腎安提取液對糖尿病腎病小鼠腎臟的影響

腎安提取液對糖尿病腎病小鼠腎臟的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見的并發(fā)癥。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)與糖在無酶條件下發(fā)生反應(yīng)后的產(chǎn)物。AGEs濃度的升高與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān),糖基化終產(chǎn)物途徑被認為是糖尿病腎病的重要病理機制。本實驗觀察腎安提取液對糖尿病腎病模型小鼠腎臟AGEs、RAGEs的影響。1材料和方法1.1動物8周齡C57BL/6小鼠54只(購自湖南斯萊克景達實驗公司,實驗動物合格證號:SCXK(湘)2009-0004)。1.2博維sybr腎安提取液(黃芪甲苷、淫羊藿苷、1,8二羥基蒽醌組方比例為2.5∶1.8∶2.8),用0.3%羧甲基纖維素鈉配制成0.3029mg/mL備用;厄貝沙坦(安博維,由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn),批號:1812);鏈脲佐菌素(STZ,購自Sigma公司)。Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO,日本);SYBRGreenrealtimePCRmastermix(TOYOBO,日本);免疫組化一抗為兔抗小鼠RAGE多克隆抗體(Santacruz公司);二抗為辣根酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(KPL公司);兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(GENETECH公司)。1.3彩色圖像系統(tǒng)Real-timePCRDetectionSystem(SLAN,HONGSHI公司);HMIAS2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影象技術(shù)公司);RF-5000熒光分光光度計(日本島津公司)。1.4糖尿病模型成功制備隨機將54只小鼠分為6組,每組9只:正常對照組(N組)、DN模型組(DN組)、厄貝沙坦組(EB組)、腎安高劑量組(SAG組)、腎安中劑量組(SAZ組)、腎安低劑量組(SAD組)。造模方法:適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,禁食12h,將STZ溶解于pH4.8檸檬酸緩沖液中,按150mg/kg腹腔內(nèi)一次性注射,同時正常對照組腹腔注射等量無菌檸檬酸緩沖液。注藥后72h尾尖取血,測血糖(ACCU-CHEK血糖儀,羅氏公司),血糖>16.17mmol/L者確定為糖尿病誘導(dǎo)成功,此后監(jiān)測血糖和24h尿蛋白,持續(xù)出現(xiàn)蛋白尿的小鼠視為DN模型成功。造模成功后進行藥物干預(yù)。正常對照組、DN模型組小鼠灌服蒸餾水10mL/kg;EB組灌服厄貝沙坦10mg/kg(蒸餾水稀釋至10mL);腎安大劑量為9.088mg/kg,中劑量為4.544mg/kg,小劑量為2.272mg/kg,均采用灌服法。藥物干預(yù)時間為4周。1.5樣品采集藥物干預(yù)結(jié)束后用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取左腎用4%多聚甲醛固定,用于病理切片,右腎-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.6觀察指標1.6.1熒光強度的測定將腎皮質(zhì)200mg剪碎(冷凍),勻漿,4℃6500r/min離心30min,去上清,沉淀中加氯仿-甲醇(2∶1)去脂,加入1mL甲醇、250μL水,水化,自然沉淀,4℃6500r/min離心30min,去上清液,加入氯仿1μL、甲苯1μL以抑制細菌生長,同時以含Ⅶ型膠原酶的0.1mol/LCaCl2緩沖液作空白對照,37℃輕搖24h,然后4℃8000r/min離心5min,取上清液備用;上清液用熒光分光度計按370/440nm(激發(fā)波/發(fā)射波)測定熒光值;以0.1mol/LCaCl2緩沖液熒光值為1個任意熒光單位(AUF),樣品熒光強度依此折算;腎皮質(zhì)中蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradfrod的方法,用1g/L的牛血清白蛋白繪制蛋白標準曲線,腎皮質(zhì)中AGEs含量以AUF/mg表示。