《基因克隆操作過程》PPT課件.ppt

1、第六章 基因克隆操作過程,2011-10-23,1,基因克隆操作過程,基因克隆操作過程,基因克隆操作過程概述,1.DNA的體外重組酶切和連接（切、接） 2.重組DNA分子的轉化和擴增（轉、增） 3.轉化子的篩選和鑒定（檢）,2011-10-23,2,切,接,檢,轉,增,restriction endonuclease,DNA ligase,2011-10-23,3,基因克隆操作過程,一、DNA的體外重組（切與接）,2011-10-23,4,基因克隆操作過程,1.DNA的體外重組（一）切,工具：限制性核酸內切酶（restriction endonuclease） 作用對象：目的基因片段、載體 目

2、的：獲得具有互補粘性末端（或平末端）的線性目的基因片段和線性化載體,2011-10-23,5,基因克隆操作過程,6,基因克隆操作過程,Hind III,EcoR I,Pvu II,2011-10-23,7,基因克隆操作過程,雙酶聯(lián)合酶切所使用的buffer（Takara）,各種限制酶酶切反應所使用的buffer（Takara）,2011-10-23,單酶切實例（Takara）,2011-10-23,8,基因克隆操作過程,雙酶聯(lián)合酶切實例（Takara）,2011-10-23,9,基因克隆操作過程,2. DNA的體外重組（二）接,工具：DNA連接酶（DNA ligase） 作用對象：具有互補粘性

3、末端（或平末端）的線性目的基因片段和線性化載體 目的：獲得含有目的基因的環(huán)狀載體,2011-10-23,10,基因克隆操作過程,2011-10-23,5,5,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,5,5,5,5,EcoRI,退火,T4-DNA ligase,a)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物； b)需要鑒定目的基因的連接方向,（1）單酶切產(chǎn)生的粘性末端的連接,11,基因克隆操作過程,同尾酶：能切割產(chǎn)生相同末端的限制性內切酶。 同尾酶一般是指能產(chǎn)生相同粘性末端的限制酶。所有鈍末端酶產(chǎn)生的末端均是相同的，但一般不作為同尾酶來研究。 同尾酶是不同的酶，它們只是切割DNA產(chǎn)生的末

4、端相同，同尾酶之間的識別序列可以相同也可以不同 基因工程中識別序列不同的同尾酶的應用性最大,（2）同尾酶產(chǎn)生的粘性末端的連接,Takara網(wǎng)站提供的同尾酶信息,2011-10-23,12,基因克隆操作過程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,BclI,BamHI,退火,T4-DNA ligase,a)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物； b)需要鑒定目的基因的連接方向； c)目的產(chǎn)物中對應位置的序列不再是原來的酶切位點,2011-10-23,13,基因

5、克隆操作過程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,5,5,3,切平,5,5,G,C,補平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,（3）不同粘性末端的連接,PstI,BamHI,T4-DNA polymerase,Klenow,T4-DNA ligase,a)獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物； b)需要鑒定目的基因的連接方向；,c)目的產(chǎn)物中對應位置的序列不再是原來的酶切位點,2011-10-23,14,基因克隆操作過程,（4）雙酶聯(lián)合酶切產(chǎn)生的不同粘性末端的連接,CTGCAGNNNNNNNNNGGATCC,GACGTCNNNNNNNNNCCT

6、AGG,PstI,CTGCA GATCC,G G,BamHI,GGATCC CTGCAG,CCTAGG GACGTC,PstI,BamHI,GATCC CTGCA,G G,退火,CTGCA G G GATCC,G ACGTC CCTAG G,T4-DNA ligase,CTGCAG GGATCC,GACGTC CCTAGG,a)連接產(chǎn)物中目的基因的方向是確定的。,2011-10-23,15,基因克隆操作過程,基因克隆操作過程,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,5,5,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5

