《煙草廢棄物中蘆丁提取工藝的實驗探究》10000字（論文）

煙草廢棄物中蘆丁提取工藝的實驗研究 8312摘要 摘要：煙草主要以工業(yè)原料的形式用于中國的卷煙生產(chǎn)。但是在中國煙草措施日益嚴格的情況下，制約著煙草種植發(fā)展。所以，把煙草向食品及保健品，醫(yī)藥，飲料，化妝品等產(chǎn)業(yè)開發(fā)，有利于煙草種植業(yè)不斷向前發(fā)展。另外，每年煙草采收后產(chǎn)生的幾十萬噸廢棄物不能夠應(yīng)用到卷煙生產(chǎn)中去，同時這些廢棄物也得不到合理利用和有效處理，不僅浪費可用資源，而且污染環(huán)境。因此，如何有效回收和利用廢棄煙草，是煙草業(yè)急需解決的難題之一。其中，綜合利用煙草中含有的天然活性成分蘆丁以提高其利用率具有重要意義。同時，也可降低煙葉生產(chǎn)成本。實現(xiàn)經(jīng)濟效益最大化。因此開發(fā)煙草綜合利用途徑十分必要。迫在眉睫。勢在必行?？滩蝗菥?。任重而道遠。當務(wù)之急?？滩蝗菥?。本論文運用現(xiàn)代提取分離技術(shù)理論與方法對煙草廢料有效部位蘆丁進行分離提取工藝研究，建立并改進了適合上述有效成分的最佳提取分離工藝。本項目以煙草廢料為研究對象，綜合國內(nèi)外所進行的有關(guān)研究，運用現(xiàn)代提取分離技術(shù)的理論與方法對煙草廢料有效成分蘆丁進行了分離與提取技術(shù)研究，建立并完善了適用于上述活性成分提取分離的優(yōu)化工藝。另外，本論文還通過對國內(nèi)外文獻進行調(diào)研，對煙草廢棄物若干活性成分進行提取優(yōu)化，摸索出一套聯(lián)合提取與分步分離相結(jié)合的生產(chǎn)工藝流程，以期對煙草廢棄物綜合利用有新的思路，并發(fā)現(xiàn)可能具有更高價值的活性成分。關(guān)鍵詞：煙草廢棄物，蘆丁，提取分離工藝前言天然產(chǎn)物是由動物，植物，微生物，海洋生物等分離得到的代謝產(chǎn)物，這類有機化合物來到自然界一般都有其特定的生理活性，或者可以作為先導化合物經(jīng)過合適的結(jié)構(gòu)改造后轉(zhuǎn)化為下一代藥物。有些天然產(chǎn)品還有很大經(jīng)濟價值，例如用作食品添加劑，日化原料等化工產(chǎn)品。天然產(chǎn)物提取方法很多。本文綜述了目前應(yīng)用較多的幾種植物提取物制備工藝及其在食品中的作用機理。并對其發(fā)展趨勢作了展望。溶劑法：是最常用的一種提取方法。它包括回流和萃取兩種。有效成分的萃取和分離應(yīng)根據(jù)其主要物理，化學性質(zhì)和各種萃取技術(shù)的原理，特性進行篩選，才能確保所要求組分的呈現(xiàn)，同時盡可能地避免不必要組分的擾動，使隨后的分離工作得以簡化。提取方法分為傳統(tǒng)提取方法與現(xiàn)代提取方法兩大類。常規(guī)萃取技術(shù)有溶劑萃取，蒸汽蒸餾，升華等。溶劑萃取法是以“相似溶解”原理為依據(jù)。提取方法有浸泡法，滲濾法，煎煮法，回流提取法，連續(xù)回流提取法等。蒸汽蒸餾的基本原理就是加熱煮沸時，被分離出來的物質(zhì)會隨著蒸汽一起被帶走。升華法是物質(zhì)受熱后直接變成氣體然后凝結(jié)為固體。這些提取方法無需專用儀器設(shè)備，過程簡單費用低。傳統(tǒng)的分離純化天然活性成分的方法包括溶劑萃取法、沉淀分離結(jié)晶法和色譜法。近年來，隨著人們環(huán)保意識的提高和國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，天然產(chǎn)物的分離純化技術(shù)有了長足的進步。新興技術(shù)包括新型色譜技術(shù)、大孔樹脂吸附技術(shù)、膜分離技術(shù)以及分子蒸餾技術(shù)等。