微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

1、專題2 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,一、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),（一）培養(yǎng)基,人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱,培養(yǎng)基,一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機(jī)鹽和水等（具體見教材15頁“100mL牛肉蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成”）。,培養(yǎng)基的基本成分,培養(yǎng)基的種類,（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等。 （2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 （3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。,（二）無菌技術(shù),無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。,獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵

2、，無菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。,消毒,無菌技術(shù)的種類,滅菌,使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。,對實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒； 將培養(yǎng)皿、接種用具進(jìn)行滅菌； 接種的過程要在酒精燈附近進(jìn)行。,使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(1)消毒的方法：,1.灼燒滅菌：接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分

3、燃燒層中進(jìn)行灼燒滅菌（如教材16頁圖2-2所示）。,（2）常用的滅菌方法,2.干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在160170OC中加熱12h即可。,3.高壓蒸汽滅菌：將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)（見教材16頁圖2-4）煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa，溫度到121OC后，維持1530min即可。,二、實(shí) 驗(yàn) 操 作,（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基,1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方,2.稱量 按比例稱取各種物質(zhì)，注意事項(xiàng)：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。,3.溶

4、化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加蒸餾水定溶至100mL。,4.滅菌(先調(diào)PH)將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），放到高壓鍋內(nèi)滅菌；培養(yǎng)皿（用幾層報(bào)紙包好）放入干熱滅菌箱內(nèi)滅菌。,5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時倒平板（如教材17圖示）。,倒平板操作的討論,1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時倒平板。用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？,用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。,通

5、過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？,平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,（二）純化大腸桿菌,微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。,1.平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表

6、面（操作如教材18頁圖示）。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。,操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？ 3

7、.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。,2.稀釋涂布平板法 將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。 稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。,系列稀釋操作,101,102,103,104,105,106,(1

8、)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號。,(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。,(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟2，直至到第六支試管。,涂布平板操作,(1)將涂布器浸在盛有70的酒精的燒杯中。,(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。,(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻810s。,(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。,涂布平板操作討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？,應(yīng)從操作的各個細(xì)節(jié)保證“

9、無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。,三、結(jié)果分析與評價,1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？,2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似？,未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。,如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。,3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？,4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。,培養(yǎng)12 h與2

10、4 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。,無菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過程中受到了污染。,四、課題延伸菌種的保存,1.試管低溫臨時保存 將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔36個月要重新接種培養(yǎng)后再保存）。,2.甘油管長期保存 在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高壓滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，充分混合后，置于20OC的冷凍箱中保存。,土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),（一） 篩 選 菌 株,原理 人為提供有利于目的菌株的條件（包括營養(yǎng)

11、、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。 在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。,1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？,碳源是葡萄糖，氮源是尿素。,2.分析該配方的培養(yǎng)基對微生物是否具有篩選作用？如果有，又是如何進(jìn)行篩選的？,能分解尿素的細(xì)菌的篩選,有篩選作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的細(xì)菌才能生長。,（二） 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,原理 運(yùn)用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)。 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活

12、菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30 300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。,顯微鏡直接計(jì)數(shù),濾膜法,（三） 設(shè) 置 對 照,A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或培養(yǎng)基混有其它氮源。究竟是哪個原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以接種其它菌種，看是否有菌落的出現(xiàn)，驗(yàn)證培養(yǎng)基是否混有其它氮源。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。 所以，在實(shí)驗(yàn)中一般都應(yīng)設(shè)置對照組，使實(shí)驗(yàn)更有說服力。,閱讀教

13、材2223頁“（三）設(shè)置對照”一段，并討論教材中提出的問題。,1.實(shí)驗(yàn)名稱,土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模裕?3.材料用具（略）,4.操作步驟,從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去（鏟已經(jīng)過消毒處理）表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先滅菌過的信封中。,（1）土壤取樣,一、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),將菌液稀釋（見教材23頁“樣品稀釋流程示意圖”）。稀釋倍數(shù)為 101 106。每個稀釋度均用3個選擇培養(yǎng)基。,（2）樣品稀釋涂布,（3）微生物的培養(yǎng)與觀察,將涂布好的培養(yǎng)皿放在30溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，會有不同的菌落產(chǎn)生，做好記錄。,（4）細(xì)菌的計(jì)數(shù),選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行

14、計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,二、結(jié)果分析與評價,1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,2.樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,3.重復(fù)組的結(jié)果是否一致,如果各位同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則需要從各項(xiàng)操作過程中去分析、尋找可能

15、的原因。,三、課 題 延 伸,能分解尿素的細(xì)菌的鑒定,鑒定的原理： 細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基的pH升高。 鑒定方法： 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，利用此培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。,分解纖維素的微生物的分離,（一）纖維素與纖維素酶,纖維素：一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，廣泛地存在于植物的根、莖、葉等器官中。,纖維素酶：由微生物分泌的一種復(fù)合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它們的協(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。,剛果紅染色法,剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。,（二）纖維素分解菌的篩選,

16、用加入剛果紅的纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時，如果培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈時，可說明該菌落是纖維素分解菌，因?yàn)樗褜⒈粍?果紅 染成紅色的纖維素分解了。,一、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì),請你根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案。,土壤中纖維素分解菌的分離,1.土樣采集 ：土樣采集的方法與本專題課題 2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個月左右也會有能分解纖維素的微生物生長。,二、實(shí) 驗(yàn) 案 例,2.選擇培養(yǎng) ： 選擇培養(yǎng)的

17、操作：稱取土樣20 g，在無菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 下振蕩培養(yǎng)12 d，至培養(yǎng)基變混濁，重復(fù)上述方法再培養(yǎng)一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。,目的：增加纖維素分解菌的濃度,？,閱讀與思考,閱讀教材2829頁“資料一”“資料三”，并思考相關(guān)問題。,問題一：是液體培養(yǎng)基，因?yàn)闆]有添加瓊脂。,問題二：具有篩選作用，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的碳源是纖維素，該培養(yǎng)基只有能分泌纖維素酶的纖維素分解菌才能生長。,問題三：用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照，或者將纖維素粉換成葡萄糖；選擇培養(yǎng)基具有篩選、純化微生物的作用。,3.剛果紅染色法分離：常用的剛果紅染色法有兩種，一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)與不足,顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用,操作繁瑣 剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜,操作簡便不存在菌落混雜問題,1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈 2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。,四、結(jié)果分析與評價,1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