7、 AATTC,TTAAG,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,Klenow,補平,Klenow,補平,TdT,dGTP,TdT,dCTP,退火,T4-DNA ligase,（5）人工粘性末端的連接：5突出末端,獲得連接方向不同的兩種產(chǎn)物,EcoRI,BamHI,BamHI,BamHI,2011-10-23,16,CTGCA 3,G,G,3 ACG

8、TC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,GCATGCCCCCC 3,C,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,TdT,dCTP,TdT,dGTP,退火,Klenow,T4-DNA ligase,（6）人工粘性末端的連接：3突出末端,獲得連接方向不同

9、的兩種產(chǎn)物,SphI,PstI,PstI,PstI,2011-10-23,17,基因克隆操作過程,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3 G,GTTTTTTTTTT 3,C,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,TdT,dTTP,TdT,dATP,退火,T4-DNA ligase,加熱,S1 nuclease,（7）人工粘性末端的連接：平頭末端,2011-10-23,18,基因克隆操作過程,5,5,T4-D

10、NA ligase,GATCC,5,G,5,G,CCTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCGGAATTCCGATCC,CCTAGCCTTAAGGCTAGG,5,5,GGAATTCC,CCTTAAGG,BamHI,Klenow,補平,（8）粘性末端的更換,EcoRI linker,EcoRI,2011-10-23,19,基因克隆操作過程,重組率,重組率的定義：含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)。 （1）在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25-75%； （2）重組率是衡量連接反應效率的重要指標，較高的重組率可以 大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。,

11、提高重組率的方法 （1）提高外源DNA片段與載體的分子比：5 : 1 - 10 : 1 （2）載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團：防止載體自連,堿性磷酸單酯酶CIP、BAP：催化核酸分子脫掉5磷酸基團,2011-10-23,20,基因克隆操作過程,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,GCATGCCCCCC 3,C,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTA

12、CG,TdT,dCTP,TdT,dGTP,退火,Klenow,T4-DNA ligase,（3）加裝同聚尾末端：,2011-10-23,21,基因克隆操作過程,DNA ligase介導的體外連接實例（Takara）,2011-10-23,22,基因克隆操作過程,二、重組DNA分子的轉化和擴增 （轉與增）,2011-10-23,23,基因克隆操作過程,1.轉化的原理與技術,（1）Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉化,原理：Ca2+誘導的完整細胞的轉化適用于革蘭氏陰性細菌（如 大腸桿菌等），1970年建立。其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在 低溫下形成液晶結構，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙

13、，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)。處于感受態(tài)的細菌，容易接受外源DNA。,2011-10-23,24,基因克隆操作過程,2+,分子克隆第三版,OD600=0.4左右,2011-10-23,25,基因克隆操作過程,分子克隆第三版,2011-10-23,26,基因克隆操作過程,Ca2+誘導轉化過程中應注意的事項 轉化所用DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%； 熱擊過程中不要搖晃離心管； 檢測轉化子的Amp抗性時，轉化子鋪平板時密度應低一些（104菌落/板）；轉化子于37培養(yǎng)不要超過20小時。因為鋪板過密或培養(yǎng)時間過久會導致平板上出現(xiàn)對Amp敏感的衛(wèi)星菌落。 轉化過程中37溫育菌體使細菌復蘇時

14、的轉速不可過高，為得到較高的轉化效率，應使轉速小于225rpm。 當用于涂板的轉化液過多時，應離心濃縮（4100rpm，5min），并用適量SOC液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后涂板。 剛進行完轉化的菌體比較脆弱，涂板時應輕輕涂布。,2011-10-23,27,基因克隆操作過程,提高轉化效率的幾個重要因素： 細胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉接或儲于的培養(yǎng)菌，最好從-70或-20甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。 細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)

15、，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。,2011-10-23,28,基因克隆操作過程,質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋DNA(cccDNA)。 轉化效率與外源DNA濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源DNA量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。 1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5。,2011-10-23,29,基因克隆操作過程,試劑的質量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的，并用超純水配制（過濾除菌，非高壓滅菌），最好分裝保存于干燥的冷暗處（冰箱4）。 防止雜菌和雜DNA的