其中，新型色譜技術(shù)主要有：高通量固相-液相色譜儀（HPLC），毛細管電泳儀（CE），凝膠過濾色譜法（GPC）及快速質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，這些新技術(shù)具有傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢，對提高生產(chǎn)效率、減少環(huán)境污染起到了積極的促進作用。煙草這一特殊經(jīng)濟作物，其種植過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物根莖芽頂部大約占煙草產(chǎn)量的一半多沒有得到有效處理與合理利用，年產(chǎn)生幾十萬噸左右的煙葉，煙末及其他廢棄物無法應(yīng)用于卷煙生產(chǎn)中，給可利用資源帶來很大浪費。煙草廢料的綜合利用研究受到了廣泛關(guān)注。國內(nèi)外相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，廢煙草的綜合利用包括焚燒、排放加熱、發(fā)酵生產(chǎn)有機肥和乙醇、生產(chǎn)煙片、活性炭和提取重要化合物。煙草重要化合物提取與利用的研究重點是重要醫(yī)藥原料茄尼醇與尼古丁，營養(yǎng)價值高的蛋白質(zhì)和藥理和生物活性較廣的活性物質(zhì)有綠原酸等。作為重要資源受到廣泛關(guān)注，煙葉為全球主要經(jīng)濟作物之一。在我國烤煙產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)量的1/3.隨著人民生活水平的不斷提高。對優(yōu)質(zhì)煙用原料的需求與日俱增。因此，煙草加工十分迫切，前景廣闊，潛力巨大。但煙草廢料中存在著某些具有高附加值的潛在活性成分。近些年來，煙草工業(yè)得到大力發(fā)展，煙草廢料中活性成分分析探討及其分離純化工藝研究也逐漸受到研究者重視。對于煙草及廢棄物中活性成分開展更加廣泛和深入地研究，推動煙草行業(yè)向多元化方向發(fā)展，發(fā)揮出其較高經(jīng)濟價值與社會效益。切實提高煙草廢棄物綜合利用效率并開發(fā)其潛在價值顯得尤為重要。本研究通過對比試驗，建立了煙草廢料中蘆丁的快速檢測方法。通過單因素分析法考察提取次數(shù)，乙醇濃度，液料比，提取溫度，超聲波提取時間5個因素對蘆丁提取率影響。通過比較不同種類大孔樹脂的吸附和解吸性能，篩選出適合于煙草廢料提取物中蘆丁富集的樹脂，并討論了樹脂柱層析動態(tài)富集蘆丁的技術(shù)條件。對優(yōu)化條件進行了驗證實驗，同時對煙草廢棄物及提取物中蘆丁純度進行了檢測，檢驗了優(yōu)化工藝對其影響。1實驗部分蘆丁，別名蕓香苷，是一種含多羥基、具有抗菌、抗氧化、抗炎等廣泛藥理活性、細胞毒性低乃至無毒的天然抗氧化劑，近年來受到國內(nèi)外學者廣泛關(guān)注。主要用于治療高血壓、心血管、胃病、皮膚病、糖尿病等疾病?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品和化妝品工業(yè)。目前煙草廢棄物中主要有效成分大多是煙堿、茄尼醇、蛋白質(zhì)等。但黃酮類化合物特別是蘆丁卻鮮見報道，煙草中蘆丁含量已達到0.45%-1.5%。雖然有部分提取溶劑對煙葉中蘆丁的提取率進行了比較分析，認為乙醇是較好的提取劑，但還未見到對其他條件（如提取溫度、時間、液料比等）進行優(yōu)化提取的有關(guān)報道。所以該研究選擇廢棄煙葉作為研究對象，用準乙醇水溶液作提取劑，采用超聲波輔助提取法從廢煙草中提取蘆丁，粗提物經(jīng)大孔樹脂分離富集。