化學人工酶和生物酶工程.ppt

1、化學人工酶和生物酶工程,第八章,主講人余子全,第一節(jié) 化學人工酶,此外，根據(jù)有關(guān)酶和輔酶的知識，用有機化學合成的方法設(shè)計、合成比輔酶分子更小簡單的輔酶模型化合物，研究其在非酶促條件下的反應(yīng)活性和催化機理。,化學人工酶（Artifical enzyme)：根據(jù)酶的催化原理，模擬天然酶的生物催化功能，利用有機化學和生物學的方法合成的具有專一催化功能的酶的模擬物。,一、半合成酶(Semisynthetic enzyme),半合成酶：將具有一定結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)與特異的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成的一類具有新的生物催化功能的催化劑,半合成酶的合成方法： 1. 將具有催化活性的金屬或金屬有機物與具有特異性的蛋白質(zhì)相結(jié)

2、合,2. 將具有特異性的物質(zhì)與具有催化功能的酶相結(jié)合,Gray與Margalit將電子傳遞催化劑Rn釕(NH3)53+，與巨頭鯨肌紅蛋白結(jié)合，產(chǎn)生半合成的無機生物酶。肌紅蛋白傳遞氧氣， Rn(NH3)53+能氧化各種有機物(如抗壞血酸)。接近天然的抗壞血酸氧化酶的活力。（與蛋白結(jié)合的優(yōu)勢）,美國Schultz小組，寡聚核苷酸鏈連接到RNA酶的Cys166上。利用寡聚核苷酸鏈的堿基互補關(guān)系，顯示出對RNA鏈特定位點的水解作用。第一個不同于DNA限制性內(nèi)切酶的RNA限制性內(nèi)切酶。 Kaiser小組 ，黃素木瓜蛋白酶(FP) 木瓜蛋白酶Cys25的巰基參與蛋白質(zhì)水解反應(yīng)。8-溴乙酰黃素與此巰基結(jié)合后

3、，喪失水解活性，F(xiàn)P催化效率是黃素（黃素氧化還原酶的輔酶）的 1000倍，達到了天然黃素氧化還原酶的活性。,二、全合成酶,這類人工酶不是蛋白質(zhì)（抗體酶除外），而是一些有機化合物通過引入酶的催化基團來控制空間構(gòu)象，像天然酶那樣能催化特異性的化學反應(yīng)。,抗體酶的理論基礎(chǔ) 半抗原與催化性抗體 抗體酶的制備方法 抗體酶應(yīng)用,（一）抗體酶（Abzyme）,是一種新型人工酶制劑，是20世紀80年代以來出現(xiàn)的一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，是利用生物學和化學的成果在分子水平交叉滲透研究的產(chǎn)物，其本質(zhì)上是免疫球蛋白，只是在其易變區(qū)被賦予了酶的屬性，是一類具有生物催化功能的抗體分子。又稱為催化性抗體（Catalyti

4、c Antibody），以抗原或半抗原（過渡態(tài)類似物）制備的，并能催化其反應(yīng)的抗體。,抗體酶的理論基礎(chǔ),抗原與抗體的結(jié)合具有高度專一性，這一性質(zhì)和酶與底物的結(jié)合非常相似,Anti-cancer tumer-targetting abzyme,Pauling(1948)過渡態(tài)理論：酶之所以具有催化活性在于其能夠結(jié)合并穩(wěn)定反應(yīng)底物與產(chǎn)物之間的過渡態(tài)構(gòu)型，降低了底物分子的能量障礙.,S,底物轉(zhuǎn)變?yōu)檫^渡態(tài),過渡態(tài)類似物合成,酶作為抗原或半抗原,補充知識點： 如果能夠模擬合成出酶催化反應(yīng)過渡態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定物質(zhì)，該物質(zhì)便能與相應(yīng)的酶緊密結(jié)合，并成為酶的抑制劑，這類物質(zhì)成為酶的過渡態(tài)類似物。,酶的過渡態(tài)類似物

5、：對酶催化反應(yīng)過渡態(tài)結(jié)構(gòu)的模擬的穩(wěn)定物質(zhì)， 能與酶緊密結(jié)合，是酶的抑制劑。,酶與抗體的不同點：酶能夠結(jié)合并穩(wěn)定化學反應(yīng)的過渡態(tài)，降低反應(yīng)的活化能（催化）；而抗體結(jié)合的抗原只是一個基態(tài)分子，沒有催化活性。 酶與抗體的共同點：酶分子與它催化反應(yīng)的過渡態(tài)互補，抗體與抗原互補；酶和抗體都是有生物活性的蛋白質(zhì)。,Lerner(1984)提出：若以過渡態(tài)類似物為半抗原，則其誘發(fā)產(chǎn)生的抗體應(yīng)該與該類似物具有互補構(gòu)象；這種抗體與底物結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)底物進入過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，從而引起催化作用。,1986年Lerner在Science上發(fā)表有關(guān)抗體酶研究成果，標志著抗體酶研究進入了一個新階段。,發(fā)展歷程,W. P. J

