藥用植物蜘蛛香藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

藥用植物蜘蛛香藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

蜘蛛香是指失敗的加工根和根莖。蜘蛛香中鎮(zhèn)靜安神、抗抑郁等作用的主要活性成分為纈草素類,其纈草素、乙酰纈草素含量較同屬植物為高。蜘蛛香為《中國藥典》1977年版一部收載品種,但對蜘蛛香藥材未作定量測定要求。為了更好地開發(fā)利用這一植物資源,本試驗對15個不同產(chǎn)地及采集地樣品從藥材性狀、顯微特征、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分進行了測定,采用了TLC及HPLC進行了定性、定量研究,為制定蜘蛛香的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。1原理生物HP1100高效液相色譜儀;Mettler電子天平;硅膠GF254預(yù)制薄層板(青島海洋化工廠);HPLC級乙腈(美國Fisher公司);其他試劑均為分析純;對照品纈草素、乙酰纈草素均為自制(純度達98%以上);15個不同產(chǎn)地及收集時間的蜘蛛香藥材經(jīng)石晉麗副教授鑒定為蜘蛛香V.jatamansi的干燥根莖及根。2方法和結(jié)果2.1材料的性質(zhì)和微觀特性2.1.1結(jié)構(gòu)的生長排列作環(huán)根莖呈圓柱狀,粗壯,略扁,稍彎曲,長1.5～8.5cm,直徑0.5～2cm;表面暗棕色或灰棕色,有密集隆起的環(huán)節(jié)及突起的點狀根痕,有的頂端略膨大,具莖葉殘基;質(zhì)堅實,不易折斷,斷面較平整,灰棕色,可見筋脈點(維管束)斷續(xù)排列成環(huán)。根多數(shù),圓柱狀,稍彎曲,長4～10cm,直徑1～3mm;表面灰棕色,具淺縱皺紋;質(zhì)硬脆,易折斷,斷面平坦,木部點狀灰白色。根及根莖均具特異氣味,味微苦、辛。2.1.2雙組分纖維復(fù)粒的制備粉末灰棕色,有特異氣味,味微辛而苦。淀粉粒極多,單粒類圓形或卵形,臍點點狀、人字狀或飛鳥狀,有的可見層紋;復(fù)粒由2～4分粒組成,以2分粒為最多。導(dǎo)管主為網(wǎng)紋和單孔紋導(dǎo)管,多破碎,導(dǎo)管分子單穿孔明顯,穿孔多在導(dǎo)管兩端,有的位于中間側(cè)壁;另有螺紋導(dǎo)管,細(xì)長。木栓細(xì)胞淡黃色,表面觀多角形,斷面觀類長方形。纖維極少,單個散在或成束,淡黃色,壁厚,胞腔大,紋孔不明顯。木薄壁細(xì)胞淡黃色,類圓形或不規(guī)則形,胞腔大,紋孔類圓形,分布不均勻。2.2提取物、總養(yǎng)分、不溶性酸乙酰胺和水的測定2.2.1總灰文酸不溶性灰的測定浸出物測定參照藥典2005年版一部附錄ⅩA浸出物測定法,采用冷浸法測定醇溶性浸出物,乙醇為95%;總灰分、酸不溶性灰分測定參照藥典2005年版一部附錄ⅨK灰分測定法;水分測定參照藥典2005年版一部附錄ⅨH水分測定法(烘干法)。2.2.2測量結(jié)果15批樣品的浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分的測定結(jié)果見表1。2.3膜層析成像2.3.1對照溶液的制備分別稱取纈草素、乙酰纈草素對照品各0.2mg,加甲醇制成0.2mg·mL-1的對照品溶液。2.3.2試驗溶液的制備取15批蜘蛛香樣品各1g,加甲醇50mL,超聲處理30min,濾過,濾液濃縮至5mL,作為供試品溶液。2.3.3苯甲酰胺的色譜行為吸取上述供試品和對照品液各20μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,用甲苯-醋酸乙酯-丁酮(80∶15∶5)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,分別顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1。2.4重量測定2.4.1流動相乙腈-水柱5m柱色譜柱:Luna#C18(4.6mm×250mm,5μm)柱(美國Phenomenex公司);流動相乙腈-水(60∶40);檢測波長280nm;流速0.95mL·min-1;柱溫40℃。色譜分離結(jié)果見圖2。