分子生物學(xué)常用技術(shù).ppt

1、分子生物學(xué)常用技術(shù),核酸的分子雜交Nucleicacidhybridization,分子雜交的原理：DNA具有變性的特點(diǎn)變性的DNA還能復(fù)性分子雜交的概念分子雜交的原理：用已知的DNA序列制成探針，來(lái)檢測(cè)末知的樣本DNA。,當(dāng)條件改變時(shí),當(dāng)條件復(fù)原時(shí),單鏈DNA被同位素標(biāo)記后制成探針,核酸分子雜交的基本過(guò)程:首先要確定檢測(cè)的目標(biāo)，即檢測(cè)的目的核酸片段，這個(gè)片段的序列必須是已知的。根據(jù)此設(shè)計(jì)一個(gè)探針（與檢測(cè)目的核酸互補(bǔ)的序列），并對(duì)其進(jìn)行合成和標(biāo)記。再通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)完成探針對(duì)目的核酸的檢測(cè)。,分子雜交的形式：液相雜交固相雜交它們之間的區(qū)別和優(yōu)劣,固相雜交的一般過(guò)程1.首先設(shè)計(jì)、合成探針。2.收集

2、標(biāo)本，并提取核酸。3.將提好的核酸樣本點(diǎn)到固相支持物上。4.封閉。5.通過(guò)變性和復(fù)性完成雜交。6.漂洗7.放射自顯影,核酸分子雜交技術(shù)的演變斑點(diǎn)雜交southernblotnorthernblot原位雜交芯片技術(shù),斑點(diǎn)雜交,southernblot,southernblot,原位雜交,染色體原位雜交,組織切片上的原位雜交,抗衰老基因klotho基因的原位雜交,芯片技術(shù),GeneChipArrayConstruction,11m,Millionsofcopiesofaspecificoligonucleotideprobe,ImageofHybridizedGeneChipArray,500,0

3、00differentcomplementaryprobes,Singlestranded,labeledtarget,Oligonucleotideprobe,GeneChipArray,HybridizedProbeCell,1.28cm,1.28cm,DNA,RNA,DNAandRNAMonitoring,Genotyping:IsitAorB?,GeneExpression:Whichgenes?Howmuch?,EukaryoticCell,Dec2002GoldenPath,Blue=STRfromCIDRpanelBlack=Gaps,Medianintermarkerdista

4、nce:4.7MbMeanintermarkerdistance:5.6MbMeangeneticgapdistance:8.9cMAverageHeterozygosity0.76,Medianintermarkerdistance:105kbMeanintermarkerdistance:210kbMeangeneticgapdistance:0.32cMAverageHeterozygosity0.37,Dec2002GoldenPath,Red=atleast1SNPper100kbBlack=Gaps,10kCoverage:Genome11,555SNPs,Medianinterm

5、arkerdistance:8.5kbMeanintermarkerdistance:23.6kbAverageHeterozygosity0.30Averageminorallelefrequency0.22,July2003NCBIbld34,Red=atleast1SNPper100kbBlack=Gapsingenomecoverage,Mapping100KCoverage:116,204SNPs,92%ofgenomewithin100kbofaSNP83%ofgenomewithin50kbofaSNP50%ofgenomewithin15kbofaSNP25%ofgenomew

6、ithin5kbofaSNP,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),Polymerasechainreaction(PCR),PCR技術(shù)的形成及發(fā)展,PCR的實(shí)現(xiàn)1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間,合成DNA的原料。,PCR示意圖,PCR的改進(jìn)與完善,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：Klenow酶不耐高溫，90會(huì)變性失活，每次循環(huán)

7、都要重新加。引物鏈延伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視,1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：耐高溫，在70下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93下反應(yīng)2

8、h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為T(mén)aqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)為PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。,PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理,模擬細(xì)胞內(nèi)DNA合成的過(guò)程利用了DNA變性、復(fù)性和能進(jìn)行雜交的特點(diǎn)，在引物存在的條件下DNA聚合酶開(kāi)始對(duì)DNA進(jìn)行體外合成。通過(guò)全自動(dòng)的熱循環(huán)儀來(lái)完成,PCR的基本原理,PCR