6、encks(1969)認為：酶分子與其催化反應(yīng)的過渡態(tài)在結(jié)構(gòu)和電荷兩方面呈互補，即酶分子充當了反應(yīng)物的模板，使底物分子轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌臉?gòu)型；如果抗體能結(jié)合過渡態(tài)，那么在理論上便能獲得催化活性。,優(yōu)勢 1 產(chǎn)生新酶 2 立體專一性 3 催化不利的反應(yīng)過程 應(yīng)用 醫(yī)學 藥物 抗病毒 工業(yè) 化工 材料,抗體酶的反應(yīng)類型：碳酸鹽水解、脂水解、酰胺水解、Claisen重排、酰胺化、內(nèi)酯化、轉(zhuǎn)酯、光分解（依賴光）、光二聚化、-消除、順反異構(gòu)化、脫羧、金屬螯合、亞胺化、氧化等40多種反應(yīng)。,半抗原：是一類小分子化合物，本身不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，只有當共價結(jié)合到具有免疫性的蛋白質(zhì)后，注射動物才能誘導(dǎo)出與半抗原特異性結(jié)合

7、的抗體；如果半抗原是酶的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)類似物，則有可能獲得具有催化活性的抗體，也就是抗體酶。,例如：以一羧基酯和酰胺水解為例，根據(jù)反應(yīng)機理，其過渡態(tài)應(yīng)該為一個四面體結(jié)構(gòu)，以具有四面體結(jié)構(gòu)的高能中間類似物為半抗原，均能獲得預(yù)期的抗體酶；該抗體酶與過渡態(tài)類似物具有完全互補的立體結(jié)構(gòu)。,半抗原與催化性抗體,1、半抗原設(shè)計中應(yīng)考慮： (1)產(chǎn)生的抗體能否具有預(yù)期的催化活性。 (2)能否刺激機體免疫應(yīng)答。,2、半抗原結(jié)構(gòu)與催化抗體之間的關(guān)系： (1)半抗原結(jié)構(gòu)中應(yīng)含有芳香結(jié)構(gòu)（具較強的免疫原性）。 (2)催化抗體和半抗原的親和力。 (3)誘導(dǎo)羧酸酯、酰胺水解的催化性抗體，可利用其具有四面體結(jié)構(gòu)的高能過渡態(tài)類

8、似物為抗原。 (4)半抗原設(shè)計應(yīng)考慮催化反應(yīng)的環(huán)境與反應(yīng)機制，即所設(shè)計的半抗原應(yīng)能誘導(dǎo)催化抗體在其抗原結(jié)合部位創(chuàng)造出特定的有利于催化反應(yīng)的環(huán)境。（疏水微環(huán)境）,抗體酶的制備方法,拷貝法 修飾法 誘導(dǎo)法,1、拷貝法：用已知的酶為抗原免疫動物，獲得抗酶的抗體，再用抗酶的抗體免疫動物并進行單克隆化，即可獲得抗抗體，抗抗體實際上就是具有原來酶活性的抗體酶?？箍贵w（二抗和抗原一樣具有和底物結(jié)合的能力）,2、修飾法：借助于基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，將催化基團引入到已有底物結(jié)合能力的抗體的抗原結(jié)合位點上，或采用分于修飾技術(shù)，將抗體抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)改變成為酶分子的活性中心，從而產(chǎn)生有催化活性的抗體。（寡核苷

9、酸定點誘變技術(shù) ；選擇性化學修飾法）,3、誘導(dǎo)法：用事先設(shè)計好的抗原(半抗原)按照一般的單克隆制備程序，獲得具有催化活性的抗體，即抗體酶。,抗體酶的輔因子,在抗體的抗原結(jié)合位點引入輔因子的方法目前有三種： 1、用多種底物類似物一次免疫動物，產(chǎn)生既有輔因子結(jié)合部位又有底物結(jié)合部位的抗體。 2、用半合成法將輔因子或催化基團引入到抗體底物結(jié)合部位。 3、向抗體中的一條鏈的抗原結(jié)合部位引入輔因子.,抗體酶應(yīng)用,1、切割肽鏈的抗體酶 2、癌癥與病毒性疾病治療 3、疫苗 4、新催化劑開發(fā) 5、藥物設(shè)計、合成 6、治療酶缺乏遺傳病,抗體酶新進展,組合抗體庫的噬菌體表面展示 抗體酶的研究進展 Phage Di