16、污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, 槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選和鑒定帶來不必要的麻煩。,2011-10-23,30,基因克隆操作過程,2011-10-23,31,基因克隆操作過程,（2）細菌原生質體的轉化 適用對象：革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等），其接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常去除細胞壁后再進行轉化，這與酵母菌、霉菌、植物細胞等類似。 細菌原生質體的制備：不同細菌的原生質體制備方法不盡相同。以鏈霉菌為例，

17、細菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質體接觸的所有器皿應保持無水、無去污劑。 細菌原生質體的轉化：由PEG和Ca2+介導 細菌原生質體的再生：原生質體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內含脯氨酸和微量元素。,（3）噬菌體DNA的轉染 感受態(tài)細胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 = 0.5 吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30保溫10分鐘 轉染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30繼續(xù)

18、培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。,2011-10-23,32,基因克隆操作過程,（4）電穿孔轉化 原理：將待轉化的質?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質?；駾NA重組分子便可進入細胞內。 特點：電穿孔轉化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y構的受體細胞均有效，但轉化效率差別很大。,2011-10-23,33,基因克隆操作過程,（5）酵母的轉化一般有以下兩種方法： 利用酵母的原生質球進行轉化 利用Li+鹽進行轉化 （6）植物細胞的轉化及其他基因轉移方法 葉盤法 電擊法 基因槍法 （7

19、）哺乳動物細胞基因導入法 磷酸鈣沉淀法 脂質體載體法 顯微注射法 DEAE葡聚糖轉染技術,2011-10-23,34,基因克隆操作過程,2.轉化率,（1）轉化率的定義,轉化率是衡量轉化效率的重要指標，其定義為：每微克載體 DNA在最佳轉化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于在一般的轉 化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此 轉化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉化后，能夠接納 DNA的受體細胞數(shù)目，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組 子的受體細胞無法生長）。,2011-10-23,35,基因克隆操作過程,例如，pUC18對大腸桿菌的轉化率為108 ，即每微克pUC18 中

20、只有108個分子能進入受體細胞。一微克pUC18共有3.41011個 分子，也就是說，每3400個pUC18分子中才有一個分子進入受體細胞。,另一方面，在實際操作過程中，轉化一微克pUC18共需2mL 感受態(tài)細胞，大約含有21010 個大腸桿菌細胞，也就是說，每 200個細胞中只有一個細胞能接納pUC18 DNA。,2011-10-23,36,基因克隆操作過程,（2）轉化率的用途,利用轉化率和重組率等參數(shù)可以幫助設計DNA重組實驗規(guī)模,例如，某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉化率為107/g載體， 經(jīng)切、接處理后的載體轉化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個 重組克隆，需投入多少載體D

21、NA進行重組實驗？,若重組率為100%，則轉化后產(chǎn)生104個重組克隆需要：,104 /（107/gX 10-2）= 0.1 g 載體DNA,考慮到實驗系統(tǒng)的重組率為20%，所以實際投入載體應為：,0.1 / 20% = 0.5 g 載體DNA,載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算,出（5 g），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進行篩選。,2011-10-23,37,基因克隆操作過程,（3）轉化率的影響因素,載體的空間構象：質粒的超螺旋構象轉化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構象難以恢復，其轉化率一般要比新制備的超螺旋質粒低兩個數(shù)量級。 插入片段的大?。簩|粒載體而言，

22、插入片段越大，轉化效率越低。,受體細胞：受體細胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉化大腸桿菌JM83株，轉化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉化率則較高。,2011-10-23,38,基因克隆操作過程,供體、受體的比例：Ca2+誘導轉化 0.1ml 感受態(tài)細胞 50ng DNA 原生質體轉化 109 個原生質體 50ng DNA 轉化方法：Ca2+誘導轉化：106-107/g DNA 原生質體轉化：105-106/g DNA -DNA轉染： 107-108/g DNA 電穿孔轉化： 106-109/g DNA,3.轉化細胞的擴增,（1）擴增操作 轉化細胞的擴增操作是指轉化完成之后細胞的

