色譜定量方法

1、色譜定量方法一、歸一化法由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號，得到相應的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。(7.34)若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。(7.35) 歸一化法的優(yōu)點是：簡便、準確、定量結果與進樣量重復性無關(在色譜柱不超載的范圍內(nèi))、操作條件略有變化時對結果影響較小。缺點是：必須所有組分在一個分析周期內(nèi)都流出色譜柱，而且檢測器對它們都產(chǎn)生信號。不適于微量雜質(zhì)的含量測定。二、外標法用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測

2、組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。 外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：WA(W)(A)(7.3

3、6)式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰面積。(W)及(A)分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。三、內(nèi)標法選擇樣品中不含有的純物質(zhì)作為對照物質(zhì)加入待測樣品溶液中，以待測組分和對照物質(zhì)的響應信號對比，測定待測組分含量的方法稱為內(nèi)標法?！皟?nèi)標”的由來是因為標準(對照)物質(zhì)加入到樣品中，有別于外標法。該對照物質(zhì)稱為內(nèi)標物。在一個分

4、析周期內(nèi)不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分)，或檢測器不能對每個組分都產(chǎn)生信號，或只需測定混合物中某幾個組分的含量時，可采用內(nèi)標法。準確稱量W克樣品，再準確稱量W克內(nèi)標物，加入至樣品中，混勻，進樣。測量待測組分i的峰面積A及內(nèi)標物的峰面積A，則i組分在W克樣品中所含的重量W，與內(nèi)標物的重量W，有下述關系：(7.37)待測組分i在樣品中的百分含量C為：(7.38)對內(nèi)標物的要求；內(nèi)標物是原樣品中不含有的組分，否則會使峰重疊而無法準確測量內(nèi)標物的峰面積；內(nèi)標物的保留時間應與待測組分相近，但彼此能完全分離(R1.5)；內(nèi)標物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)。內(nèi)標法的優(yōu)點是：在進樣量不超限(色譜柱不

5、超載)的范圍內(nèi)，定量結果與進樣量的重復性無關。只要被測組分及內(nèi)標物出峰，且分離度合乎要求，就可定量，與其他組分是否出峰無關。很適用于測定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量。由于雜質(zhì)(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊，無法用歸一化法測定含量，用內(nèi)標法則很方便。加一個與雜質(zhì)量相當?shù)膬?nèi)標物。加大進樣量突出雜質(zhì)峰，測定雜質(zhì)峰與內(nèi)標峰面積之比，即可求出雜質(zhì)含量。但樣品配制比較麻煩和內(nèi)標物不易找尋是其缺點。一、內(nèi)標法 什么叫內(nèi)標法?怎樣選擇內(nèi)標物? 內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結果產(chǎn)生的影響，以提高分析結果的準確度。

6、內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術。使用內(nèi)標法時，在樣品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標物應當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(zhì)(如化學結構、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)

7、情況下，分析人員可能比較關心化臺物在一個復雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。 在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的比值? 影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。 由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復樣品時出現(xiàn)。 化學方面的因素包括： 1、內(nèi)標物在樣品里混合不好； 2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應， 3、內(nèi)標物純度可變等。 對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上

8、常見的一些問題(如滲漏)對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應著重檢查積分裝置和設置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定， 在制作內(nèi)標標準曲線時應注意什么? 在用內(nèi)標法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做

9、重量比和面積比的關系曲線，此曲線即為標準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應盡可能與制作標準曲線時所用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標法定量。 二、外標法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲

10、線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。 外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量： WA(W)(A) 式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰面積。(W)及 (A)分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。 外標法 e