結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷分析.ppt

1、結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷，主要內(nèi)容，結(jié)核病分子藥物敏感性，4，1。結(jié)核病疫情，全球結(jié)核病疫情迅速惡化，人口大規(guī)模流動(dòng)，結(jié)核病并發(fā)艾滋病感染日益嚴(yán)重，中國是僅次于印度的世界第二大結(jié)核病國家，結(jié)核病感染率為44.5%，每年新增活動(dòng)性肺結(jié)核患者130萬人，死亡13萬人。在2011年世界衛(wèi)生組織結(jié)核病控制報(bào)告中，中國是世界上耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)的27個(gè)國家之一。2013年，世界衛(wèi)生組織宣布全球出現(xiàn)耐多藥結(jié)核病緊急情況，世界上的結(jié)核病患者在接受治療前已經(jīng)感染了他人！早期快速診斷和治療已成為制約結(jié)核病控制的關(guān)鍵：不超過50%的患者有細(xì)菌學(xué)診斷依據(jù)，這是當(dāng)前結(jié)核病研究的重點(diǎn)，新的抗結(jié)核藥物(50%)，新的快速診斷技術(shù)(

2、40%)，新的結(jié)核病疫苗(10%)，7/45，結(jié)核病診斷方法的最新研究，JID 2012:205(補(bǔ)編2)由德國醫(yī)生科赫在1882年發(fā)現(xiàn)。結(jié)核分枝桿菌屬于菌核病、放線菌、分枝桿菌科和分枝桿菌。分枝桿菌復(fù)合體包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，人結(jié)核分枝桿菌是人類的主要致病菌。2020/6/24，GDTB，8，結(jié)核分枝桿菌，主要生物學(xué)特性有：1。細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)；2.由它引起的疾病是慢性的，并伴有肉芽腫；3.抗酸染色陽性；生長特征是：生長緩慢；在人工培養(yǎng)基中繁殖第一代大約需要15 20小時(shí)；未感染的老鼠會(huì)被靜脈感染。實(shí)驗(yàn)室檢查方法的歷史，19世紀(jì)80年代結(jié)核桿菌的發(fā)現(xiàn)，1900年代澤赫爾-尼森染色

3、法，1900年代曼圖試驗(yàn)(TST用結(jié)核菌素)，1920年代彼得朗納尼培養(yǎng)基純化蛋白衍生物(PPD)，1930年代列文斯坦-詹森培養(yǎng)基，1940年代杜博斯瓊脂，1950年代小川奈那培養(yǎng)基，1950年代中溪7h9，1990年代納at，2000年代埃利斯波特，2010年代LPA，2020年代基因?qū)＜遥拷Y(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷，細(xì)菌學(xué)，涂片：低敏感性，傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：長時(shí)間，23個(gè)月，分子生物學(xué)，結(jié)核-脫氧核糖核酸結(jié)核-核糖核酸，血清/免疫學(xué)，IGRA:有望取代TST，但無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染，血清學(xué)：抗原純度和特異性差，液體培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)：細(xì)菌學(xué)診斷、羅氏培養(yǎng)/藥敏試驗(yàn)、目前我國最常用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)

4、室診斷技術(shù)、涂片干燥和固定、初染、脫色、復(fù)染、顯微鏡檢查、登記/報(bào)告、顯微鏡檢查等。光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、顯微鏡下形態(tài)染色、顯微鏡下熒光染色、發(fā)光二極管熒光顯微鏡、發(fā)光二極管熒光顯微鏡、超亮發(fā)光二極管價(jià)格低廉，價(jià)格接近現(xiàn)有光學(xué)顯微鏡，使用壽命長(約15-20，000小時(shí))，省電，可用電池電源可靠性更好，無需空調(diào)設(shè)備，無需暗室，診斷性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡，減少了操作人員的工作量。 普通熒光顯微鏡和發(fā)光二極管熒光顯微鏡的性能比較(不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果進(jìn)行匯總和平均)、培養(yǎng)/藥物敏感性試驗(yàn)、陰性培養(yǎng)、陽性培養(yǎng)、BACTEC MGIT 960/320指示系統(tǒng)，MGIT /3D公司生產(chǎn)的液體培養(yǎng)基比固體培

5、養(yǎng)快(平均10-12天，而不是20-24天)，比固體培養(yǎng)基更靈敏，可以自動(dòng)解釋。 或者使用標(biāo)準(zhǔn)指示管和操作手冊進(jìn)行解釋也加快了藥物敏感性試驗(yàn)的速度。NaOH氫氧化鈉用于痰治療的局限性和常見菌群的離心污染是非常常見的。檢測非結(jié)核分枝桿菌(通常不致病)比固體培養(yǎng)更常見。在診斷前鑒定所有陽性培養(yǎng)物比固體培養(yǎng)基更昂貴。血清學(xué)診斷，其技術(shù)優(yōu)勢：是疾病早期診斷的理想方法。結(jié)果表明，血清學(xué)診斷的主要方法有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)、免疫印跡法等。世衛(wèi)組織評估了來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品。結(jié)果表明，與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒的靈敏度為1%60%，特異性為53 99。原因：由于檢測方法、試劑、抗原

