集落刺激因子(granulocyteColony-StimulatingFactor,G-CSF)。liraglutide(Victozaue4d2)也是一種治療糖尿病的肽類藥物,其構(gòu)造為GLP-1(7-37)Lys34替換為Arg,一個16個碳的脂肪酸鏈,通過Glu與Lys26相連,皮下注射后脂肪酸鏈可以與血漿中的Albumin結(jié)合,其半衰期延長為13h,可以在24h之內(nèi)有效控制血糖。albiglutide是一種GLP-1受體激動劑,是將兩個重復(fù)的GLP-1(7-36)分子連接到HSA上,并且將GLP-1(7-36)的Ala8替換成Gly,以防止DPP-IV的酶切,將GLP-1的半衰期從2min延長到6~8d。Albuferonue4d2是由interferonα-2b與HSA融合后形成的融合蛋白,人體內(nèi)半衰期可達6d,而無融合的interferonα-2b半衰期僅有2~3h。Ⅲ期臨床試驗證明,在治療丙肝(hepatitisC)方面,每兩周注射1次此種融合蛋白的效果不遜于PEG修飾的interferonα-2b,這也提供了一種可選擇的治療方法。將白介素2與Albumin進行融合表達形成融合蛋白Albuleukin,在小鼠體內(nèi)其半衰期由原來的19~57min延長到6~8h,并且能有效的抑制黑色素瘤和腎細胞瘤。Albugraninue4d2是一種將G-CSF的N端融合到HSAC端所形成的融合蛋白,在小鼠體內(nèi)半衰期為5.6~5.7h,是G-CSF(2.5h)的2.3倍。3.2與fc融合的蛋白類藥物免疫球蛋白亞類IgG1、IgG2和IgG4在體內(nèi)的半衰期為2~3周,且能與多數(shù)肽類和蛋白質(zhì)類藥物連接,因此非常適合作為延長肽類或蛋白質(zhì)類藥物半衰期的載體。Fc片段是由兩條完全相同的IgG重鏈(包括CH2和CH3區(qū)域)組成,分子質(zhì)量為50ku,可通過基因融合方