基因工程藥物的質(zhì)量控制

1、.,第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制,是利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，產(chǎn)物的分子量較大，并有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，還參與生理功能的調(diào)節(jié)，用量極微，任何質(zhì)和量的偏差都可貽誤病情造成嚴(yán)重危害。,.,宿主細(xì)胞中表達(dá)的外源基因，在轉(zhuǎn)錄翻譯精制工藝放大過程中都可能發(fā)生變化，故從原料以及制備全過程都必須嚴(yán)格控制條件和鑒定質(zhì)量。,.,一、 原材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。,.,根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下 特性： 明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜 和核苷酸序列予以確證；,.,應(yīng)提供表達(dá)載體的名稱

2、、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復(fù)制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)記物； 應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性；,.,須闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性； 提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。,.,二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制,在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定； 在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變； 在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定； 始終能排除外源微生物污染。,.,生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子

3、批不含有致癌因子，無細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫。,.,原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來源、方式、保存及預(yù)計使用期，保存與復(fù)蘇時宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。,.,對生產(chǎn)種子，應(yīng)詳細(xì)敘述細(xì)胞生長與產(chǎn)品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培養(yǎng)生產(chǎn)濃度與產(chǎn)量恒定性數(shù)據(jù)，依據(jù)宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)穩(wěn)定性，確定最高允許傳種代數(shù)；,.,在培養(yǎng)過程中，應(yīng)測定被表達(dá)基因分子的完整性及宿主細(xì)胞長期培養(yǎng)后的基因型特征；依宿主細(xì)胞-載體穩(wěn)定性與產(chǎn)品恒定性，規(guī)定持續(xù)培養(yǎng)時間，并定期評價細(xì)胞系統(tǒng)和產(chǎn)品。,.,培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細(xì)胞-載體系統(tǒng)的特性，如質(zhì)?？?/p>

4、貝數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。,.,三、純化工藝過程的質(zhì)量控制,產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。,.,在精制過程中能清除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學(xué)物質(zhì)，并有檢測方法。,.,四、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制,基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求:產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。它需要利用生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科的理論與技術(shù)所建立的鑒定方法。,.,產(chǎn)品的鑒別 常用的鑒定方法: 電泳方法: SDS-PA

5、GE、等電聚焦、免疫電泳 免疫學(xué)方法: 放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫(ELISA) 受體結(jié)合試驗 高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分 析、圓二色譜、核磁共振,., 肽圖分析,肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì),對生成的肽段進(jìn)行分離分析。它是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏高效是對基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評價和驗證的首選方法。常用HPLC、毛細(xì)管電泳。,., 氨基酸成分分析 50個氨基酸較理想 部分氨基酸序列分析 N端15個氨基酸可作為重 組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒 定指標(biāo)。,., 重組蛋白質(zhì)濃度測定和相對分子量的測定 蛋白質(zhì)濃度測定方法有:福林-酚法、雙縮

6、脲法 蛋白相對分子量的測定:凝膠過濾法、SD-SPAGE法,., 蛋白質(zhì)二硫鍵分析 測定方法有: 對氯汞苯甲酸法等 5，5-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法,., 純度分析 蛋白質(zhì)含量測定 SDS-PAGE、等電聚焦、各種HPLC、 毛細(xì)管電泳 雜質(zhì) 蛋白類雜質(zhì) 殘留宿主細(xì)胞蛋白 采用免疫分析的方法 非蛋白類雜質(zhì),.,非蛋白類雜質(zhì) 非蛋白類雜質(zhì)主要有: 病毒、細(xì)菌等微生物、熱原、 內(nèi)毒素、致敏源及DNA。,.,常用檢測方法： 雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法 內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法 宿主細(xì)胞蛋白 免疫分析、SDS-PAGE、CE 其它蛋白雜質(zhì) 免疫分析、SDS-PAGE、 HPLC、CE 殘余DNA

7、 DNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合 蛋白變異 肽譜、HPLC、 IEF、 CE 甲酰蛋氨酸 肽譜、HPLC、 IEF、 CE 蛋氨酸氧化 肽譜、HPLC、 質(zhì)譜、氨基酸分析 產(chǎn)物變性或聚和脫氨基 SDS-PAGE、IEF、HPLC、 CE、質(zhì)譜、 凝膠過濾,.,雜質(zhì)和污染物 檢 測 方 法 單克隆抗體 SDS-PAGE、免疫分析 氨基酸取代 氨基酸分析、肽譜、質(zhì) 譜、CE 微生物 微生物學(xué)檢查 支原體 微生物學(xué)檢查 病毒 微生物學(xué)檢查,.,生物學(xué)活性測定 需通過動物體內(nèi)試驗和通過細(xì)胞培養(yǎng) 進(jìn)行體外效價測定。 穩(wěn)定性考查 是藥品有效性安全性的重要指標(biāo)，是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。 產(chǎn)品一致

8、性的保證,.,五、產(chǎn)品的保存 液態(tài)保存 低溫保存 在穩(wěn)定的下保存 高濃度保存 加保護(hù)劑保存 固態(tài)保存,.,第十節(jié)基因工程藥物制造實例,干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個類型。型干擾素在分為1b 2a 2b等亞型。 一、基因工程菌的組建 誘生的白細(xì)胞 提取全RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒加上dA或dC,.,第十節(jié)

9、基因工程藥物制造實例,干擾素（interferon，IFN）是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為、等4個類型。型干擾素在分為1b 2a 2b等亞型。,.,一、基因工程菌的組建 誘生的白細(xì)胞 提取全RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒加上dA或dC,.,退火獲的雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴增雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對氨芐 用雜交翻譯法挑選 青霉素敏感細(xì)菌克隆 含干擾素

10、cDNA克隆 將干擾素cDNA克隆入表達(dá)載體 在大腸桿菌 中進(jìn)行高效表達(dá),.,二、基因工程干擾素的制備,啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提 精提 半成品制備 半成品檢定 分裝 凍干 成品檢定 成品包裝,.,2b干擾素生產(chǎn)過程 1.發(fā)酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，質(zhì)粒用啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白凍0.5%酵母提取物0.5%NACl。搖床培養(yǎng)30 C，10h，發(fā)酵種子。15L發(fā)酵罐培養(yǎng)， 30 C，8h。然后42 C，3h。離心去上清。,o,o,o,.,2.產(chǎn)品的提取與純化 濕菌超聲破碎，離心，上清超濾濃 縮，Sephadex G50 分離。 經(jīng)SDS-PAGE檢查。 在經(jīng)DE-52柱純化。,.,三、質(zhì)量控制標(biāo)和要求,半成品檢