9、反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),模板DNA,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),第1輪結(jié)束,第2輪開(kāi)始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),第2輪結(jié)束,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn),模板DNA,第1輪擴(kuò)增,第2輪擴(kuò)增,第3輪擴(kuò)增,第4輪擴(kuò)增,第5輪擴(kuò)增,第6輪擴(kuò)增,PCR反應(yīng)的基本

10、條件,模板的制備模板是進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增的依據(jù)，它的來(lái)源于不同的材料。PCR對(duì)模板的質(zhì)量要求很高，但對(duì)它量的要求不高。制備模板的材料：新鮮材料：人或動(dòng)物的血液及組織中提?。粡纳倭坎牧希禾?、尿液、腹腔液等;法醫(yī)學(xué)的材料：血斑、精斑等；考古材料從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。提取的原理和方法：（略）,引物的設(shè)計(jì)：引物的設(shè)計(jì)首先要依據(jù)你已知的序列來(lái)設(shè)計(jì)。即你要擴(kuò)增的目的DNA片段。這些資料可以從文獻(xiàn)上查找或從互聯(lián)網(wǎng)上來(lái)檢索。實(shí)際做的過(guò)程中，引物也可借助于別人已經(jīng)發(fā)表的引物來(lái)。但從經(jīng)驗(yàn)上說(shuō)，別人公開(kāi)發(fā)表的引物常常含有一定的錯(cuò)誤。所以要進(jìn)行核查。,設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，

11、常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。,引物-3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)

12、的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。,PCR所用試劑：DNA聚合酶buffer:包括兩種，一種是含Mg+，一種是不含Mg+。dNTPs純凈水自己要準(zhǔn)備的模板DNA的制備和引物的設(shè)計(jì)與合成。,PCR的操作過(guò)程,設(shè)定一個(gè)加樣配方：標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10擴(kuò)增緩沖液5ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至50ul,加樣：?jiǎn)螛颖炯訕佣?/p>

13、樣本加樣加樣的順序PCR反應(yīng)條件的設(shè)定：預(yù)就性溫度：94，5分變性溫度：94，30秒退火溫度：需要摸條件延伸溫度：72，30秒總延伸溫度：72，15分,重復(fù)13步2530輪,目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,PCR運(yùn)行圖,PCR結(jié)果的鑒定,通過(guò)凝膠電泳的方式來(lái)進(jìn)行。,RT-PCR(reversetranscription-PCR)RTPCR的原理,RTPCR技術(shù)的應(yīng)用用于制備基因工程的目的基因片段。用于表達(dá)譜的檢測(cè)。,PCR技術(shù)的應(yīng)用,PCR的初衷是為特異性的擴(kuò)增某段DNA現(xiàn)在PCR在醫(yī)學(xué)研究中主要是用于基因診斷，

14、常用于：對(duì)遺傳病的突變基因進(jìn)行診斷對(duì)病原體的基因診斷通過(guò)PCR結(jié)合限制酶切的診斷SSCP技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的診斷RT-PCR進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增及定量表達(dá)熒光定量PCR技術(shù),PCR結(jié)合多態(tài)性分析,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析有2種情況：限制片段多態(tài)性分析(A)、(B)重復(fù)序列多態(tài)性分析(A)、(C),PCR-限制片段多態(tài)性分析,重復(fù)序列多態(tài)性分析,SSCP技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的診斷,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),電泳技術(shù),electrophoresistechnology,核酸的凝膠電泳一、基本原理1核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場(chǎng)，它們會(huì)向正電極的方向遷移。2在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決

15、于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。,3電泳環(huán)境的影響：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移速度。當(dāng)電泳緩沖液中無(wú)離子時(shí)，溶液導(dǎo)電性極小，電泳速度慢。當(dāng)電泳緩沖液中離子濃度極強(qiáng)時(shí)，則導(dǎo)電性極高，并易產(chǎn)熱。pH值也影響遷移率，溶液的pH遠(yuǎn)離樣品的等電點(diǎn)時(shí)，樣品顆粒的電離程度大，相應(yīng)的電泳速率就大。凝膠的濃度的不同對(duì)同樣大小顆粒的電泳速率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。,表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力凝膠類(lèi)型及結(jié)構(gòu)分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖50000-10000.7%瓊脂糖20000-10001.4%瓊脂糖6000-3004.0%聚丙烯酰胺1

