高效液相色譜儀10018.ppt

1、高 效 液 相 色 譜,2010/8/21,一、高效液相色譜儀,Agilent 1100,Waters 2487,借助氣相色譜的理論演變,二、高效液相色譜法的特點(diǎn),經(jīng)典的柱色譜,高效液相色譜的模塊,20世紀(jì)70年代后發(fā)展迅速，它在技術(shù)上采用高壓泵，高效固定相和高靈敏度的檢測器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快，分離效率高和操作自動化。 特點(diǎn)：高壓、高效、高速 分離對象：適用高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣分離分析 （與GC區(qū)分）,三、流程及主要部件,流程,2. 主要部件,(1)高壓輸液泵,單元泵,雙 元 泵,高壓泵作用：輸送流動相。 也即是貯液瓶中的有機(jī)溶劑或緩沖溶液靠高壓泵送入色譜柱。由于色譜柱的阻力很大，高

2、壓泵必須克服阻力以恒定流速輸送流動相，這是保證色譜儀精確度的前提。 常用的壓力范圍：150350105 Pa 歐美等國家習(xí)慣使用psi作單位 PSI英文全稱為Pounds per square inch。 定義為英鎊/平方英寸， 它們之間的換算關(guān)系為： 1bar14.5psi =105Pa ， 145psi = 1Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar,高壓泵應(yīng)具有以下性能 流量穩(wěn)定，精度在1%左右 輸出壓力高，通常2030MPa，最高50 MPa 流量范圍寬，一般在0.0110mL/min范圍內(nèi) 能抗溶劑腐蝕 壓力波動小、更換溶劑方便、容易清洗、具梯度洗脫 操作方便、容

3、易維修,根據(jù)泵的操作原理不同，分為恒壓泵和恒流泵 氣動放大泵（恒壓泵） 往復(fù)泵（恒流泵）是目前液相色譜使用最普遍的一種 高 壓泵。其中又分單頭往復(fù)泵和雙頭往復(fù)泵。 往復(fù)泵的優(yōu)點(diǎn)是泵頭內(nèi)腔體積小，容易洗凈，故更換 溶劑十分方便，尤其適合做色譜條件試驗(yàn)時使用。,氣動放大泵,往復(fù)柱塞泵,(2) 進(jìn)樣裝置 手動進(jìn)樣閥通常使用耐高壓的六通閥 (美國Rheodyne 公司專利技術(shù))， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,進(jìn)樣裝置 （正面）,進(jìn)樣裝置 （背面）,圖中a為進(jìn)樣閥處于“裝樣load”位置的情況，此時流動相直接進(jìn)入色譜柱， 樣品注入口與樣品環(huán)連接，用微量進(jìn)樣針將一定體積的樣品溶液從樣品 注入口注入，裝于樣品管內(nèi)。當(dāng)

4、將扳手扳至“進(jìn)樣inject”位時，進(jìn)樣閥的 流路發(fā)生了改變，流動相通過樣品管，將注入的樣品帶入色譜柱進(jìn)行分析。 六通進(jìn)樣閥具有使用方便，進(jìn)樣量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。,樣品環(huán)(Loop) 規(guī)格：有10L、20L、50L等不同容積， 可以根據(jù)需要選配。 作用：用來貯液，也用來測量樣品溶液的體積。 將樣品環(huán)裝滿后進(jìn)樣，進(jìn)樣量即為樣品環(huán)的容積，此種進(jìn)樣方式稱為“滿環(huán)進(jìn)樣”或“定量環(huán)進(jìn)樣”。 用定量環(huán)進(jìn)樣精密度好，在使用外標(biāo)法時，應(yīng)使用此種操作方式。,自動進(jìn)樣器,色譜柱是高效液相色譜的心臟，在HPLC的使用中， 保持色譜柱的柱效，延長柱子的使用壽命非常重要。,（3） 色譜柱,色譜柱流速方向,色譜柱的參數(shù),色譜柱

5、（Column） 結(jié)構(gòu)：柱管多用不銹鋼制成，色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有 篩板，目的是防止填料漏出。 填料：多以硅膠為基質(zhì)，適用PH 28 粒度多為0.220 m(以510m居多) 。 發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 規(guī)格：常規(guī)分析柱(常量柱) 內(nèi)徑25mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱長1030cm (15cm，25cm居多） 制備柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制備柱（5mm，7.8mm、9.8mm、10mm）,C18柱（C8柱）,主要是由于修飾到硅膠上的硅烷化 試劑不同。 C8是修飾的帶8個碳原子的硅烷， C18是修飾的帶18個碳原子的硅烷。,C18較C8極性小，

6、C18更適合分析中等到小極性的化合物， C8更適合中等偏大極性 化合物。,C18柱（C8柱）性能影響因素,正相柱：固定相通常為硅膠以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基(NH2)和 氰基(CN)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他極性基 團(tuán)極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組分的極性大小，即 極性較弱的組份最先被沖洗出色譜柱；正相色譜使用的流動相極性相 對比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。反相柱：固定相通常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱官能團(tuán)的 鍵合相。反向色譜所使用的流動相極性較強(qiáng)，通常為水、緩沖液與甲 醇，乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)的組分最

