PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用.ppt

1、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的原理、操作和應(yīng)用，黃逸煒，湖南省疾病預防控制中心微生物實驗室，什么是聚合酶鏈反應(yīng)，聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈式反應(yīng)，即聚合酶鏈式反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的一種體外核酸擴增技術(shù)，以及聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)的發(fā)展歷史。關(guān)于聚合酶鏈式反應(yīng)的文章首先由美國科學家凱利穆利斯等人在科學雜志上發(fā)表，報道了耐熱DNA聚合酶Taq(一種從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌中提取的耐熱DNA聚合酶)的發(fā)現(xiàn)，標志著分子時代的到來。12月，科學雜志將它所用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993年，凱利穆利斯因發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)獲得諾貝爾化學獎。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理1。遺傳物質(zhì)：核染色體DNA(由脫氧核糖核酸、磷

2、酸鏈和堿基組成)的堿基(A、T、C、G)排列成雙鏈螺旋，堿基序列的長度和排列順序決定了生物的多樣性。例如，人類體細胞中有31億個堿基對。根據(jù)上述0.1%的差異，人與人之間有300萬個堿基對的差異。聚合酶鏈反應(yīng)的基本工作原理是用待擴增的脫氧核糖核酸分子作為模板，用一對與模板互補的寡核苷酸片段作為引物。在脫氧核糖核酸聚合酶的作用下，它按照半保守復制的機制沿著模板鏈延伸，直到新的脫氧核糖核酸合成完成。聚合酶鏈反應(yīng)的基本組分包括七個基本組分：模板脫氧核糖核酸、特異性引物、熱穩(wěn)定脫氧核糖核酸聚合酶、脫氧核苷三磷酸、二價陽離子、緩沖溶液和一價陽離子?；镜姆磻?yīng)步驟是變性-退火-延伸。最后，脫氧核糖核酸用電

3、子束等染料染色，然后用紫外線燈檢測。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理3、重復13個步驟和2535輪，靶基因片段擴增100多萬次，脫氧核糖核酸雙螺旋、脫氧核糖核酸單鏈和引物復性，脫氧核糖核酸變性形成兩條單鏈，亞鏈延伸的脫氧核糖核酸加倍。與聚合酶鏈反應(yīng)相比，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的原理在初始階段增加了步驟：核糖核酸合成，這是一個從單鏈到雙鏈的過程。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)原理1。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)是指在聚合酶鏈反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個聚合酶鏈反應(yīng)過程，最后用標準曲線定量分析未知模板的方法。常用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑：SYBR Green I Taqman水解探針，實時熒光定量聚合酶鏈

4、反應(yīng)原理2?；€是指在聚合酶鏈反應(yīng)擴增反應(yīng)的最初幾個循環(huán)中，熒光信號變化很小，并接近一條直線，這條直線就是基線。光閾值的設(shè)定一般以前15輪聚合酶鏈反應(yīng)的熒光信號作為熒光背景信號，熒光閾值為3-15輪聚合酶鏈反應(yīng)熒光信號標準差的10倍，熒光閾值設(shè)定在聚合酶鏈反應(yīng)擴增的指數(shù)周期內(nèi)。循環(huán)閾值表示當熒光信號達到設(shè)定的閾值時，每個聚合酶鏈反應(yīng)管經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。研究表明，每個模板的CT值與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系。初始拷貝數(shù)越多，聯(lián)系類型值越小，反之亦然。標準曲線可以通過使用具有已知初始拷貝數(shù)的標準來制作，其中橫坐標表示初始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標表示CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標準

5、曲線計算出樣品的初始拷貝數(shù)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)原理3。循環(huán)數(shù)固定后，熒光信號與模板數(shù)的比例越大，熒光達到閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct值)就越少。初始模板的對數(shù)濃度與CT呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值可以計算出樣品中模板的含量。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的優(yōu)勢，優(yōu)勢：是具體的，敏感的，快速，簡單，易于自動化等。由于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的局限性，為了構(gòu)建特異性引物和選擇性擴增特異性的脫氧核糖核酸序列，操作時避免使用氣霧劑，特別注意陽性樣品的處理，使用一次性耗材，戴手套并經(jīng)常更換，在最后一步總是添加核酸，并單獨使用液體。引物設(shè)計合理，Taq酶擴增的錯誤率高，鎂離子濃度約為1/100堿基對/20次循環(huán)對反應(yīng)效率的影響