通過比較不同樹脂對廢棄煙葉提取物中蘆丁靜態(tài)吸附解吸的效果，篩選出富集分離煙葉蘆丁較為理想的樹脂，并在此基礎(chǔ)上對樹脂工藝參數(shù)進行考察與優(yōu)化，以期為煙草中蘆丁提取與分離的研究提供借鑒。1.1儀器與試劑（1）植物材料煙草品種K326栽培于廣東南雄市湖口鎮(zhèn)。調(diào)制后在煙草收購站沒有收購到的低等級煙葉，作為煙草廢料研究的材料。（2）試劑本研究中所使用之蘆丁標準品（純度>99%）及三氯化鋁（A.R.級）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。鹽酸，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，氯化鈉，醋酸鈉，冰醋酸和乙醇是從廣州化學試劑廠購買的分析純（A.R.）級。（3）儀器設(shè)備微孔分光光度儀（貝生儀器有限公司），真空吸泵（鞏義市映宇玉華儀器廠）、移液槍（大隆興創(chuàng)實驗儀器有限公司），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海青浦湖西儀器廠）、BB25—12DT型微孔分光光光度儀（美國伯騰儀器有限公司）、BB26—12DT—20型伯騰玻璃分析儀、BB—20型牛蜀玻璃分析儀、B25—20型玻璃分析儀、B24—20型玻璃柱、MSA524S—1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。1.2實驗方法1.2.1分光光度計快速測定蘆丁含量的方法的建立在國家標準中，煙草蘆丁是用高效液相色譜法精確檢測的。該方法準確、穩(wěn)定，但分析時間至少需要40min，費時、費力、昂貴，不利于大批量樣品的檢測。然而，蘆丁是煙葉中的主要黃酮類化合物。為了方便快捷地檢測提取物中蘆丁的含量，參考槐花等植物組織提取物中蘆丁的檢測方法，比較了三種分光光度法檢測煙葉提取物中蘆丁的含量。具體步驟簡單介紹如下：（1）蘆丁對照品溶液制備準確稱取120℃干燥的蘆丁標準樣品0.0105g，溶于60%乙醇中，搖勻，稀釋至100mL，制成濃度為0.10mg/ml-1的蘆丁標準樣品，儲存于4℃冰箱中備用。（2）樣品溶液制備精確稱取干煙葉粉末1.0克178～840m,放入干凈50ml錐形瓶內(nèi)，加乙醇30ml,以乙醇為萃取溶劑，放入超聲波清洗器超聲萃取20min,50℃萃取3次，合并濾液過濾得樣品溶液。（3）三氯化鋁顯色法并且對文獻（趙恩澤2011）的實踐進行借鑒與完善。具體步驟略述如下。畫標準曲線：精確汲取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL蘆丁標準件，編號0.1，2，3，4，5，將其置于6個干凈的10mL容量瓶中，加入1ml0.1molL三氯化鋁和1.5ml0.2molL的醋酸鈉-醋酸鹽緩沖液,pH=5.5，以吸光度為橫坐標，濃度（mg.ml-1）為縱坐標繪制標準曲線為對照。試樣中蘆丁含量測定：吸取約1.4mL樣品于5mL離心管中，加入1mL石油醚萃取至上清液無色，取出濾液1mL于干凈的10mL容量瓶中，根據(jù)標準曲線畫出吸光值代入標準曲線算出蘆丁提取率。（4）硝酸鋁顯色法現(xiàn)將參考方法（馬國剛，2007）及具體步驟略述于下。畫出標準曲線：將0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL將蘆丁準確吸取到6個干凈的10mL容量瓶中，得到0,1,2,3,4,5蘆丁的標準樣品。加入0.5mL亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6min。然后加入硝酸鋁溶液1ml,搖勻，靜置6min。以吸光度為橫坐標、濃度（mg·ml-1）為縱坐標繪制標準曲線。