23、短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉化操作偶聯(lián)在一起，如：Ca2+誘導轉化后，37培養(yǎng)一個小時；原生質體轉化后的再生過程；噬菌體轉染后，30培養(yǎng)10min等，均屬擴增操作。,（2）擴增操作的目的 增殖轉化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉化細胞用于篩選程序； 擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選； 表達外源基因，便于篩選和鑒定。,2011-10-23,39,基因克隆操作過程,三、轉化子的篩選和鑒定（檢）,由于重組率和轉化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉化子與非轉化子。,2011-10-23,40,基因克隆操作過程,1.載體遺傳標記檢測,（1）抗藥性篩選法,將外源DNA片段

24、插在BamHI位點： 非轉化子呈 Ampr、Tcr 轉化子呈 Ampr、Tcs,2011-10-23,41,基因克隆操作過程,Ap,抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉化液涂布含有Amp的平板； 再將Amp平板上的菌落影印至含 有Amp和Tc的平板上； 在Amp平板上生長、但在Amp和Tc 平板上不長的菌落即為轉化子。,挑選,影印 Ap + Tc,2011-10-23,42,基因克隆操作過程,（2）營養(yǎng)缺陷型篩選法,營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組分 的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組分，將轉化 細胞涂布在不含此營養(yǎng)組分的培養(yǎng)基上，長出的便是轉化子。,常見的營養(yǎng)缺陷型

25、篩選標記： （1）用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp； （2）用于高等哺乳動物細胞的營養(yǎng)標記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應的受體細胞則選擇tk-缺陷型。,2011-10-23,43,基因克隆操作過程,（3）顯色篩選法,顯色篩選法的基本原理：載體分子上攜帶某種酶基因，其表達產(chǎn)物 能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質粒 pUC18攜帶的lacZ基因（編碼半乳糖苷酶，藍色反應）、鏈霉菌 質粒pIJ702攜帶的melC基因（編碼酪氨酸酶，黑色反應）等。,2011-10-23,44,基因克隆操作過程,顯色篩選法的基本操作：,將外源基因克隆在pUC18的l

26、acZ標 記基因內部，使之滅活，此時轉化 子為Ampr、lacZ-，呈淡黃色或白色 菌落；而非轉化子則為Ampr、lacZ+， 呈藍色菌落藍白斑篩選。,IPTG：異丙基-D-硫代半乳糖苷； X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷, 是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的顯色底物,2011-10-23,45,基因克隆操作過程,2.克隆DNA序列檢測,（1）限制性酶切圖譜法,所謂的限制性酶切圖譜法就是對載體上插入的外源DNA片 段進行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對比，從 而有效地鑒定轉化子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉化子篩 選時，工作量極大，實驗成本也高。,20

27、11-10-23,46,基因克隆操作過程,用BamHI酶切待鑒定菌落的質粒DNA，電泳觀察酶解產(chǎn)物片段。,轉化子：,2.7 kb + 4.0 kb,非轉化子： 2.7 kb 如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好,選用單一切口的酶將質粒線性化，然 后通過其長度來鑒定其是否為轉化子。,2011-10-23,47,基因克隆操作過程,用EcoRI酶切待鑒定菌落的質粒DNA,轉化子： 3.0 kb + 3.7 kb 或1.0 kb + 5.7 kb,用PstI酶切帶鑒定菌落的質粒DNA,轉化子： 3.2 kb + 3.5 kb 或0.8 kb + 5.9 kb,2011-10-23,48,基因克隆操作過程,（2）菌落/噬菌斑原位雜交法,菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基 因或DNA片段的同源序列設計并合成探針，以此篩選含有目的 基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補雜 交是該技術的基本理論依據(jù)。,2011-10-23,49,基因克隆操作過程,菌落原位雜交法的基本操作： 用硝酸纖維素薄膜影印克隆平板； 用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜； 用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜； 80烘干固定影印薄膜； 薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫； 用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜；