新基因功能研究的策略與方法課件

1、新基因功能研究的策略與方法,1,學習交流PPT,隨著生命科學的發(fā)展及研究領(lǐng)域的不斷開拓和生物醫(yī)學研究在分子水平上的不斷深入和推進，越來越多的未知新基因和基因的新功能被發(fā)現(xiàn),越來越多的新基因被得以成功克隆，因此對新基因功能的研究顯得日益重要，這也是后基因組時代功能基因組學的重要研究內(nèi)容和首要任務。,2,學習交流PPT,一.新基因的生物信息學及體內(nèi)表達規(guī)律分析; 二.新基因的體內(nèi)表達規(guī)律分析 三.功能獲得與功能失活策略研究; 四.功能失活策略 五.基因編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究,基因功能的研究策略主要包括：,3,學習交流PPT,目前，生物信息學分析已成為新基因功能研究首選和必用方法，其具有方便快捷

2、和經(jīng)濟等優(yōu)點。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關(guān)的重要信息，初步推測基因的可能功能，進而制定出進一步的實驗室研究方案。 （1）編碼產(chǎn)物預測分析 （2）序列同源性分析 （3）蛋白質(zhì)功能域分析,一.新基因的生物信息學及體內(nèi)表達規(guī)律分析,4,學習交流PPT,（1）mRNA水平的表達譜分析； （2）蛋白質(zhì)水平的表達分析。,二.新基因的體內(nèi)表達規(guī)律分析,要開展新基因功能的研究工作，首要的研究任務摸清新基因在體內(nèi)的表達規(guī)律。包括從mRNA和蛋白質(zhì)兩個水平上來對其基因表達譜進行分析，即看其在各種不同的正?；虿B(tài)組織細胞中是否表達以及表達的水平高低等.新基因在某一特定的正常組織細胞中的表達水平高往往提示其

3、在其中發(fā)揮著重要作用，而新基因在相應的病態(tài)組織中的表達異常則提示與該病理過程相關(guān)的生物學意義。,5,學習交流PPT,三.功能獲得策略,新基因功能研究的功能獲得策略即通過將新基因直接導入到某一細胞或個體中，通過觀察細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化來鑒定基因的功能，常用的方法有：,（1）基因轉(zhuǎn)染技術(shù) （2）轉(zhuǎn)基因技術(shù),6,學習交流PPT,四.功能失活策略,通過觀察某一細胞或個體在新基因的功能部分或全部失活后的細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀變化來鑒定基因的功能。 常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技術(shù)和基因敲除等,（1）基因沉默技術(shù) （2）基因敲除,7,學習交流PPT,五.基因編碼產(chǎn)物相互作

4、用蛋白的研究,細胞各種基本功能的完成離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白質(zhì)復合物。因此，確定能夠與新基因編碼的蛋白質(zhì)表達終產(chǎn)物相互作用的上下游蛋白質(zhì)分子，也是研究新基因功能的一個十分重要的方面。目前常用的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的基親和分析而建立的免疫共沉淀技術(shù)和酵母雙雜交系統(tǒng).,（1）免疫共沉淀技術(shù) （2）酵母雙雜交系統(tǒng),8,學習交流PPT,研究者往往最開始得到有價值的EST序列，進而通過電子延伸或和相關(guān)實驗方法獲取其全長cDNA序列。這種情況下，首先要進行即是進行全長cDNA序列的開放閱讀框查找，推導其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。 然后，進行信號肽序列預測分析。初步判

5、定其亞細胞定位，再進行蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析，包括氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點、親/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基礎，分析預測其高級結(jié)構(gòu)。,編碼產(chǎn)物預測分析,9,學習交流PPT,規(guī)律分析,Cs3亞基蛋白的計算機預測分析,10,學習交流PPT,序列同源性分析,包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，這也是目前生物信息學技術(shù)中應用最為廣泛的基本技術(shù)之一。主要采用BLAST和FASTA程序進行，即從已知的各種核酸和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索與新基因?qū)墓δ芤阎母叨韧椿蚝偷鞍踪|(zhì)，從這些已知基因和蛋白質(zhì)的功能信息中來初步推測和判斷新基因的功能。 同時，因為人類全基因組測序已經(jīng)完成，所

