DNA重組技術(shù)的基本步驟課件

1.2基因工程的基本操作程序DNA重組技術(shù)的基本步驟目的基因的檢測與鑒定目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序主要包括四個步驟DNA重組技術(shù)的基本步驟1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄DNA重組技術(shù)的基本步驟RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結(jié)合位點(diǎn)的一種蛋白質(zhì).RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。DNA重組技術(shù)的基本步驟①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列.包括啟動子和終止子DNA重組技術(shù)的基本步驟2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子

外顯子

轉(zhuǎn)錄mRNA前體加工翻譯肽鏈啟動子終止子成熟mRNA能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列。

外顯子:

內(nèi)含子:

DNA重組技術(shù)的基本步驟真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（啟動子）。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子DNA重組技術(shù)的基本步驟原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼DNA重組技術(shù)的基本步驟閱讀與思考1、什么是目的基因？2、獲取目的基因的方法有哪些？其操作過程分別是怎樣的？請閱讀P9第一和二兩段DNA重組技術(shù)的基本步驟1、目的基因概念：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、目的基因獲取方法：Ⅰ、從基因文庫中獲取目的基因Ⅱ、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因Ⅲ、化學(xué)方法直接人工合成一、目的基因的獲取DNA重組技術(shù)的基本步驟Ⅰ、從基因文庫中獲取目的基因基因文庫

基因組文庫部分基因文庫DNA重組技術(shù)的基本步驟基因文庫的構(gòu)建過程限制酶拼接到載體上導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷,導(dǎo)入到受體菌的群體中,各個受體菌分別含有這種生物的不同基因,稱為基因文庫?；蚪M文庫DNA重組技術(shù)的基本步驟cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)基因文庫的構(gòu)建過程DNA重組技術(shù)的基本步驟

真核生物的基因用逆轉(zhuǎn)錄法得到的cDNA與原基因相同嗎？有哪些差異？原核生物基因呢？思考？DNA重組技術(shù)的基本步驟基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較DNA重組技術(shù)的基本步驟怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢?DNA重組技術(shù)的基本步驟如何從基因文庫中找到所需要的基因？依據(jù)------目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA

基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。DNA重組技術(shù)的基本步驟構(gòu)建基因組DNA文庫時，首先應(yīng)分離細(xì)胞的A、染色體DNA

B、線粒體DNAC、總mRNA

D、tRNA目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是A、某生物的全套基因就是一個基因文庫B、將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個生物體內(nèi)，則這個生物就是一個基因文庫C、含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D、含有一種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫ACDNA重組技術(shù)的基本步驟Ⅱ、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR的全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR的原理：

DNA復(fù)制

PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。選修3、P58DNA重組技術(shù)的基本步驟模板原料引物

酶控制溫度利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因——目的基因DNA——四種脫氧核苷酸——如單鏈DNA分子片段，使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸——耐熱的DNA聚合酶——PCR儀自動調(diào)控PCR的條件：DNA重組技術(shù)的基本步驟DNA重組技術(shù)的基本步驟過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加___倍一DNA重組技術(shù)的基本步驟加熱至95攝氏度的目的是使DNA中的

斷裂，這一過程在細(xì)胞內(nèi)是通過

的作用來完成的。當(dāng)溫度降低時，引物與模板末端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2個DNA分子，此過程中的原料是

，遵循的原則是

。Taq酶的特點(diǎn)是（）

A.耐強(qiáng)酸B.耐強(qiáng)堿

C.耐高溫D.最適溫度37攝氏度4.請指出PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程的區(qū)別

解旋酶C脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對原則DNA重組技術(shù)的基本步驟DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所原理?xiàng)l件解旋方式酶特點(diǎn)結(jié)果PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較堿基互補(bǔ)配對原則堿基互補(bǔ)配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等DNA重組技術(shù)的基本步驟用化學(xué)方法直接人工合成條件：基因較小，核苷酸序列已知。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測推測

化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？DNA重組技術(shù)的基本步驟反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推測推測單鏈DNA合成DNA重組技術(shù)的基本步驟2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細(xì)胞中提?、芾肞CR技術(shù)⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥1．在已知基因的核苷酸序列的情況下，獲取目的基因的最方便方法是A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫法C、CDNA文庫法