6、和抗體不同，檢測結(jié)果差異較大，缺乏可比性。世衛(wèi)組織認(rèn)為，現(xiàn)有血清學(xué)診斷試劑的敏感性和特異性需要進(jìn)一步提高，不建議在臨床實(shí)踐中將其用作快速診斷方法。1世界衛(wèi)生組織。診斷評估系列第2:號(hào)，基于實(shí)驗(yàn)室對19種市售結(jié)核病快速診斷試驗(yàn)的評估。2008年，世界衛(wèi)生組織對結(jié)核病抗體的評估。2011年，世衛(wèi)組織正式宣布：由于目前市售的血清學(xué)試劑在結(jié)核病檢測中存在較大差異，且假陽性和假陰性的檢測結(jié)果非常高，不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核分枝桿菌1號(hào)的診斷實(shí)驗(yàn)。1世衛(wèi)組織結(jié)核病診斷商業(yè)血清診斷試驗(yàn)http:/whqlibdoc . who . int/publications/2011/9789241502054

7、_ eng.pdf不能早期診斷！容易漏診和誤診！根據(jù)血清學(xué)試驗(yàn)的評價(jià)，結(jié)核病感染者體內(nèi)存在特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，當(dāng)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次被結(jié)核病抗原刺激時(shí)，會(huì)分泌多種細(xì)胞因子(IFN-)。因此，效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的檢測可用于結(jié)核病或潛伏性結(jié)核病感染的診斷。由于其存活時(shí)間短和特異性強(qiáng)，效應(yīng)性T細(xì)胞可用作生物體是否被感染的指標(biāo)，而與臨床癥狀無關(guān)。目前，美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭和日本等20多個(gè)國家已將基于IGRA的產(chǎn)品寫入結(jié)核病診斷和治療指南。目前，在進(jìn)口IGRA使用的商業(yè)試劑有兩種：1)澳大利亞Cellestis公司生產(chǎn)的試管定量結(jié)核金(QFT-吉特)，2) T-SPOT。結(jié)核

8、，蛋白質(zhì)水平分子診斷，英國牛津免疫技術(shù)公司：-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)，-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)，-干擾素陰性，-干擾素陽性，斑點(diǎn)試驗(yàn)。結(jié)核病原則。結(jié)核病采用專利特異性抗原(ESAT-6/CFP-10)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核病有效的T淋巴細(xì)胞，從而判斷受試者目前是否感染了結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌特異性抗原：早期分泌抗原Rar Get 6 (ESAT-6)，培養(yǎng)過濾蛋白10 (CFP 10)，結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)相同操縱子編碼的蛋白質(zhì)，所有卡介苗都失去基因序列，大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌沒有RD1區(qū)。ESAT-6和CFP-10抗原，結(jié)核分枝桿菌

9、特異性抗原，蘇塞克斯，海，堪薩斯州，戈登，牛，非洲，斑點(diǎn)。結(jié)核病臨床表現(xiàn)指標(biāo)中，特異性僅對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物敏感。與大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗無交叉反應(yīng)。美國食品和藥物管理局?jǐn)?shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)。國內(nèi)臨床資料：特異性94.1%(478/508)。敏感性基本上不受低免疫/抑制的影響。肺結(jié)核患者的檢出率很高。美國食品和藥物管理局?jǐn)?shù)據(jù)：敏感性95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：敏感性95.3%(624/655)，敏感性，特異性，斑點(diǎn)試驗(yàn)。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)步驟，采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，用BD CPT管或菲科爾提取物、結(jié)核病特異性抗原(ESAT-6/CFP 10)刺激結(jié)核病特異性效應(yīng)t

10、淋巴細(xì)胞分泌-干擾素，效應(yīng)t淋巴細(xì)胞分泌的-干擾素與預(yù)先用膜板包被的抗-干擾素抗體結(jié)合，固定在細(xì)胞周圍，一點(diǎn)=一個(gè)效應(yīng)t細(xì)胞，加入顯色液，觀察結(jié)果，孵育過夜，洗滌平板，加入酶標(biāo)二抗，實(shí)驗(yàn)效果圖， 檢測特異性的提高有助于區(qū)分臨床上由卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床上無效藥物檢測靈敏度的提高，有利于臨床上結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療，避免疾病的傳播和擴(kuò)散，并能在48小時(shí)內(nèi)快速產(chǎn)生結(jié)果。 方法學(xué)的局限性不能區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染，不能提示臨床患者的病理變化。需要結(jié)合臨床判斷。目前，無法根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)判斷患者是活動(dòng)性肺結(jié)核還是隱性感染費(fèi)用昂貴(800元/次)。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果和陰性結(jié)果的解釋