6、以以新基因的cDNA序列來對基因組數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，則可很方便地獲得與其完全同源基因組DNA,11,學習交流PPT,序列及其染色體定位信息，而無需進行熒光原位雜交等基因染色體定位技術(shù)，進而還可通過分析其內(nèi)含子、外顯子序列及其調(diào)節(jié)位點，推測其可能的基因表達調(diào)控方式。即通過此法確定了富含亮氨酸重復序列蛋白新基因的基因組DNA序列及其染色體定位。,用expay軟件分析氨基酸序列同源性,12,學習交流PPT,主要是通過聯(lián)網(wǎng)或數(shù)據(jù)庫行蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者和施行者，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)則是蛋白質(zhì)執(zhí)行生物學功能的基礎，因此對新基因所編碼蛋白質(zhì)的功能域分析將對推測新基因功能提供極其有價值的信息。目前，已經(jīng)有

7、大量被發(fā)現(xiàn)的蘊藏于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的與特定生物學活性相關(guān)的所謂保守模體。,蛋白質(zhì)功能域分析,13,學習交流PPT,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能域分析,14,學習交流PPT,mRNA水平的表達譜分析,對新基因在mRNA 水平上的表達分析涉及到的技術(shù)有半定量RT-PCR 、實時定量RT-PCR 和Northern Blot 等。半定量RT-PCR方法具有簡便、快捷和經(jīng)濟的特點，但其存在著精確度不高和不能進行絕對定量等缺點，多用于基因表達水平的快速初步分析。實時定量RT-PCR是近年來新發(fā)展起來的一種mRNA定量分析技術(shù)，因具有特異性更強、有效解決PCR污染和自動化程度高等的特點而被廣泛應用，但其成本相對較高。No

8、rthern Blot歷來是在mRNA水平上對基因表達進行分析的經(jīng)典技術(shù)，被各實驗室廣泛采用其不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測基因轉(zhuǎn)錄本的大小及種類，這也是RT-PCR技術(shù)所不具備的優(yōu)勢但Northern Blot操作較為繁瑣，采用放射性標記時也存在放射性污染的問題。在實際工作中，需結(jié)合這兩類方法同時進行，互為補充。另外，必要時也應考慮使用原位雜交技術(shù)來對新基因的mRNA在特定組織細胞內(nèi)的分布進行定位觀察。,15,學習交流PPT,蛋白質(zhì)的水平表達分析,確定新基因在哪些組織細胞被轉(zhuǎn)錄后，進一步的工作則是制備相應的抗體來檢測其蛋白質(zhì)終產(chǎn)物的表達情況，如該蛋白質(zhì)表達的亞細胞定位、分子質(zhì)量大小、聚

9、體形式等。這種在蛋白質(zhì)水平上的表達分析涉及到的常用技術(shù)主要是Western Blot和免疫組化等。,其中，Western Blot與Northern Blot類似，不僅可以進行定量分析，而且還能夠檢測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小及其聚體形式。而免疫組化技術(shù)的優(yōu)勢則在于其能夠確定蛋白質(zhì)是在特定組織中的哪些細胞以及在特定細胞的哪個部位中表達。,Western blot,16,學習交流PPT,另外，對于病態(tài)組織細胞而言，在mRNA和蛋白質(zhì)兩個水平上的新基因的表達分析，還可以提供其基因表達調(diào)控的大致規(guī)律，譬如是主要在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上被調(diào)控的。不少研究表明，細胞內(nèi)特定基因的mRNA水平變化和蛋白質(zhì)水平變