D、聚合酶鏈反應(yīng)DNA重組技術(shù)的基本步驟3、在基因工程中，把選出的一個目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4次，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是（）個A.540B.8100C.17280D.7560DNA重組技術(shù)的基本步驟4、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時應(yīng)給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑧⑨B．①②④⑥⑦⑧C．①②⑤⑥⑦D．①③⑥⑦⑧D5、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是①從基因文庫中獲取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③DDNA重組技術(shù)的基本步驟（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用__________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建—核心DNA重組技術(shù)的基本步驟質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種DNA重組技術(shù)的基本步驟2、基因表達(dá)載體的組成目的基因啟動子:終止子:標(biāo)記基因等一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段。位于基因的首端。一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段。位于基因的尾端。DNA重組技術(shù)的基本步驟啟動子的作用：終止子作用：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止。標(biāo)記基因作用：是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來，如青霉素基因。

是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。DNA重組技術(shù)的基本步驟3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：a.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。b.使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？DNA重組技術(shù)的基本步驟不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記；（4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等；（5）有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。DNA重組技術(shù)的基本步驟①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意DNA重組技術(shù)的基本步驟

目的基因與運(yùn)載體結(jié)合所需的條件有①同一種限制酶②具有抗性基因的質(zhì)粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA連接酶⑥四種脫氧核苷酸⑦ATPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦C．①②③④⑤D．①②④⑤⑦（多選）一個基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括

A．目的基因B．啟動子

C．終止子D．標(biāo)記基因ABCDDDNA重組技術(shù)的基本步驟下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是A．啟動子是與RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，是起始密碼B．啟動子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C．標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別ADNA重組技術(shù)的基本步驟

1、什么是轉(zhuǎn)化？

2、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法是什么？具體過程是怎樣的？

3、目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎樣的？

4、目的基因?qū)氪竽c桿菌的方法是怎樣的？鈣離子有什么作用？三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞DNA重組技術(shù)的基本步驟轉(zhuǎn)化目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用的受體細(xì)胞：原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌真核生物：酵母菌和動植物細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。DNA重組技術(shù)的基本步驟1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用的方法:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法農(nóng)桿菌的特點(diǎn):c.Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。b.具有趨化性。a.易感染雙子葉植物和祼子植物。DNA重組技術(shù)的基本步驟（1）、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法DNA重組技術(shù)的基本步驟整合到染色體上轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞DNA重組技術(shù)的基本步驟

根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理，你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎？若想將一個抗病基因?qū)雴巫尤~植物(如小麥），從理論上說，你認(rèn)為應(yīng)該怎么做？P15-2思考與探究因?yàn)閱巫尤~植物不能分泌出大量的酚類化合物來吸引農(nóng)桿菌，

向單子葉植物的傷口處噴灑酚類化合物，使用基因槍法及花粉管道法。DNA重組技術(shù)的基本步驟（2）基因槍法

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。1、常用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化方法2、特點(diǎn)：成本高DNA重組技術(shù)的基本步驟（3）花粉通道法

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得DNA重組技術(shù)的基本步驟２.目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用的方法:

顯微注射技術(shù)操作程序：a.先提純含目的基因的表達(dá)載體b.從雌性動物體內(nèi)取出卵（受精卵）c.顯微注射儀進(jìn)行顯微注射d.將含目的基因的受精卵移植到輸卵管或子宮中發(fā)育成新個體DNA重組技術(shù)的基本步驟常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞原核生物的特點(diǎn):繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少。DNA重組技術(shù)的基本步驟大腸桿菌的轉(zhuǎn)化過程:用Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。增加細(xì)胞壁的透性，與細(xì)胞膜無關(guān)DNA重組技術(shù)的基本步驟

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理DNA重組技術(shù)的基本步驟植物基因工程動物基因工程微生物基因工程常用方法受體細(xì)胞比較目的基因?qū)氩煌?xì)胞的方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法Ca2+處理法體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞DNA重組技術(shù)的基本步驟1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是A．結(jié)構(gòu)簡單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BDDNA重組技術(shù)的基本步驟1、導(dǎo)入目的基因后需要檢測哪些方面？各采取什么方法？2、什么是DNA分子探針？檢測時的DNA探針通過什么原理來檢測目的基因和相應(yīng)的mRNA？3、利用抗體－抗原雜交檢測的原理是什么？四、目的基因檢測與鑒定DNA重組技術(shù)的基本步驟檢測內(nèi)容檢測方法1.目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體的DNA上2.目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA3.目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)4、個體生物學(xué)水平的鑒定分子雜交技術(shù)抗原—抗體雜交DNA分子雜交技術(shù)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA探針：用放射性同位素等作標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段。DNA重組技術(shù)的基本步驟（一）、檢測1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交