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文檔簡介
1、微生物學(xué)實驗技術(shù),一株產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的選育研究,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)系 2012.8,實驗內(nèi)容,一、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的篩選 二、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的誘變育種 三、產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的分類鑒定 四、產(chǎn)酶菌株生長曲線的測定 五、菌種保藏技術(shù),實驗要求,一、每個實驗相對獨立,都要提交實驗 報告; 二、課程中間進(jìn)行三次測驗考核,不再 進(jìn)行期末考試; 三、每8人一組,獨立完成實驗。,實驗一 產(chǎn)中性蛋白酶芽孢細(xì)菌的篩選,一、目的意義 二、材料方法 三、數(shù)據(jù)結(jié)果 四、討論分析 五、參考文獻(xiàn),一、目的意義,1、篩選獲得一株高產(chǎn)中性蛋白酶的芽孢細(xì)菌菌株。 2、學(xué)習(xí)掌握從樣品采集到菌種
2、保藏的技術(shù)流程。,關(guān)鍵技術(shù):,綜合實驗方案設(shè)計 實驗準(zhǔn)備 樣品采集 酪蛋白平板水解圈法初篩 無菌操作,二、材料方法,技術(shù)路線,樣品采集:選用豆豉等富含蛋白質(zhì)的自然樣品進(jìn)行篩選。 富集培養(yǎng):以酪蛋白為唯一碳源富集培養(yǎng)目標(biāo)菌株。 預(yù)處理:80水浴10分鐘 初篩:水解圈法 復(fù)篩:分光光度計法,第一次實驗:,討論并設(shè)計實驗方案; 實驗材料準(zhǔn)備:培養(yǎng)基、無菌水等; 樣品預(yù)處理(5g豆豉,加入45ml無菌水,80水浴10分鐘處理) 系列稀釋涂平板; 37倒置培養(yǎng)48h;,酪蛋白篩選固體培養(yǎng)基 酪蛋白:5.0g; 酵母膏:2.0 g; 瓊 脂:20.0g; 蒸餾水:1000ml pH: 7.0。,第二次實驗
3、:,從第一次實驗的平板上,觀察選擇產(chǎn)生水解圈的菌落,制片鏡檢觀察; 選擇水解圈最大的、產(chǎn)芽孢的菌落進(jìn)行下一步操作; 將水解圈最大的芽孢細(xì)菌菌落作為目標(biāo)物,在LB平板上進(jìn)行劃線分離; 37倒置培養(yǎng)24h;,LB分離純化固體培養(yǎng)基 蛋白胨:10.0g; 酵母膏: 5.0 g; 氯化鈉:10.0g; 瓊 脂:20.0g; 蒸餾水:1000ml pH到 7.0。,第三次實驗:,挑取生長飽滿的單菌落轉(zhuǎn)接入LB試管斜面,每個分離物轉(zhuǎn)接5支試管。 37培養(yǎng)24h,保藏備用; 討論下一步實驗方案(紫外線誘變育種)并準(zhǔn)備實驗材料;,LB斜面保藏固體培養(yǎng)基(同純化培養(yǎng)基) 蛋白胨:10.0g; 酵母膏: 5.0
4、g; 氯化鈉:10.0g; 瓊 脂:20.0g; 蒸餾水:1000ml pH到 7.0。,三、數(shù)據(jù)結(jié)果,初篩依據(jù): 水解圈直徑(D2):菌落直徑(D1) D2/D1 = ? 復(fù)篩依據(jù) Folin -酚法 測定中性蛋白酶活性,四、討論分析,樣品采集 預(yù)處理 富集培養(yǎng) 初篩 復(fù)篩 評價體系 ,五、參考文獻(xiàn)(舉例),1 孫妍等,產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶納豆芽孢桿菌益生菌株的 篩選及其生長特性研究,東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 學(xué)報,第42卷 第3期,42(3):3942。 2 蔡婉玲等,蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和紫外誘變育種,生物 技術(shù),2011年21(1)。 3 宋園亮等,元陽豆豉中高產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選及其產(chǎn) 酶條件的研究,中國微生態(tài)學(xué)雜志,2011年1
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