1.6.2rages的pcr檢測①引物的設(shè)計:根據(jù)Genebank中小鼠和actin序列,設(shè)計上、下游引物,RAGEs引物:5′-CCGATGGCAAAGAAACACTC-3′,引物2:5′-CTATTCCACCTTCAGGCTCAAC-3′,擴增產(chǎn)物長246bp;actin引物1:5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,引物2:5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,擴增產(chǎn)物長249bp。②總RNA的提取:參考說明書用Trizol試劑提取。③逆轉(zhuǎn)錄:采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,以提取的組織總RNA為模板,以O(shè)ligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將組織中提取的總RNA8μL、Oligo(dT)201μL、無核酸酶水3μL、5×RTBuffer4μL、dNTP2μL、RNA酶抑制劑1μL、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶1μL依次加入Dorf管內(nèi),混合均勻,使總體積為20μL。設(shè)置PCR儀程序為:42℃20min,95℃5min,4℃5min。反應(yīng)完成后總RNA已逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,產(chǎn)物即為PCR反應(yīng)的模板。④擴增:RAGEs的擴增體系:SYBRGreenmix12.5μL,引物(5pmol/μL)2μL,ddH2O8μL,cDNA(10倍稀釋)2.5μL,擴增條件:50℃2min、94℃5min預(yù)變性;94℃30s、59℃30s、72℃1min,循環(huán)設(shè)置數(shù)為40;終末延伸72℃7min。1.6.3木本糖液顯色顯色法石蠟切片置于65℃烘箱中,烘片2h,脫蠟至水。微波修復(fù),切片放入3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。一抗抗體按1∶150稀釋,每張切片加入50μL稀釋液,4℃孵育過夜。每張切片加80μLA液(ChemMateTMEnVision+/HRP),室溫下孵育45min。每張切片加80μL新鮮配制的DAB溶液,室溫下孵育5min,顯微鏡控制顯色。顯色完全后,蘇木素復(fù)染,梯度酒精(70%-100%)脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。每張腎臟切片隨機選取腎皮質(zhì)10個高倍鏡視野(200倍),用HMIAS2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析各組小鼠腎皮質(zhì)RAGEs的平均陽性表達率。1.7統(tǒng)計方法實驗資料用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用t檢驗,結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理。2結(jié)果2.1各組腎安對臟器ragesmrna、rages蛋白表達的影響DN組腎臟RAGEsmRNA、RAGEs蛋白的表達明顯高于N組(P<0.01),EB組、腎安各劑量組腎臟RAGEsmRNA、RAGEs蛋白表達較DN組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表1、圖1。2.2eb組、腎安各劑量對腎安各劑量腎安各劑量對腎ags含量的影響DN組腎臟AGEs含量明顯高于N組(P<0.01),EB組、腎安各劑量組腎臟AGEs含量較DN組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。3腎安提取液對dn腎組織rages表達的影響目前學(xué)者認為AGEs途徑是介導(dǎo)腎臟損傷中最主要的途徑之一。許多實驗也證明應(yīng)用ACEI、ARB均可以使糖尿病腎病腎臟AGEs聚積減少,體外實驗也證明AGEs可激活RAS的許多成分,包括ACE、AT1受體等。應(yīng)用ACEI、ARB可以延緩慢性腎臟病的進展,但是GFR仍然持續(xù)下降,提示DN時是否激活了其他途徑,也為聯(lián)合應(yīng)用RAS阻滯劑和AGEs抑制劑提供了合理前提。糖尿病患者體內(nèi)存在高糖環(huán)境,葡萄糖或其他還原糖與蛋白質(zhì)的末端氨基酸或ε氨基酸反應(yīng),可以形成蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物。AGEs可以與其它蛋白質(zhì)、核酸大分子物質(zhì)以及脂類形成巨交聯(lián)物,從而成為脂褐素的基本成分。脂褐素被溶酶體吞噬后,在細胞內(nèi)堆積,干擾了細胞正常代謝,影響細胞功能并能產(chǎn)生細胞毒性作用,加速細胞老化進程。