DNA的瓊脂糖凝膠電..ppt

1、DNA的瓊脂糖凝膠電泳,組員：黎振威 成波 程星星 劉世杰,瓊脂糖,瓊脂糖是線性的多聚物，基本結構是1,3連結的-D-半乳呋喃糖和1,4連結的3,6-脫水-L-半乳呋喃糖。瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質混合物。瓊脂糖在水中一般加熱到90以上溶解，溫度下降到35-40時形成良好的半固體狀的凝膠，這是它具有多種用途的主要特征和基礎。瓊脂糖凝膠性能通常用凝膠強度表示。強度越高，凝膠性能越好。,瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別,瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂果膠組成的。瓊脂糖的結構單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質混合物。它們的結構相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠

2、能力差。在瓊脂糖制備過程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團，就會造成電內滲，電內滲對質點的移動產生影響。質量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下。瓊脂糖是從瓊脂中精細提取的，有自身獨特的性質，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。,實驗目的,掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的原理和方法。,瓊脂糖凝膠電泳技術,特點： （1）操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進行電泳。 （2）瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大（約占98%99%），近似自由電泳，樣品擴散較自由，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。 （3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外

3、光燈檢測及定量測定。 （4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。,實驗原理,DNA分子在瓊脂糖中泳動時有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。在pH=8.08.3時，核酸分子中的堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，分子大小和構象不同的核酸分子的遷移率呈現(xiàn)較大的差異，從而達到分離核酸片段，檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。,影響DNA分子遷移速率的因素,1.DNA分子大小 2.DNA分子構象 3.瓊脂糖的濃度 4.電壓強度大小

4、5.離子強度大小 6.嵌入染料的存在(溴化乙錠),實驗器材與試劑,器材：板式平板電泳槽、電泳儀、微波爐、紫外透射儀。 試劑（1）6X上樣緩沖液：含0.25%溴酚藍、 0.25%二甲苯青、30%甘油的TBE緩沖液。 （2）5XTBE電泳緩沖液（0.45mol/L Tris-硼酸、0.01mol/L EDTA，pH=8.3)：稱取54g Tris堿、27.5g硼酸、 3.7g EDTA-Na22H20，溶于800mL蒸餾水中，定容至1000mL. 使用時用蒸餾水稀釋10倍成為0.5XTBE電泳緩沖液。 （3）瓊脂糖。 （4）溴化乙錠（EB）10mg/ml:取EB0.10g，完全溶解于10ml水中，

5、避光室溫保存。 （5）DNA分子量標準品 （6）DNA樣品液。,實驗操作,（1）制備瓊脂糖凝膠 稱取0.6g瓊脂糖粉，放入錐形瓶中，加入60ml0.5XTBE電泳緩沖液，置于微波爐或水浴中加熱熔化，取出搖勻即為1%瓊脂糖凝膠液。待凝膠液冷卻至60度后加入溴化錠3ul，使其終濃度為0.5ug/ml。 （2）膠板的制備 在制膠槽內插入樣品梳，將凝膠液倒入制膠槽中。待膠凝固后，取出梳子，將內槽放入電泳槽中，加入TBE緩沖液至槽中，使其沒過凝膠表面12mm，排出加樣孔中的氣泡。 （3）加樣 用移液器將DNA樣品液5ul與5X上樣緩沖液1ul混勻后加入加樣孔，記錄點樣順序。其中一個加樣孔中加入DNA分子

6、量標準品6ul。 注意：加樣時需將槍頭伸入加樣內再排出樣品，以免樣品從凝膠表面擴散；加樣時，槍頭不要穿刺孔底或碰壞凝膠孔壁，否則將導致樣品從凝膠底部滲出或DNA帶型不整齊。,（4）電泳 接通電泳槽與電泳儀之間的電源（切忌DNA樣品由負極往正極泳動）。調節(jié)電壓U=5V/cmX正、負極間的距離（cm），開始電泳。 （5）實驗結果的觀察 在紫外透射儀上觀察電泳帶及其位置，用300nm(波長太長靈敏度不夠，太短對DNA損傷嚴重)左右波長的紫外線照射，DNA存在處應顯出橘紅色熒光條帶。照相記錄實驗結果。,注意事項,（1）倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60C，否則溫度太高會使制膠板變形。 （2）膠一定要凝

7、固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點樣孔。 （3）點樣時槍頭下伸，點樣孔內不能有氣泡，不要刺穿凝膠。 （4）溴化乙錠見光易分解，應置于棕色瓶內于4C下保存。溴化乙錠在紫外燈下放置時間過長，熒光會猝滅。 （5）溴化乙錠是強致突變劑，操作中切勿用手接觸，應戴一次性手套操作，避免污染實驗臺面。,思考題,（1）瓊脂糖與瓊脂有什么不同？本次實驗為何選瓊脂糖作電泳介質？ 答：瓊脂糖是用來做核酸電泳的，瓊脂是用于組織培養(yǎng)做固化劑的，兩者都有固化作用，不過瓊脂是一個簡單的固化支撐作用，而瓊脂糖在特定緩沖體系中形成孔狀結構用于大分子的分離。所以選瓊脂糖作為電泳介質。 （2）上樣緩沖液由哪些成分組成？各有何作用？ 答：溴酚藍，二甲苯青和TBE。 溴酚藍是一種pH指示劑，在pH3.04.6內由黃變藍。二甲苯青用于瓊脂糖聚凝膠電泳的示蹤染料, 易溶于水和醇 ,在瓊脂糖凝膠電泳中可與溴酚藍按照一定比例配置. TBE的緩沖容量小，但是溶解性能好，可以配成高濃度儲備液，使用方便。 （3）常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液有哪些？為何在這些電泳緩沖液中要加入EDTA？ 答：核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 與 TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA片段回收時含磷酸鹽濃度高，容