DNA合成原理及操作PPT課件

1、.,1,DNA合成原理 及操作規(guī)范,.,2,.,3,合成原理,DNA通過固相亞磷酰胺三酯法合成：溶液中的亞磷酰胺單體通過縮合反應形成3-5磷酸二酯鍵，連接到固相載體（CPG或樹脂）上。并依次延伸，直到序列的最后一個5堿基連接上后合成結(jié)束。整個合成過程儀器自動完成，每個循環(huán)分為脫保護、活化、偶合、蓋帽（封閉）、氧化五個步驟。,.,4,第一步：脫保護（Deblocking）:用三氯乙酸（TCA）去除CPG所鏈核苷上的DMT保護基團，暴露5羥基，供下一步縮合。 第二步：活化（Activation）：單體與催化劑四唑混合進入合成柱，四唑轉(zhuǎn)移一個質(zhì)子給3亞磷酸上二異丙胺基的N原子，質(zhì)子化的氨是四唑親核進

2、攻的離去基團，二異丙酰胺被四唑取代，形成亞磷酰胺-四唑活性中間體。,.,5,第三步：偶合（Coupling）:亞磷酰胺-四唑中間體與CPG所連接的核苷酸的5羥基發(fā)生縮合反應，縮合脫掉四唑，形成延長一個堿基的核苷酸鏈。 第四步：蓋帽（Capping）:少量未反應（2%）的載體上的核苷酸鏈的5羥基會在后續(xù)的循環(huán)中參加反應，生成少一個堿基的核苷酸鏈，因此需要在反應后進行封閉。常用乙?；磻c5羥基縮合成酯鍵，一般用混合乙酸酐和N-甲基咪唑等做乙?；噭?.,6,第五步：氧化（Oxidation）:偶合反應形成的三價亞磷酸酯鍵很不穩(wěn)定，因此要用氧化劑碘的四氫呋喃溶液將三價磷氧化成穩(wěn)定的五價磷。 依此

3、步驟循環(huán)，最終得到一個全長DNA片段粗品。 用新鮮的濃氨水把粗品從載體上切割下來，采用適當?shù)募兓绞饺コ唐魏桶被摫Ｗo及氰乙基脫保護形成的鹽離子。,.,7,DNA合成作業(yè)流程,1. 接收訂單安排合成 合成部根據(jù)合成實際情況合理安排訂單，依次安排加急-測序-內(nèi)部-外部，同一客戶盡量同批次安排合成，部分長鏈、G含量高、合成量大的引物比較難合成，時間上可能會有所延緩 2. 上機合成 不同型號的合成儀合成通量和合成時間均不同，公司預定的儀器批次合成96條引物，20bp長度合成需要2-3小時。,.,8,3. 氨解脫保護 合成完畢后取出載體進行切割并且脫保護。一般40bp以內(nèi)至少需要2小時，鏈越長需要

4、時間越長。 4. 純化: 目前慣用的純化方式主要有4種： OPC純化、 PAGE 純化、脫鹽純化、 HPLC純化,.,9,4.1 OPC純化 利用OPC柱芯對DMT寡核苷酸特殊的親和力，將不帶DMT的短片段用低濃度的有機溶劑洗脫，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml的20%乙腈洗脫。 優(yōu)點：方便，快捷，純化后純度可達90%，能滿足普通PCR反應。 缺點：純化成功與否取決于粗品DNA的純度，合成不好的樣品可能OPC純化后也不純，并且隨著堿基數(shù)增多，純化效果降低；由于在純化過程中接觸到酸，引物容易降解。,.,10,4.2 PAGE 純化 利用DNA不同片段在膠中遷移率不同而分離，大片段電荷

5、多，分子大，遷移的速度慢。等目的片段與N-片段分開后切下目的片段，80孵育2小時后脫鹽。 優(yōu)點：分離效果好，純度能達到98-99%，可以滿足測序、克隆等用。引物也很穩(wěn)定。 缺點：比較費時費力，樣品損失很大。,.,11,4.3 脫鹽純化 如果偶合效率高，合成效果好，粗品本身沒有什么短片段，可以直接脫鹽。 優(yōu)點：省去PAGE電泳的麻煩，樣品回收率高。 缺點：不能有效去短片段，前提一定要合成效果很好才選用此方法。,.,12,4.4 HPLC純化 HPLC吸附基質(zhì)分反相柱和離子柱： RP(反相柱）是根據(jù)疏水性的差別來分離的：疏水性更強的長片段比短片段在柱內(nèi)保留的時間更長。 離子柱是根據(jù)不同長度的寡核苷