樣品中蘆丁的檢測：取約1.4mL樣品于5mL離心管中，加1mL石油醚提取無色上清液，取濾液1mL置于潔凈的10mL容量瓶中，測其吸光度值，代入標準曲線算出蘆丁提取率。（5）紫外分光光度法參考文獻（劉玉芬等，2005）的方法，具體操作步驟簡單描述如下。畫出標準曲線：將0，0.5，1.0，2.0，3.0和4.0mL蘆丁精確汲取到6只干凈10mL容量瓶內(nèi)，編號0-1-2-3-4-5，以10mL蘆丁乙醇進行定容。以0為空白對照測定No的吸光度。波長260nm0-5標準樣本。以吸光度為橫坐標，濃度（mg.ml-1）為縱坐標繪制了標準曲線。試樣中蘆丁含量測定：取1.4mL試樣在5mL離心管內(nèi)，加1mL石油醚提取至上清液呈無色時，取濾液1mL在潔凈10mL容量瓶內(nèi)，測定吸光值并代入標準曲線算得蘆丁提取率。1.2.2超聲波輔助提取廢棄煙葉蘆丁的工藝優(yōu)化（1）實驗流程先將廢煙葉收集起來，然后采用超聲波輔助乙醇提取廢煙葉中的蘆丁。利用單因素分析獲得最佳提取參數(shù)是提取次數(shù)、提取溫度、超聲作用時間、提取液乙醇濃度及液料比、蘆丁產(chǎn)量為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析獲得隨機變量相互作用及最優(yōu)組合及響應(yīng)目標最優(yōu)值。實驗設(shè)計過程見圖1-1。圖1-1實驗設(shè)計流程圖（2）原料預(yù)處理45℃干燥，粉碎，篩分，回收178-840μM煙草粉，儲存在干燥器中備用。原料預(yù)處理工藝見圖2-2：圖1-2原料預(yù)處理流程圖（3）提取工藝流程精確稱取一定數(shù)量的預(yù)處理煙葉粉并將其放置于潔凈50mL錐形瓶內(nèi)，加入一定量的提取溶劑，放入超聲波清洗機中，在特定溫度下提取，超聲一段時間后提取一定量，濾除合并濾液即得樣品溶液。提取工藝流程如圖1-3所示：圖1-3廢棄煙葉中蘆丁提取工藝流程圖（4）單因素試驗精確稱取1.0克預(yù)處理廢煙葉粉作提取液，蘆丁提取率為評價指標。研究提取次數(shù)，提取液乙醇濃度，液料比，提取溫度，超聲時間等五個單因素對于蘆丁提取速率的影響。1.2.3大孔樹脂型號的篩選（1）上樣液的制備根據(jù)上述方法獲得制備提取物的最佳工藝，并在70℃真空減壓下濃縮至約原體積的1/10，保存起來待用，用時加入適量去離子水進行稀釋即可。（2）靜態(tài)吸附性能的測定將1.0g前處理的3種大孔吸附樹脂分別精密稱取裝在60mL具塞廣口瓶內(nèi)，添加取上樣液20mL,另將未添加樹脂的具塞廣口瓶加到20mL,放入搖床內(nèi)，在80r.min-1,25℃振蕩12h,將吸附液濾過，濾液分別按三氯化鋁顯色法測定蘆丁的吸附量和吸附率。式中C0為上樣液中蘆丁的濃度C1為吸附后濾液中蘆丁的濃度V1為上樣液體積N為稀釋倍數(shù)1.2.4D101樹脂柱層析法分離廢棄煙葉中蘆丁工藝條件的研究影響同種大孔樹脂對目標物質(zhì)吸附作用的主要因素包括被分離化合物性質(zhì)、樣品溶液清晰度、樣品溶液中目標物質(zhì)濃度以及樣品流速等。影響大孔樹脂與目標物質(zhì)解吸的主要因素有洗脫劑的選擇、洗脫液濃度和洗脫流速。本試驗采用廢煙葉提取物水溶液作試樣，乙醇作洗脫劑。對樣品中蘆丁的濃度，進樣流速，洗脫液乙醇濃度、洗脫流速等因素對廢煙葉中蘆丁在D101樹脂上分離富集的影響規(guī)律，并優(yōu)選了D101樹脂柱進行蘆丁分離的最佳條件。（1）濕法裝柱在φ20×400玻璃層析柱上裝上預(yù)處理大孔樹脂。首先往玻璃層析柱內(nèi)加水10cm,再把浸沒在水中的樹脂攪拌均勻后沿玻璃棒慢慢倒進層析柱內(nèi)，打開玻璃層析柱活塞并調(diào)整流速使水由下向上慢慢排出，待樹脂自然下沉后不留下氣泡，裝柱時需要時刻保持液面一直高于樹脂層。