16、000-10010.0%聚丙烯酰胺500-2520.0%聚丙烯酰50-1,4凝膠電泳的目的：可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進(jìn)行分離，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子量maker鑒定其大小。對(duì)所要的目的分子進(jìn)行純化提取。,二、瓊脂糖凝膠電泳AgaroseGelElectrophoresis瓊脂糖是從海藻中提取出的長(zhǎng)鏈狀多聚糖，當(dāng)它被加熱到90時(shí)可被溶解成半透明的液體，這時(shí)便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點(diǎn)這40-45。瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)：操作方便，并可用來(lái)鑒定和純化特定的DNA分子。,AgaroseGelElectrophoresis,-,+,1,2,4,6,8,10,12,kb,不同濃度下電泳的遷移速度,

17、用低溶點(diǎn)瓊脂糖來(lái)分離并純化DNA。瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在0.3-50kb之間，對(duì)一些分辨更小DNA分子的實(shí)驗(yàn)將無(wú)法進(jìn)行。瓊脂糖電泳結(jié)果的顯示：利用核酸與溴化乙錠吸附性強(qiáng)的特點(diǎn)，用溴化乙錠來(lái)顯色。,三、聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)電泳材料：丙烯酰胺CH2CHCNH2ON,N-亞甲雙丙烯酰胺HHCH2CHCNCH2NCHCH2O,+,Electrophoresis,兩種丙烯酰胺在促凝劑存在的條件下可以凝集成膠。PAGE的優(yōu)點(diǎn)和不足：優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，不足是操作復(fù)雜，成本高。PAGE的凝膠可用溴化乙錠染色，也可以銀染，后

18、者的分辨率高。,溴化乙錠染色,硝酸銀染色,四、SDS-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SOS-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)SDS-PAGE專(zhuān)門(mén)用于蛋白質(zhì)電泳。基本原理：在蛋白質(zhì)電泳前，先將其變性成線結(jié)構(gòu)，并使其表面都吸附上帶負(fù)電荷的活性分子-SDS。,考馬斯亮蘭染色SDS-PAGE,蛋白質(zhì)印跡技術(shù),Westernblot,Westernblot技術(shù)是借鑒了Southernblot技術(shù)的原理而設(shè)計(jì)。它也是在凝膠電泳后通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳將電泳分離物移到固相支持物上再進(jìn)行進(jìn)一步的分析。與Southernblot不同的是，它用來(lái)雜交的不是探針，而是特異性的物體

19、。,Westernblot的基本過(guò)程先通過(guò)SDS-PAGE將樣本中的蛋白質(zhì)分離通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上的樣本移到硝酸纖維膜上封閉硝酸纖維膜用一抗來(lái)特異性的識(shí)別目標(biāo)蛋白用酶標(biāo)二抗來(lái)識(shí)別一抗顯色,Westernblot流程圖,Westernblot的識(shí)別原理,轉(zhuǎn)移后的固定物,顯色后,Westernblot的應(yīng)用,DNA序列分析,(DNAsequenceanalysis),Sanger雙脫氧終止法(手工測(cè)序)基本原理：DNA在復(fù)制時(shí)，需要兩個(gè)單核苷酸之間脫去一分子水后形成磷酸二酯鍵。如果在其中加入雙脫氧的單核苷酸，將中止DAN的復(fù)制。,電泳,雙脫氧法DNA測(cè)序原理,通過(guò)自動(dòng)化的DNA測(cè)序儀來(lái)進(jìn)行測(cè)序測(cè)序的基本原理：,二、基因組的大規(guī)模的測(cè)序列,GenomeSequencing-Review,Libraries,Sequencing,Release,Assembly,Annotation,