7、先被 沖洗出，而極性弱的組分會在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。,正相柱和反相柱,預(yù)柱和保護(hù)柱,從泵來的流動相,預(yù)柱,進(jìn)樣口,保護(hù)柱,分析柱,檢 測 器,預(yù)柱是針對流動相來保護(hù)色譜柱 保護(hù)柱是針對樣品來保護(hù)色譜柱,precolumn預(yù)柱，guard column保護(hù)柱 安裝位置不同：預(yù)柱是泵后進(jìn)樣口前，途經(jīng)流動相；保護(hù)柱是進(jìn)樣口后分析柱前，途經(jīng)樣品和流動相。作用不同：預(yù)柱則只能起到過濾顆粒物作用，防止顆粒物堵塞色譜柱篩板引起柱壓升高。保護(hù)柱除了可以過濾顆粒物外，因?yàn)閹?厘米長的填料，強(qiáng)保留物質(zhì)就先留在保

8、護(hù)柱的柱芯填料里面，這樣可以避免色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染。,(4) 液相色譜檢測器,分類 按檢測原理： 光學(xué)檢測器（如紫外、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射） 熱學(xué)檢測器(如吸附熱） 電化學(xué)學(xué)檢測器（如庫倫、安培） 電學(xué)檢測器（電導(dǎo)、介電常數(shù)） 按測量性質(zhì)： 通用型檢測器（如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器） 專屬型檢測器（如紫外、熒光檢測器） 按檢測方式： 濃度型檢測器 質(zhì)量型檢測器,著重介紹四種檢測器：紫外檢測器（光電二極管陣列檢測器）、 示差折光檢測器、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器,工作原理：基于朗伯-比爾定律。 即用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。 它具有波長

9、固定，波長可變和光電二極管陣列三種類型。,紫外檢測器(UVD)： 應(yīng)用最廣泛的選擇性檢測器。,雙波長紫外檢測器 2487,特點(diǎn)：選擇性檢測器， 靈敏度較高（10-9g）， 噪音低。 線性范圍寬， 對流速和溫度波動不靈敏， 適用于梯度洗脫。,光電二極管檢測器（PDA）,缺點(diǎn)：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)。 而且對流動相也有一定的限制， 即流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。,在使用紫外檢測器時，檢測波長與所用溶劑的截止波長接近（或低于截止波長）時，容易產(chǎn)生噪音干擾，從而影響檢測結(jié)果。,所以在使用紫外檢測器時，檢測波長應(yīng)至少比所用溶劑的截止波長大20nm以上。,截止波長,原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折

10、射率之差來 測量試樣濃度的檢測器。 特點(diǎn)：通用性檢測器； 對溫度變化比較敏感，要保持在0.001 （需配柱溫箱使用） ； 靈敏度低(10-6g)； 不能用于梯度洗脫。,b. 示差折光檢測器 (RID),原理: 利用某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光(熒光) 的性質(zhì)進(jìn)行檢測。 許多藥物和生命活性物質(zhì)(多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等)具有天然熒光，能直接檢測。,c. 熒光檢測器 (FLD),特點(diǎn): 選擇性檢測器， 靈敏度比紫外檢測器高2-3個數(shù)量級， 可達(dá)到 10-12g； 選擇性好，對流量和溫度敏感性低。 缺點(diǎn)：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測。 通過

11、熒光衍生化可以使本來沒有熒光的化合物轉(zhuǎn)變 成熒光衍生物，從而擴(kuò)大了熒光檢測器的應(yīng)用范圍。,工作原理:通過檢測光散射程度而測定溶質(zhì)濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣(氮?dú)?噴成霧狀液滴，再進(jìn)入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶質(zhì)的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質(zhì)顆粒的大小與數(shù)量。,d. 蒸發(fā)光散射檢測器 (evaporative light-scatting detector, ELSD),適用范圍：適用檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類，高級脂肪酸，磷脂， 維生素，氨基酸，甘油三酯及甾體等。 特點(diǎn)：通用型檢

12、測器，對各物質(zhì)有幾乎相同的響應(yīng)。 消除溶劑的干擾，不受溫度變化影響， 靈敏度比較低（尤其對有紫外吸收的組分） 流動相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽等。,四、液相色譜的流動相,流動相特性 液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變各組分分離狀況。 親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,2. 流動相類別 按流動相組成成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：

13、固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 正己烷、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、異丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑， 若組分的保留時間短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑， 使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小),3

14、. 流動相選擇,4. 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題 液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點(diǎn)：,流動相對樣品具有一定的溶解能力， 保證樣品組分不會沉淀在柱中 ( 或長時間保留在柱中 ) 。 流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) ( 特殊情況除外，如配位色譜等 ) 流動相的黏度要盡量小，以便降低柱壓，延長色譜柱 使用的壽命 避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。 如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用 UV 檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。 流動相沸點(diǎn)不要太低，否則