待大孔樹脂充分析出時，以蒸餾水沖洗至均衡，有效柱高度為10cm，保持柱面光滑備用。（2）D101樹脂的預(yù)處理與再生先在大孔樹脂中加入0.5倍樹脂體積的大體積乙醇，浸泡24h后吸附膨脹完全。用2BV（體積為2倍柱）乙醇，以2BV·h-1的流速清洗樹脂層，直至流出液不潔白，混濁為止。用同樣流速清水漂洗至流出物無乙醇味為止。采用2BV5%HCL溶液在自然流速下透過樹脂層浸泡4h,再用清水漂洗至流出液中性。再在自然流速下將2BV5%NaOH溶液在樹脂層中浸泡4h后水洗至流出液中性。（3）上樣液濃度對吸附效果的影響分別制備蘆丁濃度在1mg.mL-1,2mg.mL-1,3mg.mL-1,4mg.mL-1上樣液。準確稱取1.0g預(yù)處理過的D101樹脂，放入60mL塞子瓶中，使加載樣品中蘆丁的總含量均勻。加入不同濃度的加載溶液，放入振動臺。在80r·min-1和25℃下?lián)u晃2h，然后取出吸附液并過濾。按所述方法測試蘆丁濃度并計算吸附量。（4）洗脫液中乙醇濃度對解吸效果的影響制備不同乙醇濃度的解吸溶液(解吸溶液，解吸溶液，準確稱1.0g飽和D101樹脂，置于60mL的瓶塞中，加不同乙醇配比解吸液20mL,放入搖瓶內(nèi)，在25℃下?lián)u2h,80r·min-1，濾去解吸液并按檢測解吸液蘆丁的濃度。（5）上樣流速度及體積的確定按上述方法裝柱，上樣蘆丁濃度為2mg·ml-1的樣品溶液，控制流速為1ml·min-1、2ml·min-1、3ml·min-1、4ml·min-1通過大孔樹脂柱。逐級收集流出液(5mL/管)，檢測每管中蘆丁的濃度。當蘆丁在廢水中的溶解度達到加載溶液的10%，即0.2mg·ml-1時，以泄漏點為加載終點計算加載體積。以管數(shù)為橫坐標，動態(tài)吸附濃度為縱坐標，畫出各流量的采樣曲線。式中C3為流出液中蘆丁的濃度（6）洗脫流速及洗脫體積的確定將以上飽和樹脂用高乙醇濃度解吸溶液洗脫后分別以1mL·min-1、2mL·min-1、3mL·min-1和4mL·min-1的速度控制它們向大孔樹脂柱內(nèi)流動。逐級采集流出液（5mL/管），并對各管道溶液中蘆丁濃度進行測試。將流出液蘆丁濃度達2mg.mL-1作為終點，統(tǒng)計達到洗脫終點后所得流出液體積作為動態(tài)解吸液的量。以管號作為橫坐標、流出液蘆丁濃度作為縱坐標，畫出了各個流量下洗脫曲線。2結(jié)果與討論2.1三種測定方法對比結(jié)果按照上述方法獲得了三氯化鋁比色法、硝酸鋁比色法和紫外分光光度法測定蘆丁含量的標準曲線。相關(guān)系數(shù)如圖2-1所示。三種測定方法的標準曲線均可用于待測樣品中蘆丁的分析。圖2-1標準曲線圖A用三氯化鋁顯顏色，B用硝酸鋁顯顏色，C采用紫外分光光度法。將擬定的三條標準曲線應(yīng)用于同一樣品中蘆丁的含量檢測，反復(fù)檢測3次，數(shù)據(jù)如表2～表1所示。3種方法所測相同樣品中蘆丁含量存在明顯差異。紫外分光光度法測得蘆丁的含量最多，達到84.1303mg.g-1，其次是硝酸鋁顯色法，為55.0789mg·g-1,三氯化鋁法測得的蘆丁的含量比較低，達19.2086mg.L-1。紫外分光光度法復(fù)測相同樣品中蘆丁的極差及相對標準偏差均為3種方法之首，且相對標準偏差＞2%，說明此方法比較對穩(wěn)定性較差，不宜應(yīng)用于煙葉中蘆丁含量測定。硝酸鋁比色法的結(jié)果比氯化鋁比色法高約3倍，這與周春華(2005)提出的結(jié)論一致。因此，硝酸鋁顯色法不適用于煙草中蘆丁的測定。而三氯化鋁顯色法特異性強，最接近文獻中國標HPLC法的檢測結(jié)果。因此，三氯化鋁顯色法更適合煙葉提取液中蘆丁的快速檢測。