紹興黃酒麥曲中真菌種群結(jié)構(gòu)的初步研究

紹興黃酒麥曲中真菌種群結(jié)構(gòu)的初步研究

黃酒是中國的三大酒之一。“用小麥酒和曲線酒”是中國黃酒的特點(diǎn)。麥曲在黃酒釀造中具有極其重要的地位,被喻為“酒之骨”。麥曲質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到黃酒的產(chǎn)量和質(zhì)量,其內(nèi)在品質(zhì)與黃酒品質(zhì)之間的相輔相成。在黃酒發(fā)酵中麥曲具有復(fù)合糖化發(fā)酵粗酶制劑的功能,并且賦予了黃酒獨(dú)特的色、香、味。黃酒釀造所用的麥曲是采用固態(tài)培養(yǎng)體系,在人工創(chuàng)造的培養(yǎng)條件下自然培育而形成的。麥曲中的微生物來源包括環(huán)境空氣、制曲用水、制曲工具以及小麥原料等帶入的微生物,受到諸多方面的因素影響,造就了麥曲中的極其復(fù)雜的微生物群落。通常,對(duì)于微生物體系的研究往往采用梯度稀釋分離培養(yǎng)的方法進(jìn)行,但是由于分離培養(yǎng)條件的選擇性限制,對(duì)于復(fù)雜體系及其動(dòng)態(tài)變化往往很難再現(xiàn)樣本中的存在狀況。近年來,基于PCR擴(kuò)增的分子生物技術(shù),如核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)分析(ribosomalintergenicspaceranalysis,RISA)、變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)、末端限制性酶切片段多態(tài)性(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)等非培養(yǎng)的微生物分子生態(tài)學(xué)方法,在環(huán)境樣本的真菌多樣性研究中,能夠較快捷、客觀地反映微生物的存在狀況和變化。已有的研究結(jié)果表明,真菌尤其是絲狀真菌對(duì)麥曲的功能發(fā)揮著重要作用。作者采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū)分析(RISA)技術(shù),對(duì)紹興黃酒麥曲這一復(fù)雜微生物體系中的真菌進(jìn)行了初步研究。1材料和方法1.1培養(yǎng)基的制備麥曲:紹興某黃酒公司提供。分離培養(yǎng)基:察氏培養(yǎng)基、土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、麥汁瓊脂培養(yǎng)基,均加入30mg/L的鏈霉素抑制細(xì)菌生長和200mg/L的脫氧膽酸鈉抑制菌絲蔓延。斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;麩皮培養(yǎng)基:麩皮∶水=1∶1。培養(yǎng)基均采用0.1MPa下滅菌20min。1.2真菌的分離和鑒定1.2.1真菌的分離和繁殖對(duì)麥曲樣品進(jìn)行稀釋分離,采用3種培養(yǎng)基分別進(jìn)行培養(yǎng)。將所得的單菌落轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)中,根據(jù)形態(tài)的差異挑出不同的真菌。1.2.2pcr擴(kuò)增條件采用氯化芐法提取菌株的染色體DNA。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR擴(kuò)增引物為pITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′)和pITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。50μL的PCR反應(yīng)體系:40μLddH2O、5μL10×PCRBuffer(含MgCl2)、1μL4×dNTP、1μLpITS1、1μLpITS4、1μLDNA模板。PCR擴(kuò)增條件為:95℃變性5min,冰上加入1μLTaq酶。94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,共30個(gè)循環(huán)。然后72℃延伸10min。保存于-20℃?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)結(jié)果用2g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測,拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化,用pMD18-T連接,轉(zhuǎn)化E.coli,PCR擴(kuò)增驗(yàn)證插入片斷。測序由寶生物工程大連有限公司完成。1.2.3gebak序列分析測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN3.0軟件去載體后,將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,利用Blastn軟件進(jìn)行序列比對(duì),選取序列最相近的1個(gè)GenBank收錄序列,用DNAMAN3.0軟件分析克隆子的序列與GenBank收錄序列的相似性。1.3ris法分析了曲線制造過程中的真菌變化1.3.1小麥曲線樣品處理無菌條件下,將粉碎好的麥曲加入帶玻璃珠的三角瓶中,加入無菌生理鹽水浸提。浸提液無菌過濾,濾液離心,收集沉淀,用于提取總DNA。