2.4.2baldrenal測定纈草素、乙酰纈草素是雙烯型纈草三酯,該類成分不穩(wěn)定,不耐熱,在酸水(乙醇)或堿水(乙醇)中會很快降解成黃色的baldrinal。但將該類成分溶解在純甲醇中,置冰箱中冷凍保存,則二者穩(wěn)定性良好。從而使外標(biāo)法測定纈草素、乙酰纈草素成為可能,因而選用甲醇作為提取溶劑。2.4.3對照品液的制備分別精密稱取纈草素、乙酰纈草3mg,置15mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻制成混合對照品液。依次精密吸取混合對照品溶液7個進樣體積進行HPLC分析,在上述色譜條件下檢測峰面積,同一進樣體積連續(xù)測3次,2種成分均以進樣量為橫坐標(biāo)(X),以平均峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸,相關(guān)系數(shù)與線性范圍見表2。2.4.4超聲提取法蜘蛛香藥材粉碎(60目篩),精密稱取1.0g,加甲醇50mL,浸泡0.5h,超聲提取40min,甲醇補足失重,取上清液經(jīng)0.45μm水系濾膜濾過,即得。2.4.5精密度測試精密吸取混合對照品液5μL,重復(fù)進樣5次,記錄峰面積,測得纈草素、乙酰纈草素峰面積的RSD分別為0.32%,0.12%。2.4.6加樣制備試驗分別稱取同批蜘蛛香藥材粉末(60目)5份,按供試品操作方法平行制備,進樣5μL,連續(xù)測3次,測得二者的RSD分別為1.3%,1.8%。2.4.7rsd測定精密吸取室溫放置的混合對照品溶液5μL,于配制后0,4,8,12,24,36,48h測定峰面積,計算RSD分別為0.23%,0.76%。2.4.8rsd測定精密吸取室溫放置的供試品溶液(按2.4.4項下制備)5μL,于配制后0,4,8,12,24,36,48h測定峰面積,計算RSD分別為0.70%,1.4%。2.4.9加草素和乙酰草素對供試品溶液的制備精密稱定已測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥材粗粉(河北省藥材公司)5份,每份1.0g,分別加纈草素7.0mg,乙酰纈草素0.95mg,按供試品溶液制備,測定。二者平均回收率分別為100.1%,99.9%,RSD分別為0.98%,1.1%。2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總質(zhì)量分?jǐn)?shù)精密稱取不同來源的15份蜘蛛香藥材粉末1.0g(60目),精密加50mL甲醇,按上述供試品溶液制備,以25μL進樣,測定色譜峰峰面積,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見表1。3色譜條件優(yōu)化對于蜘蛛香性狀、顯微特征,文中所作描述能較好地與同屬其他植物相區(qū)分;由表1可知,建議蜘蛛香藥材各指標(biāo)范圍可控制在:浸出物量不低于36.0%,總灰分不得超過5.0%,酸不溶性灰分不得超過1.4%,水分量應(yīng)低于7.0%。此結(jié)論可作為制定蜘蛛香藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。薄層色譜結(jié)果表明,15批不同產(chǎn)地和收集時間的蜘蛛香樣品中,均檢出纈草素、乙酰纈草素2種環(huán)烯醚萜類成分,斑點清晰且方法簡便、快速、可行,故此方法可用作蜘蛛香藥材的定性鑒別。為了在短時間內(nèi)獲得好的分離效果,對色譜條件進行了優(yōu)化:首先考察了不同色譜柱MerckLichroCART125-4withLichrospher100-18,PhenomenexLunaC18和NucleosilC18,其中PhenomenexLunaC18柱對蜘蛛香中環(huán)烯醚萜類成分分離效果好,柱效高,故選用該柱進行測定。同時考察了不同組成和比例的流動相(甲醇-水、乙腈-水)系統(tǒng),酸主要比較了冰醋酸和磷酸。結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)分離效果不如乙腈-水系統(tǒng),加入0.3%的磷酸可略提高分離效果,但酸液會對色譜柱造成損害,綜合考慮各因素后確定采用乙腈-水(60∶40)為流動相系統(tǒng)進行洗脫?？疾炝瞬煌牧魉?0.90,0.95,1.00mL·min-1