表2-1三種方法測定蘆丁含量結(jié)果的對比測定方法三氯化鋁法硝酸鋁法紫外分光光度法吸光值平均值0.39480.26200.5782吸光值極差0.00750.00620.0441蘆丁濃度/mg·mL-10.02130.03060.0467含量/mg19.208655.078984.1303相對標準偏差/%1.02041.21243.93482.2單因素分析結(jié)果（1）提取次數(shù)對蘆丁得率的影響固定液料比30mL.g-1、提取溫度50℃、超聲波作用時間10min、乙醇濃度60%左右。摘要考察不同超聲波作用時間（1,2,3,4）對廢煙葉蘆丁提取速率的影響。結(jié)果見圖2-2，蘆丁得率隨超聲次數(shù)增加呈現(xiàn)先逐漸升高而后又稍有降低的趨勢，且萃取3次得率最高。因此，提取次數(shù)以三次比較合適。圖2-2提取次數(shù)對蘆丁得率的影響（2）液料比對蘆丁得率的影響固定提取溫度50℃、超聲時間20min、超聲三次、乙醇濃度60%,考察不同液料比（10、20、30、40、50mL·g-1）對廢棄煙葉蘆丁提得到率的影響。研究表明，液料比在30mL·g-1和40mL·g-1時，提取得率較高，如圖2～3所示，但是鑒于提取溶劑量的增加會對后續(xù)過程帶來一定的難度，因此選用液料比為30mL.g-1是比較適宜的。圖2-3液料比對蘆丁得率的影響（3）超聲時間對蘆丁得率的影響固定液料比30ml·g-1，提取溫度50℃，超聲波提取3次，乙醇濃度60%。研究了不同超聲時間(6、9、12、15、18min/次)對廢煙葉中蘆丁提取率的影響。當超聲時間為6~15min/次時，蘆丁的提取率有增加的趨勢(圖2-4)，隨后隨著超聲時間的延長，提取率略有下降。因此，每15分鐘超聲一次，效果更佳。圖2-4超聲時間對蘆丁得率的影響（4）提取溫度對蘆丁得率的影響固液比為30ml·g-1、超聲時間為15min、超聲次數(shù)為3、乙醇濃度為1時?？疾觳煌崛囟龋?5,45,55,65,75℃）對廢煙葉蘆丁提取率影響規(guī)律。由圖2-5可得萃取率隨萃取溫度提高而提高，55℃附近提取得率最高，55℃以上得率降低。圖2-5提取溫度對蘆丁得率的影響（5）提取物中乙醇濃度對蘆丁產(chǎn)量的影響液料比30ml.g-1，提取溫度50℃,超聲時間15min,超聲次數(shù)3次。研究了不同乙醇濃度對廢煙葉中蘆丁萃取率的影響。從圖2-6可以看出乙醇濃度20%-40%對蘆丁的提取率增加，乙醇濃度大于40%蘆丁則逐漸降低。乙醇濃度40%時產(chǎn)率越高。圖2-6乙醇濃度對蘆丁得率的影響2.3篩選大孔樹脂的結(jié)果按前面介紹的方法進行了六次反復(fù)試驗，并對平均吸附量，吸附率，解吸量及解吸率進行了計算，其結(jié)果見表2～6。在上樣量約10mg時,D101吸附量達到最大值9.57mg,S-8吸附量9.37mg稍低,D101和AB-8吸附量均達到最小值8.47mg。吸附率的大小依次是D101＞S－8＞AB－8。添加解吸液解析大孔樹脂測得D101,S-8,AB-8的解吸量分別是8.69mg,6.03mg,7.66mg,解吸率的大小依次是:D101＞AB-8＞S-8。盡管S-8的吸附率最高，但是3種樹脂吸附量很差只有約1mg,且相差不大。然而，在解決率方面存在很大差距。D101的分辨率為94.7%，AB-8的分辨率為79.4，S-8的分辨率僅為67.6%。因此，通過D101分辨率達到94.7%，AB-8達到79.4%，而S-8只有67.6%。故采用吸附率及分離率評價表明,D101在廢棄煙葉中蘆丁分離純化方面具有良好的效果。表2-2不同樹脂對煙葉蘆丁的吸附及解吸性能樹脂型號上樣量/mg吸附量/mg吸附率/%解吸量/mg解吸率/%D10110.749.5786.38.6994.7S-810.749.3788.26.0367.6AB-810.748.4778.87.6679.42.4D101樹脂柱層析分離廢棄煙葉中蘆丁的技術(shù)條件研究（1）上樣液濃度上樣液中蘆丁濃度對于D101樹脂吸附過程的影響見圖2-7。