AGEs與其特異性受體結(jié)合而被細胞內(nèi)呑清除,或者誘導(dǎo)細胞的氧化應(yīng)激、激活NF-κB增加應(yīng)激細胞因子的表達、參與凋亡過程等,從而引發(fā)一系列代謝紊亂,在糖尿病腎病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。AGEs能明顯誘導(dǎo)大鼠腎皮質(zhì)cTGFmRNA和蛋白質(zhì)表達增強,并使ECM蛋白成分合成增多。AGEs可能通過誘導(dǎo)cTGF表達上調(diào)引起EMC合成增多。AGEs能明顯誘導(dǎo)大鼠腎系膜細胞CTGFmRNA的表達,提示AGEs可能通過上調(diào)CTGFmRNA的表達引起ECM積聚。人類和其他種屬動物的不同細胞表面存在有多種AGEs受體,其中RAGEs是目前研究的較為深入的一種AGEs受體,RAGEs屬免疫球蛋白超家族成員,可廣泛表達于血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞和神經(jīng)細胞表面。RAGEs作為AGE的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,具有多種不同的生物效應(yīng)。RAGEs可以介導(dǎo)激活NF-κB而促進靶基因的表達、促炎細胞因子的分泌而參與各種炎癥病理過程;RAGEs還可以通過增強粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶-9等的表達,增加損傷部位炎癥,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能失調(diào)等,促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。RAGEs能夠激活內(nèi)皮細胞和單核細胞的NADPH氧化酶,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧而損傷組織細胞等。研究顯示,在DM患者血管壁及腎臟,RAGEs的表達與正常人相比顯著增加。在腎臟,AGEs與RAGEs結(jié)合后可通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)血小板衍化生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子的表達,促進細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,增加血管通透性,使血液處于高凝狀態(tài)等機制參與DN的進展。AGEs可通過RAGEs介導(dǎo)腎小管上皮細胞向肌纖維原細胞的轉(zhuǎn)化,促進糖尿病腎小管間質(zhì)的硬化。用RAGEs抗體或sRAGE阻斷AGEs與RAGEs的結(jié)合可顯著延緩DM大鼠血管病變的發(fā)生、發(fā)展。長期應(yīng)用sRAGE或抗RAGEs抗體可明顯緩解db/db糖尿病大鼠腎臟損害。中藥可以抑制DN腎臟糖基化終產(chǎn)物對腎臟得損害作用。腎康丸對DN腎臟有保護作用,其機制可能與其降低DN大鼠血清、腎組織AGEs水平以及腎組織RAGEs含量,抑制腎組織RAGEsmRNA的表達有關(guān)。枸杞多糖可以降低模型大鼠糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生,減少腎臟IL-8的分泌,從而預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生。腎安提取液是在多年臨床經(jīng)驗基礎(chǔ)上總結(jié)出的治療糖尿病腎病的有效方,由大黃、黃芪、淫羊藿組成,我們既往的實驗研究發(fā)現(xiàn),大黃蒽醌、黃芪甲苷、淫羊藿苷是其中的主要成分。大黃酸可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞的增生、肥大以及ECM的產(chǎn)生,還可以明顯抑制TGF-β所介導(dǎo)的系膜細胞GLUT1表達與細胞對葡萄糖的異常攝入。洪小平等發(fā)現(xiàn)黃芪可通過多種途徑在基因水平上起到對糖尿病腎病的保護作用,對物質(zhì)代謝相關(guān)基因影響更為明顯。淫羊藿能減少代謝廢物的蓄積,降低大鼠血清膽固醇、甘油三酯,具有抑制腎小球肥大及補體C3、纖維連接蛋白在腎小球毛細血管袢的沉積,減少細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生的作用。本研究發(fā)現(xiàn),腎安提取液能降低腎組織AGEs含量,抑制糖尿病腎病模型小鼠腎皮質(zhì)RAGEsmRNA和RAGEs的表達,對DN模型鼠腎臟有保護作用。腎安提取液對C57BL/6DN模型小鼠腎臟的保護作用與藥物劑量有一定關(guān)系,腎安提取液高、中、低劑量均能顯著降低模型鼠腎皮質(zhì)RAGE