10、化的一致性很差。,17,學習交流PPT,基因轉(zhuǎn)染技術(shù),通過基因轉(zhuǎn)染，即將目的基因轉(zhuǎn)入某一細胞中通過觀察細胞生物學行為的變化來認識基因的功能，是目前應用最多、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法。,18,學習交流PPT,如經(jīng)典的RAS癌基因的功能即通過轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞而得以鑒定目前常用的基轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分為非病毒性表達系統(tǒng)和病毒性表達兩種，非病毒性表達載體目前主要采用質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導、電穿孔等方法使目的基因被宿主細胞攝取，然而，盡管這類表達系統(tǒng)具有操作簡便、經(jīng)濟等優(yōu)勢，其也有不少局限性，主要問題是，不同細胞類型對外源DNA的攝取能力有所不同，尤其在初級未轉(zhuǎn)化的細胞中幾乎是無效的，而初級細胞對于觀察基

11、因的細胞轉(zhuǎn)化活性等行為恰恰非常有用。然而，病毒性載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用卻能夠很好的解決此問題，這類以病毒為載體介導的基因轉(zhuǎn)移因其具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達等優(yōu)勢而被廣泛應用。,19,學習交流PPT,轉(zhuǎn)基因技術(shù),利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，則可將外源基因引入動物體內(nèi)，建立攜帶并且能夠遺傳給子代的轉(zhuǎn)基因動物模型，通過對轉(zhuǎn)基因動物的表型分析研究外源基因的功能，目前已經(jīng)運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立了數(shù)千種轉(zhuǎn)基因動物，并且還可以通過在攜帶外源基因的載體上加上組織特異性啟動子等手段，從而控制外源基因在特定的時間或特定的組織器官表達。利用轉(zhuǎn)基因動物來研究基因功能的優(yōu)勢在于它是一個在活體水平上的多維的研究體系，可

12、以從分子到個體水平進行多層次、多方位的研究。,20,學習交流PPT,21,學習交流PPT,基因沉默技術(shù),這類技術(shù)中最常用的主要為反義寡核苷酸（ASON）、核酶和RNA干擾（RNAi）技術(shù)。 然而，包括這3種技術(shù)在內(nèi)的該類技術(shù)均具有誘導干擾素和其它細胞因子表達等非特異性效應，另外，它們也會因為作用與和靶分子序列相近的分子而產(chǎn)生脫靶效應，其中，ASON因使用劑量大，其非特異性效應最大；而RNAi的這兩種副效應最小。,22,學習交流PPT,基因敲除,或稱基因打靶，是建立在胚胎干細胞技術(shù)和同源重組技術(shù)基礎上的一種方法。既可以在細胞水平上進行，從而建立新的細胞系，也可以在整體水平進行以建立基因敲除動物，

13、通過觀察個體的表型變化而推測基因在體內(nèi)的可能功能。利用基因敲除技術(shù)獲得的基因敲除動物已成為目前研究基因功能最直接和最有效的方法之一。但因技術(shù)條件和費用較高、僅限于小鼠等缺點，且在胚胎期消除了目的基因的功能，可能只反映一部分基因功能；或者某些重要基因被剔除后可導致小鼠在胚胎期凋亡，無法檢測對各發(fā)育階段的影響，使基因剔除技術(shù)的應用受到限制。同時很多情況下，其結(jié)果也是不明朗的。,23,學習交流PPT,基因敲除小鼠技術(shù),24,學習交流PPT,免疫共沉淀技術(shù),25,學習交流PPT,免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。 該方法的優(yōu)點是：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，所處的環(huán)境條件也是接近天然狀態(tài)的，能夠反映體內(nèi)的相互作用情況，也可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。但應該注意，有時免疫共沉淀的蛋白質(zhì)并非是直接相互作用，如ElA與p107的共沉淀就是間接的相互作用，這實際上是ElA與p107、p107與cyclin A直接相互作用的結(jié)果。另外，其靈敏度也相對較低。,26,學習交流PPT,酵母雙雜交系統(tǒng),27,學習交流PPT,是一種基于轉(zhuǎn)錄重建而建立的研究生物大分子相互作用的簡便而有效的研究方法。其最大優(yōu)勢在于它可以用已經(jīng)克隆的