濃度越高，蘆丁對樹脂的吸附量越小，當濃度為2mg·mL-1時，吸附效果最好，而在2mg.mL-1濃度以上吸附效果反而降低，這可能是由于隨著蘆丁濃度的升高，其它雜質(zhì)含量隨之升高并與蘆丁形成了更大的競爭而導致雜質(zhì)在樹脂上吸附增加而蘆丁吸附降低。并且在試驗中還發(fā)現(xiàn)蘆丁的濃度超過2mg.mL-1后，上樣液色澤變暗，黏稠度顯著增加，可能都會影響樹脂吸附效果。圖2-7上樣液中蘆丁濃度對樹脂吸附效果的影響（2）洗脫液中乙醇濃度溶液中蘆丁的濃度對吸附在D101樹脂上的作用如圖2-7所示。洗脫液中乙醇濃度越高，對蘆丁的脫附作用越差。當解吸液的乙醇濃度大于50%，解吸效果明顯增大。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，解吸液的蘆丁濃度增加，解吸效果逐漸增強。乙醇濃度70%時，解吸液中蘆丁的濃度越高，故使用解吸液中70%乙醇的含量最高。圖2-8洗脫液中乙醇濃度對解吸效果的影響（3）上樣流速度及體積按照上述步驟，以管數(shù)為橫坐標，動態(tài)吸附濃度為縱坐標，繪出樣品在各個流量范圍的吸附動態(tài)曲線，如圖2-9所示，對比4種流量下曲線，得出流速越大，泄漏發(fā)生的時間就越早，并且在泄漏發(fā)生后吸附率將迅速降低。以上述樣液濃度10%即0.2mg.mL-1作為泄露點，以到達泄露點為上層樣液終點得到的上層樣液體積進行計算，得到上層樣液所需時間結(jié)果如圖2~10所示：當上層樣液速度為1、2、3、4mL·min-1時，上層樣液體積分別為106mL、98mL、84mL和70mL;所需時間分別為106min、49min、28min和17.5min。流速愈慢，上樣量愈多，需要的上樣時間愈長。選用流速時要考慮上樣量太小對樹脂性能發(fā)揮不利，上樣時間太長又會使生產(chǎn)周期加長，造成效率下降加大成本。綜合考慮兩個因素，本次實驗選擇了2mL.min-1作為上樣流速和98mL的最優(yōu)上樣量。圖2-9不同上樣流速的動態(tài)吸附曲線圖2-10不同上樣流速度的上樣體積和所需時間（4）洗脫流速及洗脫體積根據(jù)前面介紹的步驟，將管號作為橫坐標、流出液蘆丁濃度作為縱坐標畫出各個流量下洗脫曲線圖2～11。從圖中可以看出流速愈慢洗脫液蘆丁濃度愈高，到達洗脫終點的管數(shù)愈少且峰型愈好（2mg.mL-1），流速愈快拖尾現(xiàn)象愈嚴重。將流出液到達洗脫終點時所使用乙醇體積作為洗脫體積并計算出洗脫所用時間的結(jié)果如圖2-12中，當洗脫流速為1,2,3,4mL.min-1時，洗脫體積約37mL,38.7mL,45mL,50mL,需要洗脫時間約37min,19.25min,15min,12.5min左右。洗脫流速較快需要較大的乙醇體積，不僅使得洗脫率下降，增加了成本而且有可能給后續(xù)的樣品處理帶來一定的難度，所以洗脫體積較小，也就是說流速較小時效果更好。但是流速太慢會使生產(chǎn)周期變長引起效率降低加大成本，所以考慮到此實驗選取2mL.min-1作為合適的洗脫流速和38.7mL乙醇體積。圖2-11不同洗脫流速的動態(tài)解吸曲線圖2-12不同洗脫流速度的洗脫體積和所需時間（5）驗證試驗根據(jù)前面介紹，冷凍干燥所得粗提取經(jīng)稱量制備成2mg.mL-1左右上樣液100mL,2mL.m-1的上樣完成后，使用20mL蒸餾水沖洗掉樹脂表面沒有吸附的雜質(zhì)，再使用約40mL的70%乙醇從樹脂床中脫附至2mL.min-1。采集洗脫液每管5mL循環(huán)利用以獲得較上樣液（4~8份）更高濃度。采用三氯化鋁顯色法測定蘆丁的含量并驗證其最佳提取富集工藝。