真核基因在大腸桿菌中的表達.ppt

1、真核基因在大腸桿菌中的表達,琚 春 梅 華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物教研室 2006-11-30,基因與基因工程 基因操作的主要技術原理 基因克隆的酶學基礎 基因克隆的載體 基因的分離與鑒定 基因的表達與調(diào)節(jié),已講述的內(nèi)容,講述的內(nèi)容提綱,真核基因的大腸桿菌表達體系 大腸桿菌的表達載體 真核基因在大腸桿菌中的表達 影響真核基因表達效率的因素,第一節(jié) 真核基因的大腸桿菌表達體系,1. 大腸桿菌表達體系,基因工程的重要目標 制備大量純化的蛋白質產(chǎn)物 因此，要選擇能高水平表達異源真核蛋白的表達系統(tǒng) 目前常用的表達系統(tǒng) 細菌（大腸桿菌）、酵母、昆蟲細胞、植物和哺乳動物細胞等,背景清楚，特別是對其基因工程

2、表達調(diào)控的分子機理研究的比較深入。 安全，且有多種不同的菌株和質粒載體。 已有許多真核基因在大腸桿菌中實現(xiàn)高效表達。 培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，因此易于進行批量生產(chǎn),大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)越性,真核基因與原核基因的差別：編碼基因的不連續(xù)性，含有內(nèi)含子序列，大腸桿菌不具備對pre-RNA進行加工剪接的能力。 轉錄信號的不同：真核基因轉錄的mRNA不具備結合細菌核糖體所必須的SD序列；細菌的RNA聚合酶不能識別真核啟動子。 真核基因mRNA 5-端有帽子結構，3-端有poly(A)尾巴，影響其穩(wěn)定性及與細菌核糖體結合的能力，從而阻礙正常的轉錄和翻譯。,真核基因在大腸桿菌中表達存在許多障礙,解決方

3、案,將克隆的真核基因插入到原核啟動子的下游。 從真核細胞中分離完整加工的mRNA，采用反轉錄合成cDNA，并連接到合適的載體上，可以克服內(nèi)含子問題。 如果知道蛋白質的氨基酸序列，且分子量不太大，可以用化學方法合成不含內(nèi)含子序列的寡聚核苷酸片斷。 對于細菌中能降解真核蛋白的蛋白酶，可以通過突變的方法消除。,許多真核基因的蛋白質產(chǎn)物存在翻譯后的修飾過程：磷酸化、糖基化等，大腸桿菌中無此過程，因此，表達的蛋白無法正確折疊，由此產(chǎn)生的三級結構通常是不可溶的，常形成包涵體，無活性。 表達的真核蛋白質被細菌的蛋白酶識別并降解。,真核基因在大腸桿菌中表達存在許多障礙,2. 克隆基因正確表達的基本條件,最基本

4、條件：能夠進行正常的轉錄和翻譯 轉錄：真核基因置于原核啟動子的下游 3-末端具有轉錄終止子 翻譯： mRNA分子具有RBS（ribosome binding site） 包括AUG或GUG和與16S rRNA 3-末端互補的 SD（Shine-Dalgarno）序列。,另一個重要條件：編碼的蛋白質產(chǎn)物應能維持正常的穩(wěn)定性。 表達蛋白被大腸桿菌蛋白酶降解。 蛋白質三級結構形成的速率與其穩(wěn)定性有關。 蛋白質三級結構的正確形成需要分子伴侶的參與。 大腸桿菌不可能對所有外源蛋白都存在正確的分子伴侶。,第二節(jié) 大腸桿菌的表達載體,大腸桿菌表達載體的基本結構特征,1. 表達載體的基本成分,啟動子：影響外源

5、基因的表達水平 使外源基因高水平表達必須具備的條件： 強啟動子 啟動子呈現(xiàn)一種低限的基礎轉錄水平：表達的外源蛋白可能對寄主細胞不利。 誘導型啟動子：能通過簡單的方式使用廉價的誘導物使外源基因獲得表達，如IPTG、溫度等。,轉錄終止子 上游啟動子會抑制下游啟動子的轉錄功能(啟動子封堵作用)，因此需要在克隆基因編碼區(qū)的3-末端接上一個有效的轉錄終止子。 轉錄終止子能增強mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質產(chǎn)物的水平。,翻譯起始序列：決定mRNA的翻譯起始效率。 未鑒定出其保守結構，只能采取一些方法降低mRNA 5-末端二級結構的形成，增加RBS中A、T含量，堿基定點突變等。 增強子：特殊的序列元件