6、，如儀器穩(wěn)定性、升溫和降溫速率、管道密封性等。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)注重防止核糖核酸降解，以及聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作1 .以逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測流感病毒為例，說明聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作步驟。主要儀器包括聚合酶鏈反應(yīng)儀、實時聚合酶鏈反應(yīng)儀、微量移液器、高速冷凍離心機、電泳儀和電泳槽、凝膠電泳觀察儀或成像系統(tǒng)、生物安全柜等。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的操作2，1。病毒核酸的核糖核酸提取。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)或?qū)崟r逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)3。紫外燈檢測或直接在計算機上讀取結(jié)果，流感病毒核酸提取1，檢測材料QIAGEN公司的Rneasy微型試劑盒(或QIAGEN公司的QIAmp病毒核糖核酸微型試劑

7、盒，具有類似的操作)-巰基乙醇70%乙醇無菌和脫氧核糖核酸，Rnase 1.5ml毫升離心管10l，20l，200l，1000l取樣器和13K可調(diào)槍頭微型冷凍離心機，200l待檢測流感病毒，流感病毒核酸提取2，1。取200微升采樣溶液(鼻拭子、咽拭子、胸腔積液等)。)或病毒培養(yǎng)物(雞胚尿囊液或細胞培養(yǎng)液)，并將其放入1.5毫升Eppendorf試管中。2.依次加入350微升rlt溶液、3.5微升巰基乙醇和550微升70%乙醇，混合均勻。3.將Rneasy微型旋轉(zhuǎn)柱放在干凈的2ml收集管上。從步驟2中吸出600微升混合溶液并將其加入柱中，以12，000轉(zhuǎn)/分的速度離心15秒鐘，將離心液4丟棄在收

8、集管中，將柱放回收集管中，將步驟2中剩余的混合溶液吸到柱中，以12，000轉(zhuǎn)/分的速度離心15秒鐘，丟棄離心液5，并以12，000轉(zhuǎn)/分的速度將700微升洗滌緩沖液RW1溶液加入柱中。離心15秒6。取一個干凈的2ml收集管，將離心后的色譜柱移到新的收集管中，以12000轉(zhuǎn)/分的速度向色譜柱中加入500微升洗滌緩沖液，離心15秒7。丟棄收集管中的離心溶液，然后以13，000-14，000轉(zhuǎn)/分的速度向色譜柱中加入500微升洗滌緩沖液。離心2分鐘。8.將色譜柱移至一個干凈的1.5毫升eppendrof試管中，加入20-50微升不含RNAse的水，在室溫下放置1-3分鐘，轉(zhuǎn)速為9，12，000轉(zhuǎn)/分

9、，離心1分鐘，收集離心液作為提取的病毒Rna。立即進行試驗，或?qū)⑻准４嬖?20以下，作為QIAGEN公司的RNAYS迷你套件(目錄#74104)。注意：在試劑盒中使用視網(wǎng)膜色素上皮溶液之前，應(yīng)加入44毫升無水乙醇，使最終體積達到55毫升。用于擴增H5亞型禽流感病毒的引物序列為：H5-1: 5-gcc att CCA CAA cat ACA CCC-3，H5-: 5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)2，1，分別標記0.2毫升在每個試管中加入以下內(nèi)容：5ul QIAGEN OneStep RT-PCR緩沖液，5 1ul 10mm dntps1ul酶混合

10、物0.13 ul RNase抑制劑(40u/ul) 14.3 ul無RNase水2，加入1 ul引物和5ul未知RNA或5 ul陽性對照或無Rnase水作為陰性對照。一步逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)條件如下：50分鐘30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄：核糖核酸)，95分鐘15分鐘(逆轉(zhuǎn)錄酶失活等)。94變性30秒55退火30秒72延伸30秒回到步驟3，34循環(huán)72 2分鐘，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物檢測1，凝膠電泳緩沖液配方10TBE緩沖液(每升):tris 107.8克硼酸55.0克乙二胺四乙酸(Na2) 8.2克10 tae緩沖液(每升):Tris48.4g克冰醋酸11.42克0.5摩爾/升乙二胺四乙酸20毫升1.5