結(jié)果表明，廢煙葉中蘆丁的含量約為4.9mg·g-1，最優(yōu)提取工藝下粗提物中蘆丁的平均含量為11.81mg·g-1,提取率95%。用大孔樹脂濃縮，蘆丁含量平均85.03mg.g-1左右，純度7.2倍左右，回收率86.8%。結(jié)論本文優(yōu)化了超聲波輔助乙醇提取廢棄煙葉蘆丁的提取工藝及大孔樹脂分離富集提取液中蘆丁的工藝。最佳提取工藝為液料比30mL·g-1，乙醇濃度33%為提取液，57℃下超聲時間20min，提取3次。最佳的分離富集工藝為采用D101型樹脂，上樣濃度2mg·mL-1，流速2mL·min-1，平均上樣量約3.18mL·cm-3；洗脫劑乙醇濃度為70%，流速2mL·min-1，洗脫劑用量平均約1.28mL·cm-3。在優(yōu)化的提取分離工藝下，采用三氯化鋁顯色法測定蘆丁含量，結(jié)果表明廢棄煙葉中蘆丁含量約為4.9mg·g-1；粗提物中蘆丁的平均含量11.81mg·g-1，經(jīng)大孔樹脂富集后平均含量85.03mg·g-1，蘆丁純度可提高7.2倍，平均回收率為86.8%?？傊?，與經(jīng)典甲醇熱回流萃取植物組織中蘆丁方法相比較，本研究對提取液中蘆丁快速測定方法進行了比較和分析。雖不如國家標準中高相液相色譜法那樣精密精確，但是該方法穩(wěn)定性好，操作簡便，比較適用于大批量樣品檢測及含量比較研究。同時超聲波輔助乙醇萃取不但操作方便，顯著縮短處理時間，而且乙醇價廉無毒，萃取效果和甲醇一樣好。與常規(guī)溶劑萃取及硅膠柱層析法相比，大孔樹脂分離富集方法操作簡便，可以反復(fù)利用，而且不需要乙酸乙酯，氯仿等有機溶劑，既環(huán)保又節(jié)省成本減少能耗。參考文獻[1]柯翠敏,李絲紅,胡建萍,謝志新.運用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鬼針草總黃酮的提取工藝[J].繼續(xù)醫(yī)學教育,2022,36(03):109-112.[2]李星,李靜.槐米中蘆丁提取工藝研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2022(03):214-216.[3]姚佳,潘利平,龍應(yīng)霞,張歡歡.響應(yīng)面法優(yōu)化槐米中蘆丁的提取工藝研究[J].生物化工,2021,7(05):54-57.[4]蔡前超,杜鴻章,曹智威,馮亞莉.槐米中蘆丁提取工藝研究[J].生物化工,2021,7(01):93-95.[5]李銳,李皎皎,張聰聰,周茜,高榮琨.不同地區(qū)的紫蘇種子中總黃酮的提取方法及其含量研究[J].激光生物學報,2021,30(01):91-96.[6]羅進,羅艷萍,張風,馮婉怡,羅汝鋒.槐米中蘆丁提取工藝優(yōu)化研究[J].現(xiàn)代食品,2020(19):93-96+105.DOI:10.16736/41-1434/ts.2020.19.030.[7]胡心茹,李甜雨,陳奕江,馬小思,袁施怡.槐米中蘆丁的含量測定及其穩(wěn)定性研究[J].海峽藥學,2020,32(08):29-32.[8]張琳,楊范莉,張祺嘉鈺,白婷,張小飛,楊新杰.不同提取方法對不同產(chǎn)地麥冬中蘆丁和麥冬多糖含量及其抗氧化活性的影響[J].西北藥學雜志,2020,35(03):317-321.[9]陳璐,耿柏林,郭祿晶,蘇星超,強力源,鄭立穎,李欠.不同產(chǎn)地槐米中蘆丁的提取及含量測定比較[J].農(nóng)業(yè)科技與信息,2020(08):58-60.DOI:10.15979/62-1057/s.2020.08.023.[10]李杰,李鐘杰,雷高明,李婼楠,尚孟文.響應(yīng)面法優(yōu)化槐米中蘆丁的溶劑熱法提取工藝[J].中國食品添加劑,