10、splay of Combinatorial Antibody Libraries Recent advances in the generation and selection of antibodies from combinatorial libraries allow for the rapid production of antibodies from immune and non-immune sources.,意義,1、省去了單克隆抗體制備過程中許多費時費力的過程。 2、細胞水平進入分子水平 3、重輕鏈的隨機組合提高了抗體的多樣性，人工突變 4、花費時間少（1-2周與數(shù)月） 5、

11、適合非細胞工程實驗室 6、也可用于抗體的制備,利用各種有機分子(如-環(huán)糊精、卟啉等)和金屬離子而制備的具有水解、氧化還原、轉(zhuǎn)氨等功能的全合成酶： (1)氨肽酶全合成酶：三乙撐四胺(Trien)的Co 絡(luò)合物。 (2)轉(zhuǎn)氨全合成酶：Gly甘與Ala丙的西佛氏堿的Cu()絡(luò)合物。 (3)ATP水解全合成酶：CoEdda(H2O2)2-等。 -Benzyme人工酶能模擬-胰凝乳蛋白酶活性（最成功的） 由環(huán)糊精制成的人工轉(zhuǎn)氨酶能催化酮酸與磷酸吡哆胺專一性地合成氨基酸。,（二）小分子有機化合物,水解酶模擬： -胰凝乳蛋白酶是一種蛋白質(zhì)水解酶，具有包結(jié)底物的疏水性環(huán)狀結(jié)合部位，催化部位中含有57-組氨酸咪

12、唑基、102-天冬氨酸羧基及195-絲氨酸羥基，三者共同織成 “電荷中繼系統(tǒng)”在催化底物水解時起著關(guān)鍵作用。近年、模擬-胰凝乳蛋白酶等水解酶的研究進展迅速，取得一些重要結(jié)果。 如M.L.Bender等設(shè)計合成的-Benzyme催化醋酸間叔丁苯酯水解反應(yīng)比酶催化更快，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性高于天然酶。RBreslow等合成的橋聯(lián)環(huán)糊精與Cu2+的絡(luò)合物在中性條件下催化一些雙疏水部位的水解反應(yīng)速率比無催化劑時提高1.81042.2105倍。,醛縮酶模擬,二胺（當m=0）、多胺環(huán)糊精模擬醛縮酶功能，催化丙酮與對硝基苯甲醛縮合，生成-醇酮 ，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)選擇性好。,橋聯(lián)環(huán)糊精催化羧酸對硝基苯酯的水

13、解,（三）人工聚合物酶 用分子印跡技術(shù)制備的人工酶。其原理與抗體酶相同，只是用人工聚合物代替抗體。 以對硝基酚甲基磷酸酯（硝基酚乙酸酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)類似物）為模板，得到的有機功能團的聚合物，可以催化硝基酚乙酸酯水解。,1、分子印跡,分子印跡(Molecular Impriting)：一種模擬抗體抗原相互作用的人工生物模板技術(shù)， 1972年由德國的Wulff提出。可以針對不同的目的，采用人工合成的方法，構(gòu)造出具有特定選擇性識別位點的模板聚合物，這種聚合物可作為酶，用于生物物質(zhì)的分析、檢測、分離與純化以及酶的模擬和催化合成等。,化學模擬酶催化劑與天然的生物酶催化劑相比,具有抗惡劣環(huán)境的能力,表現(xiàn)

14、出高度的穩(wěn)定性和長的使用壽命,2、對特定分子(印跡分子或稱模板)具有選擇性的聚合物過程。 包括： (1)選定特定分子和單體，讓它們之間發(fā)生互補作用。 (2)在印跡分子一單體聚合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)。 (3)用抽提法從聚合物中除去印跡分子。則聚合物中留有恰似印跡分子的空間，可用于高分子高選擇性分離材料。 從人工酶角度來看，若用過渡態(tài)類似物作為印跡分子，則所得聚合物具有相應(yīng)的催化活性，此時代替抗體的只是人工聚合物。,3、印跡聚合物的制備及特性,3.1 制備 印跡高聚物的形成需要基質(zhì)單體、官能團單體和印跡分子三者的相互作用,其制備方法主要有兩種:由等人創(chuàng)立和發(fā)展起來的共價鍵法(預(yù)組裝)和由等人發(fā)展起來