6、酸帶有不同的凈電荷，通過緩慢增加流動相的離子強度將n-片段先洗脫。 優(yōu)點：純化效果好，純度可達99%以上，特別是對標記引物，特殊探針特別有用。 缺點：不能批次生產(chǎn)，比較費時，有時樣品接收不好也不能有效分離。,.,13,5. 樣品定量分裝 樣品純化后洗脫在1ml的20%乙腈溶液里，260紫外波長下測值，根據(jù)客戶要求分裝，一般所有合成公司基本都會按1.2-1.5倍放大給量。分裝的樣品干燥，經(jīng)PAGE抽樣檢測合格后交給市場。,.,14,合成時效：批次引物（按24條計算）在24小時之內(nèi)可以出貨 通常合成一批20bp左右的引物： OPC純化：12小時之內(nèi) 合成2-3小時 氨解2小時 OPC純化（一批24

7、條）1小時定量分裝1小時 抽干1-2小時 抽檢2小時 PAGE純化：16-19小時 合成2-3小時 氨解2小時 抽干2-3小時 電泳切膠2-3小時 泡膠2小時 脫鹽0.5小時 定量分裝1小時 抽干2-3小時 抽檢2小時 脫鹽純化：12-15小時 合成2-3小時 氨解2小時 抽干2-3小時 脫鹽0.5小時 定量分裝1小時 抽干2-3小時 抽檢2小時,.,15,DNA合成中堿基缺失或錯誤原因分析,一般客戶提出異議時，我們首先給客戶重新合成，然后再分析原因。 從合成機理上分析就可以很清楚的表明：人為的因素不可能造成堿基缺失或個別的堿基錯誤。如果說某一個堿基由于種種原因(如瓶中溶液沒有了，或管道堵塞)

8、，未加入到正在延伸的Oligo上，那么下一個反應Capping將會把Oligo封死，使整個oligo合成立即中止 。造成的原因可能是： 1、Taq酶的原因。因為在PCR擴增時引物也被擴增,就可能出現(xiàn)錯誤 ， 2、化學原因 。在合成過程中，如果本公司提供的DNA合成報告單是正確的，表示合成是成功的 ?；瘜W合成的DNA片段要比天然的DNA片段有更多的堿基突變概率。但其真正的化學機理還不太清楚，但可以肯定的是要保證100不發(fā)生錯誤是不可能的。 解決的辦法： 1、采用高保真的 Taq酶 2、重新挑克隆 3、重合引物,.,16,DNA損傷,一、堿基脫落形成AP位點 熱和酸等都可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核

9、糖磷酸骨架上脫落，形成AP位點（Apurinic orApyrimidinic site ）。 烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點。 二、堿基的改變 物理因素：電離輻射可引起其它物質(zhì)產(chǎn)生自由基，從而引起堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。 化學因素 a. 烷化劑 硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）等烷化劑可將烷基加到嘌呤或嘧啶的N或O上使堿基烷基化。鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，形成m7G和m3A烷基化的嘌呤堿基，導致復制時堿基錯配。例如鳥嘌呤N7被烷化后會與T配對，結(jié)果會使G-C轉(zhuǎn)變成A-T。 b. 堿基類似物 5-溴尿

10、嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。它們的結(jié)構(gòu)與堿基相似，進入細胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復制合成。如5-BU與T結(jié)構(gòu)相似，在酮式結(jié)構(gòu)時與A配對；它更易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復制時導致A-T轉(zhuǎn)換為G-C。,.,17,c. 黃曲霉素 黃曲霉素B、1,2-乙酰-氨基芴、苯并芘、吖啶等可插入堿基序列，引起移碼。 d. 硝酸鹽 亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過復制就可使DNA上的G-C變成A-T對。 堿基的自發(fā)改變和損傷 a. 堿基的異構(gòu)互變 4種堿基各自的異構(gòu)體間都可自發(fā)地互變（烯醇式與酮式間的互變），這會使堿基間發(fā)生錯配，使A-C、

11、T-G等。 b. 堿基的脫氨基作用 堿基的環(huán)外NH2有時會自發(fā)脫落，使CU、A次黃嘌呤（I）、G黃嘌呤（X）等，DNA復制時，U-A、I-X、I-C配對，導致子代DNA序列錯誤。 5-甲基胞嘧啶脫氨基產(chǎn)生T（引起C-GT-A的變化），而C脫氨基產(chǎn)生U（它通常被移出或被C代替）。 氧自由基傷害 細胞代謝副產(chǎn)物O2-、H2O2等會造成堿基損傷，產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，引起堿基配對錯誤。,.,18,三、 堿基插入或缺失 吖啶類分子帶正電呈扁平狀，易于嵌入DNA堿基平面間，導致在復制或重組過程中缺失或插入一個堿基。 DNA聚合酶在復制過程中發(fā)生滑動，尤其在連續(xù)幾個相同堿基的區(qū)段產(chǎn)生1個或幾個堿基的缺失或插入。聚合酶在模板鏈上滑動易于造成缺失，在生長鏈上滑動易于造成插入。 插入或缺失會導致讀碼框改變。,.,19,四、 嘧啶二聚體 DNA受到紫外線照射時，使DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體。 相鄰2個T；