11、表明，患者體內(nèi)沒有結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：不同感染階段；少數(shù)免疫系統(tǒng)功能障礙/疾病；實(shí)驗(yàn)操作異常。陽性結(jié)果表明，患者體內(nèi)存在結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T細(xì)胞，患者體內(nèi)存在結(jié)核感染。然而，是否為活動(dòng)性肺結(jié)核應(yīng)結(jié)合臨床癥狀和其他檢測指標(biāo)進(jìn)行綜合判斷。假陽性結(jié)果：當(dāng)四種環(huán)境分枝桿菌感染時(shí)：堪薩斯分枝桿菌、蘇氏分枝桿菌、海洋分枝桿菌、戈登分枝桿菌，它們是各國潛伏感染風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查指南，15個(gè)多中心研究(樣本量為26 680)顯示，在4年隨訪期間，陽性個(gè)體的發(fā)病率為448例/1000人/年。2011年9月的研究結(jié)果表明，IGRA陰性兒童(小于5歲)不能排除結(jié)核病。感染。迪斯。J.30，81

12、7818，2011)。兒童結(jié)核病治療仍然逃避科學(xué)自然醫(yī)學(xué)卷：17，第：116011頁2011年10月。結(jié)核DNA檢測：1。它能穩(wěn)定地檢測10個(gè)拷貝的結(jié)核分枝桿菌核酸，靈敏度高，特異性強(qiáng)。2.結(jié)核病的早期、快速和準(zhǔn)確診斷。痰、肺和支氣管灌洗液結(jié)核血播散性結(jié)核和各種器官腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核宮頸拭子和尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核3。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率明顯高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。4.結(jié)核分支桿菌DNA濃度可用于判斷療效：痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌數(shù)量逐漸減少，結(jié)核分支桿菌DNA拷貝數(shù)逐漸減少。根據(jù)病原體DNA濃度，為藥物治療和療效觀察提供參考。分子生物學(xué)診斷、實(shí)時(shí)熒光定量聚

13、合酶鏈反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的特點(diǎn)是針對目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了4個(gè)特異性引物，核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以用鏈置換DNA聚合酶在63-65保溫30-60分鐘完成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)，2小時(shí)全過程，目視檢查過程，檢查方法描述，結(jié)果判斷，在陰性對照反應(yīng)管的液體顏色為橙色，陽性對照反應(yīng)管的液體顏色為綠色的情況下：如果待測樣品的反應(yīng)管的液體顏色為綠色，可以報(bào)告樣品的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果為陽性；如果待測樣品反應(yīng)管中的液體顏色為橙色，則可以報(bào)告該樣品的結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果為陰性；如果陰性和陽性對照反應(yīng)管的結(jié)果與上述條件不一致，則測試結(jié)果無效，應(yīng)重新測試。核糖核酸作為臨床分子診斷靶點(diǎn)的優(yōu)勢：核糖核

14、酸拷貝數(shù)脫氧核糖核酸拷貝數(shù)更具臨床意義。強(qiáng)毒病原體核糖核酸轉(zhuǎn)錄活性核糖核酸遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于穩(wěn)定病原體死亡的脫氧核糖核酸，核糖核酸迅速降解。1.交叉污染更少。2.更好的恢復(fù)指數(shù)，結(jié)核核糖核酸，衛(wèi)星技術(shù)原理和操作過程。4.結(jié)核病的分子藥物敏感性。HAIN技術(shù)、脫氧核糖核酸條帶、t-spot、xpert MTB/Rif、脫氧核糖核酸微陣列、探針熔解曲線技術(shù)、原理：利用線性探針技術(shù)(LiPA)，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特定探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。試驗(yàn)標(biāo)本：痰涂片陽性標(biāo)本/結(jié)核桿菌陽性標(biāo)本，固體或液體培養(yǎng)菌株， Hain技術(shù)，GT-Blot 48自動(dòng)雜交儀，所需設(shè)備：GTQ聚合酶鏈反應(yīng)-96擴(kuò)增儀，Mikro 220離心機(jī)，恒溫器，超聲波振蕩器，TARGET，MTBDRplus法，原理：rpoB、katG和inhA的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增檢測，rpoB野生型探針： WT1-WT8 rpoB耐藥突變探針：mut1-:d516v，h526y，h526d 使用NaOH氫氧化鈉處理痰液樣品進(jìn)行DNA提取，2)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，3)雜交擴(kuò)增產(chǎn)物與固化在膜上的特異性探針的雜交，4)結(jié)果解釋，mtbdrplus反應(yīng)帶(演