15、的非共價鍵法 (自組裝）,共價鍵法,印跡分子與官能團單體以共價鍵形式結(jié)合而形成印跡分子的衍生物,該衍生物在交聯(lián)劑的存在下接枝到聚合物的基質(zhì)上。在印跡聚合物形成后,再將與印跡分子連接的這些共價鍵打斷,并將印跡分子洗脫出來,從而形成具有吸附活性的印跡聚合物.在共價鍵法中,所采用的單體通常為低分子化合物,在選擇時應(yīng)考慮該單體與印跡分子形成的共價鍵鍵能要適當,達到在聚合時能牢固結(jié)合,在聚合后又能完全脫除的目的,非共價鍵法,把適當比例的印跡分子與官能團單體和交聯(lián)劑混合,通過非共價鍵結(jié)合在一起制成非共價鍵印跡分子聚合物。這些非共價鍵包括離子鍵、氫鍵、疏水與靜電作用等。由于這種方法與溶劑的極性密切有關(guān),所以

16、印跡高聚物的形成是在有機溶劑中完成的,3.2 特性,在分子印跡技術(shù)中所用的聚合物必須具有特定的物理及化學性質(zhì),并對一些物理化學作用具有一定抵抗能力。,4 應(yīng)用實例,4.2藥物分析 基于針對不同印跡分子可設(shè)計合成出不同的印跡高聚物這一點,等在1993年提出了一種新的放射性標記配體結(jié)合分析方法()測定人體血清中的藥物。,4.3藥物控制釋放 印跡高聚物可以吸收大量與印跡分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì),可以被用來做為一種反應(yīng)性控制釋放載體（競爭抑制）。,4.1手性異構(gòu)體拆分 將印跡聚合物作為高效液相色譜的固定相用于分離多肽,蛋白質(zhì),核糖核蛋白及各種糖類分子。,第二節(jié) 生物酶工程,生物酶工程是酶學和以DNA重組技術(shù)

17、為主的現(xiàn)代分子生物學技術(shù)相結(jié)合的一門新興的生物工程，亦稱高級酶工程(Advanced Enzyme Engineering),一、克隆酶 1.克隆酶：通過基因工程手段，人們能偶克隆各種天然蛋白質(zhì)和酶基因，并將其與適當?shù)恼{(diào)節(jié)信號相連接，再通過一定得載體（質(zhì)粒）導(dǎo)入能夠大量繁殖的微生物細胞內(nèi)，使之高效表達。 2. 意義：醫(yī)藥用酶 3. 技術(shù)步驟： 目的基因獲得 選擇載體 重組DNA連接 重組基因轉(zhuǎn)化 克隆酶基因表達,二、突變酶 1.突變酶：利用有控制的對天然酶基因進行剪切、修飾或突變，從而改變酶的催化特性、底物專一性或輔酶專一性，從而更能滿足人們的需要 其主要內(nèi)容：酶選擇性修飾以及對酶基因進行定點

18、突變 2. 定點突變方法： 盒式誘變(Cassette Mutaganesis) 寡聚核苷酸引物誘變 PCR誘變,3. 遺傳修飾改變酶的性能大致有： 提高酶穩(wěn)定性 提高酶活性 改變底物專一性 改變酶的最適pH值 改變酶對輔酶的要求 改變酶的別夠調(diào)節(jié)能力,三、超自然的優(yōu)質(zhì)酶新酶 人為地有目的地設(shè)計酶基因，導(dǎo)入適當宿主細胞中加以表達，生產(chǎn)超自然的優(yōu)質(zhì)酶 此過程的關(guān)鍵是對酶分子各個結(jié)構(gòu)層次上的設(shè)計與組合,四氫呋喃,四氫吡喃,環(huán)氧化物,放射性標記配體結(jié)合分析方法（RIA） *Ag; Ag ;*Ag-Ab; Ag-Ab 前提：*Ag和Ab為恒量，Ag和*Ag的總量大于Ab上的有效結(jié)合位點時，*Ag、Ag、Ab三者混合后: *Ag-Ab的形成量與Ag量成反比，剩下的未結(jié)合或游離的*Ag則與Ag量成正比，因此測定*AgAb或*Ag即可推算出被測的Ag量 這種現(xiàn)象稱為競爭結(jié)合反應(yīng)，這種*AgAb的量（因變量）與Ag的量(自變量）之間存在的競爭性抑制的數(shù)量關(guān)系是RIA的定量基礎(chǔ)。這種數(shù)量關(guān)系可以由標準競爭抑制曲線(簡稱標準曲線)來顯示。,放射免疫分析的基本原理 *Ag代表標記抗原(Labeled Antigen)，Ag代表非標記抗原，Ab代表特異抗體