15、容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法 正常進(jìn)行。 在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相 中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量 氧與樣品發(fā)生作用。 盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。,溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、 儀器起到作用，消除由于污染對分析結(jié)果的影響。 對色譜柱：由于填料顆粒很細(xì)，色譜柱內(nèi)腔很小， 溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱和毛細(xì)管容易堵塞。 對儀器：溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內(nèi)的藍(lán)寶石活塞桿和活塞的磨損。,5. 流動相過濾,流動相在混合前分別濾過，特別要注意分清有機(jī)相濾膜和

16、水相濾膜。有機(jī)相濾膜一般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水溶液時流速低或?yàn)V不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴(yán)禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。,流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準(zhǔn)確 輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小 保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比增加 溶劑的紫外吸收本底降低 保護(hù)色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化,6. 流動相的脫氣,常用的脫氣方法,氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度 比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。 加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣

17、法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min。 在線真空脫氣法（實(shí)時在線脫氣，效果好）,五、HPLC應(yīng)用,1. 分析方法如何建立？ 色譜柱和檢測器的選擇 根據(jù)被分離物質(zhì)性質(zhì)選擇；參考文獻(xiàn)類似物質(zhì) 疏水性的樣品反相鍵合色譜； 親水性的樣品正相鍵合色譜； 流動相組成,配比,流量,梯度洗脫的選擇 根據(jù)分析樣品的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定流動相組成。 為達(dá)到較好的分離效果，確定流動相配比。 當(dāng)樣品中溶質(zhì)組分較多及不同溶質(zhì)的性質(zhì)差別較大時，考慮梯度洗脫。 當(dāng)分析弱酸，弱堿性化合物時，可通過采用緩沖溶液及加醋酸、三乙 胺等調(diào)節(jié)流動相 的pH值來改善峰型。,樣品組分保留值和容量因子的選擇 分

18、析時間最好控制在1030min 容量因子控制在110；對于容量因子范圍較寬的通常使用梯度洗脫技術(shù)。 相鄰組分分離度的要求： 對于難分離的樣品，要求分離度R1.0 樣品分析方法 流動相的準(zhǔn)備 過濾：用孔徑為0.22m（0.45m)濾膜過濾除去固體顆粒雜質(zhì)。脫氣：超聲脫氣，吹氦脫氣，抽真空脫氣法，在線真空脫氣法 樣品的準(zhǔn)備稱量，用流動相超聲溶解，過濾或高速離心,2. 應(yīng)用領(lǐng)域 目前，HPLC在有機(jī)化學(xué)、生化、醫(yī)學(xué)、藥物臨床、化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的用途，而在生物和高分子試樣的分離和分析中更是有明顯優(yōu)勢。 在目前已知的有機(jī)化合物中，若事先不進(jìn)行化學(xué)改性， 只有20的化合物

19、用氣相色譜法可以得到較好的分離， 而80的有機(jī)化合物需HPLC分析。因此，HPLC具有非 常廣闊的應(yīng)用前景。,作為人工合成藥物的精制手段，用于除去少量雜質(zhì) (手性色譜柱以及配位色譜法) 從一些復(fù)雜的混合物中排除干擾物質(zhì)，并分析其中微量成分 中草藥有效成分的制備和分析 環(huán)境監(jiān)測和污染物的分析 食品中營養(yǎng)成分和物質(zhì)的分析 手性分離技術(shù)目前已成為高效液相色譜十分重要和熱門的應(yīng)用領(lǐng)域,例1. 環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 50m) 流動相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑) 檢測器：差示折光檢測器 可對水果、蔬菜中 的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。,

20、例2 稠環(huán)芳烴的分析 固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動相：20%甲醇-水 100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 C 柱 壓：7 105 Pa 檢測器：紫外檢測器 稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,六、儀器保養(yǎng),（1）手柄處于Load和Inject之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位，過高的壓力引起柱頭損壞，所以應(yīng)盡快轉(zhuǎn)動閥，不能停留在中途。 （2）在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。,1.六通閥進(jìn)樣器的保

21、養(yǎng),（3）使用定量環(huán)的定量：六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。 使用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75%，如20L的定量環(huán)最多進(jìn)樣15L的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同； 使用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20L的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100L的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。,（4）進(jìn)樣樣品要求無微粒和能阻死針頭及進(jìn)樣閥的物質(zhì)，樣品溶液均要用0.45 m (0.22m) 的濾膜過濾。防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對進(jìn)樣閥的磨損。 為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常

22、用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側(cè)。,（1）色譜柱的平衡 反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。 一定確保所使用的流動相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運(yùn)輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前，應(yīng)使用1020倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過渡”。 切忌直接用甲醇置換緩沖液,2. 色譜柱的維護(hù)與保養(yǎng),硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。 如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請?jiān)谑褂昧鲃酉嘀坝?乙醇或異丙醇平衡 每天用足夠的時間來平衡色譜柱，一定要做！ 如何平衡？ 平衡過程中，將流速緩慢地提高；用流動相平衡色譜柱直至 獲得穩(wěn)定的基線,表1建議用來沖洗的溶劑體積