11、%瓊脂糖凝膠用電泳緩沖液制備，和88在100伏下電泳30分鐘，紫外線觀察和照片記錄。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物檢測2、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴增產(chǎn)物檢測及結(jié)果判斷、實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作1、病毒核酸核糖核酸提?。号c逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)相同實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：以皮吉公司禽流感檢測試劑盒為例，根據(jù)試劑盒操作說明，25l反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)溶液15l、Taq酶0.25l、N/4逆轉(zhuǎn)錄酶(N為聚合酶鏈反應(yīng)管數(shù))、10L待測核糖核酸、添加核糖核酸后400g反應(yīng)條件為：4230分鐘；923分鐘；9210秒、4530秒和721分鐘的5次循環(huán)；92 10秒，60 30秒40 40周期，60點鐘設(shè)置收

12、集熒光。實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)操作2，設(shè)置結(jié)果分析條件，讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則是閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，結(jié)果顯示為陰性；或者可以根據(jù)儀器的噪音進行調(diào)整。循環(huán)閾值表示當熒光信號達到設(shè)定的閾值時，每個聚合酶鏈反應(yīng)管經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。研究表明，每個模板的CT值與模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系。初始拷貝數(shù)越多，聯(lián)系類型值越小，反之亦然。標準曲線可以通過使用具有已知初始拷貝數(shù)的標準來制作，其中橫坐標表示初始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標表示CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，就可以從標準曲線計算出樣品的初始拷貝數(shù)?；€是指在聚合酶鏈反應(yīng)擴增反應(yīng)的最初幾個循環(huán)中，熒光信號變化很小，并接近

13、一條直線，這條直線就是基線。光閾值的設(shè)定一般以前15輪聚合酶鏈反應(yīng)的熒光信號作為熒光背景信號，熒光閾值為3-15輪聚合酶鏈反應(yīng)熒光信號標準差的10倍，熒光閾值設(shè)定在聚合酶鏈反應(yīng)擴增的指數(shù)周期內(nèi)。實時聚合酶鏈反應(yīng)操作3，結(jié)果判斷1，質(zhì)量控制標準1.1，陰性對照的檢測結(jié)果為陰性。1.2陽性對照的Ct值應(yīng)小于或等于28.0。否則，這個實驗將被視為無效。2.結(jié)果無CT值的2.1例為陰性。2.2值為30.0的樣本為陽性。2.3Ct值大于30.0的樣品建議重做。如果重做結(jié)果中沒有值，它將為負，否則為正。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、法醫(yī)個體鑒定和親子鑒定等基因克隆、測序和表達、遺傳病檢測、腫瘤診斷、病原體檢測、基

14、因克隆和表達、DNA指紋技術(shù)1。1984年，英國遺傳學家亞歷克杰弗里斯在研究肌紅蛋白的脫氧核糖核酸序列時，意外發(fā)現(xiàn)一小段脫氧核糖核酸在無功能的脫氧核糖核酸(不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的脫氧核糖核酸)上重復。這個包含約15個堿基的DNA片段在不同個體間重復的頻率和位置有明顯的差異。杰弗里斯首先研究了自己的基因，并驗證了這項技術(shù)。如果我們有血緣關(guān)系，這些差異就會大大減少。杰弗里斯將這項技術(shù)命名為DNA指紋技術(shù)。DNA指紋技術(shù)2，采集血樣(毛發(fā)、精液、口腔粘膜細胞)，分離DNA，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增所選DNA片段，比較它們，并進行統(tǒng)計分析，我們可以得到它是否是兇手或是否與血液有關(guān)。分子診斷學以分子生物學理論為基礎(chǔ)

15、，運用分子生物學的技術(shù)和方法，研究人類內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子系統(tǒng)的存在、結(jié)構(gòu)或表達調(diào)控的變化，為疾病的預防、預測、診斷、治療和預后提供信息和決策依據(jù)。在分子診斷學的發(fā)展階段，分子診斷學經(jīng)歷了三個階段：(1)通過DNA分子雜交對遺傳病進行遺傳診斷；(2)基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的脫氧核糖核酸診斷，特別是定量聚合酶鏈反應(yīng)和實時聚合酶鏈反應(yīng)的應(yīng)用，不僅可以檢測宿主體內(nèi)存在的各種脫氧核糖核酸和核糖核酸病原體的載量，還可以檢測多基因遺傳病細胞中的基因表達。(3)以生物芯片技術(shù)為代表的高通量密集檢測技術(shù)分子診斷的發(fā)展方向：(1)分子診斷的內(nèi)容已經(jīng)從傳統(tǒng)的脫氧核糖核酸診斷發(fā)展到對核酸及其表達產(chǎn)物(基因和蛋白質(zhì))的綜合診斷；(2)分子診斷策略已經(jīng)從分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到多種技術(shù)有機結(jié)