1.3.2聚丙稀酰胺凝膠電泳DNA的提取和PCR擴(kuò)增參照1.2.2,PCR產(chǎn)物經(jīng)PCRPurificationKit純化后,用4g/dL聚丙稀酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后,溴化乙錠染色拍照,回收樣品中的各條帶,置于1.5mL的離心管中,供回收使用。1.3.3dna的提取加入50μL的洗脫緩沖液(500mmol/L乙酸銨,10mmol/L乙酸鎂,1mmol/LEDTA,0.1%SDS)在放有PAGE條帶的離心管中,37℃水浴5h,12000g離心10min,取上清液,用PCRPurificationKit回收DNA。然后以純化DNA為模板,按1.2.2方法進(jìn)行序列克隆,測序結(jié)果按1.2.3方法進(jìn)行分析。1.4小麥草的酶特性1.4.1從三角瓶至懸浮液的制備取30℃培養(yǎng)3d的試管斜面菌種,加入無菌生理鹽水洗下孢子,無菌條件下過濾至帶玻璃珠的無菌三角瓶中搖勻,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將孢子濃度調(diào)至106個(gè)/mL,制成孢子懸浮液。取1mL孢子懸浮液接入麩皮培養(yǎng)基中,或按1∶1接入待混合培養(yǎng)的真菌孢子懸液,30℃靜置培養(yǎng),每隔4h搖瓶一次,進(jìn)行純種及混合固態(tài)培養(yǎng)。1.4.2振蕩浸提1h固態(tài)培養(yǎng)后,向麩曲中加入生理鹽水,于30℃、120r/min條件下振蕩浸提1h。三層紗布過濾,所得濾液分別用于測定α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶的活性。1.4.3酶激活分析及單位定義α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素活力的測定參照中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),木聚糖酶活力按文獻(xiàn)測定,所有酶活均用μ/g干曲表示。2結(jié)果與分析2.1麥曲中主要真菌的分離和培養(yǎng)采用土豆瓊脂、麥汁瓊脂、察氏培養(yǎng)基3種不同的培養(yǎng)基對(duì)麥曲樣品進(jìn)行梯度稀釋、系統(tǒng)分離,真菌總菌落數(shù)達(dá)2.7×106個(gè)/g麥曲。從3000多個(gè)菌落中根據(jù)菌落形態(tài)的差異共獲得16種不同真菌,均為絲狀真菌,編號(hào)JZQ-1～JZQ-16。其中JZQ-1～JZQ-5的菌落數(shù)均在105個(gè)/g麥曲以上,占分離總菌落數(shù)的89%。對(duì)各株真菌純培養(yǎng)物進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增和測序,與GenBank數(shù)據(jù)庫中最相似序列的比對(duì)結(jié)果見表1。鑒定結(jié)果顯示,從麥曲中分離獲得的16種絲狀真菌,分別為傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)、米根霉(Rhizopusoryzae)、微小毛霉(Rhizomucorpusillus)、米曲霉(Aspergillusorgyze)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、構(gòu)巢裸孢殼(Emericellanidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、Penicilliumthiersii、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、賽氏曲霉(Aspergillussydowii)、魯西坦念珠霉(Issatchenkiaorientalis)、克魯賽念珠霉(Clavisporalusitaniae)、互格鏈格孢(Alternariaalternata)、蘋果鏈格孢(Alternariamali)、尖孢枝孢(Cladosporiumcladosporioides)、芽孢枝孢(Cladosporiumoxysporium)。其中前5種是紹興黃酒麥曲中的主要真菌。從分離培養(yǎng)的結(jié)果可以看出,毛霉目的犁頭霉屬、根霉屬、毛霉屬在麥曲中的數(shù)量高達(dá)76%,而曲霉屬雖然只占總數(shù)的18.7%,但是種類卻是最多的,有5個(gè)不同的種。研究結(jié)果與以往對(duì)紹興黃酒麥曲微生物的研究結(jié)論有較大差異。2.2麥曲中的優(yōu)勢真菌黃酒生麥曲的制作過程是一個(gè)開放的微生物的培養(yǎng)過程,因而采用傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法不僅工作量巨大,而且不能清晰反映出制曲過程中麥曲微生物生長變化情況。相比而言,分子水平的研究方法不僅可以大大降低工作量,而且在研究微生物種群結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)變化等方面非常便捷。運(yùn)用基于PCR的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)分析法(RISA)對(duì)紹興黃酒麥曲制作過程中真菌的變化進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1。從圖1中可看出,在制曲過程中的不同時(shí)間,麥曲中的優(yōu)勢真菌不同。制曲過程中優(yōu)勢真菌的種類先增加,隨后減少。第3天和第4天的圖譜條帶基本相同,結(jié)合制曲過程中的溫度變化情況,此時(shí)麥曲品溫分別達(dá)55℃和51℃。分析認(rèn)為,在這么高的溫度下曲中的真菌已停止生長,故這兩天的RISA圖譜基本相同。此外,第17天和第24天的RISA圖譜條帶也基本相同,表明從制曲的第17天開始,麥曲中的主要微生物已占絕對(duì)優(yōu)勢,種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不再發(fā)生變化,此時(shí)糖化酶的活力處在較高水平,達(dá)到1012U/g干曲。從真菌的角度來看,在制曲的第17天就可出曲房了。對(duì)制曲過程第1天和第24天的條帶進(jìn)行回收、克隆、測序,結(jié)果見表2。從表2可以看出,在制曲過程的第1天和第24天,麥曲樣品中的優(yōu)勢真菌發(fā)生了很大的變化,大部分優(yōu)勢霉菌不相同,僅有傘枝犁頭霉(Absidiacorymbifera)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)相同,但代表這兩種微生物的條帶在亮度上有差異,說明在制曲始末兩者在麥曲樣品中的數(shù)量和比例不同。RISA圖譜及序列分析結(jié)果都表明在制曲過程中,麥曲中的真菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變動(dòng)。2.3小麥曲線中的主要闡明特征2.3.1不同菌株的糖化酶活力在黃酒釀造中,通常認(rèn)為傳統(tǒng)生麥曲既是糖化發(fā)酵粗酶劑,又作為少量釀酒原料和營養(yǎng)物質(zhì)。麥曲中真菌的產(chǎn)酶特性是值得關(guān)注的。選取分離獲得的麥曲中7株真菌(傘枝犁頭霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢裸孢殼、黑曲霉)進(jìn)行純種培養(yǎng),調(diào)查各菌株的產(chǎn)α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、木聚糖酶、纖維素酶的情況,結(jié)果見表3。從表3可以看出,7株麥曲中的主要真菌,僅AspergillusoryzaeAO-01、AspergillusfumigatusAF-02、AspergillusnigerAN-13能夠產(chǎn)降解小麥和糯米原料的酶,其中A.oryzaeAO-01和A.fumigatusAF-02產(chǎn)能降解淀粉原料的糖化酶,A.nigerAN-13產(chǎn)能降解木聚糖和纖維素的木聚糖酶和纖維素酶。從純種制曲應(yīng)用于釀造的角度看,A.oryzaeAO-01的糖化酶活力最高達(dá)1359.4U/g干曲,可快速降解淀粉原料,能用作黃酒純種制曲的菌株。A.fumigatusAF-02糖化酶活力低,僅368.9U/g干曲,分解淀粉的能力低,不宜單一用作純種制曲。而其它的5株絲狀真菌由于不產(chǎn)液化酶和糖化酶,不能將淀粉原料分解為酵母能利用的葡萄糖。2.3.2不同培養(yǎng)條件對(duì)真菌-淀粉酶、糖化酶活力的影響麥曲作為一個(gè)微生物的混合培養(yǎng)體系,其中含有的不同的微生物之間存在著一定的相互作用,勢必會(huì)影響到它的代謝活動(dòng)。選擇純種培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)酶的A.oryzaeAO-01、A.fumigatusAF-02、A.nigerAN-13分別與其它真菌兩兩混合培養(yǎng),測定混合培養(yǎng)體系產(chǎn)生的α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶的活力,結(jié)果見表4。A.oryzaeAO-01與其它6株真菌混合培養(yǎng)時(shí),α-淀粉酶、糖化酶活力均有所下降,蛋白酶活力均有所提高。特別是A.oryzaeAO-01和A.nigerAN-13的混合培養(yǎng)體系,蛋白酶活力高達(dá)3710.6U/g干曲,分別是A.oryzaeAO-01和A.nigerAN-13純種培養(yǎng)的4.5倍和8.6倍。此外混合培養(yǎng)體系還或多或少的檢測出木聚糖酶和纖維素酶酶活。A.fumigatusAF-02與其它5株真菌混合培養(yǎng)時(shí),糖化酶活力都大幅下降,而蛋白酶活力都有所提高。尤其是與A.nigerAN-13的混合培養(yǎng)體系檢測不到糖化酶活力。此外,A.fumigatusAF-02與E.nidulansEN-05、R.pusillusRP-09、A.nigerAN-13的混合培養(yǎng)體系能夠檢測到木聚糖酶活力。A.nigerAN-13與其它4株真菌混合培養(yǎng)時(shí),木聚糖酶活力和纖維素酶活力均大幅下降,而蛋白酶活力均有所提高,只有與R.pusillusRP-09混合培養(yǎng)時(shí)蛋白酶活力下降到122.6U/g干曲,卻檢測到了糖化酶酶活146.7U/g干曲。從表4中可以看出,兩種真菌混合培養(yǎng)物的產(chǎn)酶情況不是單個(gè)真菌產(chǎn)酶的簡單相加。兩種真菌混合培養(yǎng)時(shí),代謝產(chǎn)酶狀況從一定程度上反映出相互之間生長的影響。產(chǎn)酶狀況的變化繼而影響到對(duì)黃酒釀造原料的降解,這也可能就是純種釀造的黃酒口味淡薄的原因之一。3基于pcr的非培養(yǎng)方法運(yùn)用分離培養(yǎng)方法,共獲得16種絲狀真菌,分子鑒定的結(jié)果顯示:傘枝犁頭霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、煙曲霉是麥曲中的主要真菌。此結(jié)果不完全同于以往的研究結(jié)論,考慮到麥曲是經(jīng)過自然培養(yǎng)形成的,這一差異是否源于幾十年來