6、，能顯著增強外源基因的表達效率。,翻譯終止子：必須存在終止密碼子。 構建表達載體時通常裝上全部的三個終止密碼子 (UAA,UGA,UAG)，以阻止核糖體的跳躍現(xiàn)象。 大腸桿菌最偏愛的密碼子：UAA 當為四聯(lián)核苷酸UAAU時，終止效率進一步增強。,2. 常用的大腸桿菌表達載體,lac啟動子的表達載體,乳糖操縱子結構模型,有乳糖存在時,lac操縱子受lac阻遏物的負調(diào)節(jié)。 培養(yǎng)基中缺乏乳糖或其它誘導物時， lac阻遏物同操縱單元結合，關閉乳糖操縱子的活動。 培養(yǎng)基中加入乳糖或其它誘導物(IPTG)時，同阻遏物結合，使乳糖操縱子去阻遏。 因此，我們可以通過加入IPTG誘導來實現(xiàn)外源基因的表達。,la

7、c操縱子的控制區(qū)，包括核糖體結合區(qū)、RNA聚合酶結合區(qū)及阻遏物結合區(qū)都位于長203bp的HaeIII片斷上。 203bp的HaeIII片斷含有l(wèi)ac啟動子、操縱單元及-半乳糖苷酶的前8個密碼子。 可以將該片斷插入到質粒中，構建含有l(wèi)ac啟動子的質粒表達載體。,這種多拷貝質粒中的操縱單元可以把大腸桿菌中所有的lac阻遏物都結合掉，使細菌染色體的-半乳糖苷酶基因解抑制。 含有質粒載體（lac啟動子、操縱單元）的大腸桿菌能夠合成-半乳糖苷酶，因此菌落在加有X-gal(底物)的瓊脂平板上呈藍色。 這種顯色反應可用來快速鑒定陽性克隆。,trp啟動子的表達載體,Trp 高時,Trp 低時,mRNA,O,P

8、,trpR,調(diào)節(jié)區(qū),結構基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,色氨酸操縱子,色氨酸不是作為誘導物，而是作為輔阻遏物結合trp阻遏分子。 被色氨酸激活的trp阻遏分子同操縱單元結合后，就使得RNA聚合酶失去同trp啟動子結合的機會，從而關閉trp基因的轉錄。 因此，當色氨酸濃度低時，trp基因轉錄才能開始。,將trp操縱子插入到質粒載體中，可以構建含有trp啟動子的表達載體。 這種載體轉化大腸桿菌后，經(jīng)3-吲哚丙烯酸誘導，可使外源基因獲得高效表達。 該表達載體優(yōu)點：表達蛋白產(chǎn)量高于lac操縱子表達系統(tǒng)。,PL啟動子的表達載體,來源于噬菌體，是一種最廣泛使用的大腸桿菌表達載體的啟動子之一。 受阻遏

9、基因cI編碼蛋白的正調(diào)控。cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因，即cI857。 cI857或存在于大腸桿菌染色體上，或存在于相容性的質粒分子上。,cI阻遏蛋白在42時失活，因此大腸桿菌在42培養(yǎng)時， PL啟動子啟動轉錄；而在28-30 培養(yǎng)時， cI阻遏蛋白有活性，使PL啟動子處于抑制狀態(tài)，轉錄停止。 利用這一特性，我們只要簡單地改變培養(yǎng)溫度，就可以誘導或關閉PL啟動子的活性。 將PL啟動子克隆到質粒載體上，可以構建由PL啟動子啟動的表達載體。,第三節(jié) 真核基因在大腸桿菌中的表達,1. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位,細胞質中表達：易形成包涵體 包涵體：由不可溶性蛋白聚集折疊形成，是外源基因高

10、效表達時常發(fā)生的一種特殊生理現(xiàn)象。 包涵體形成的理化參數(shù)：對E. coli 80種蛋白研究獲得。 電荷的平均數(shù)、形成轉角的氨基酸殘基的組分、半胱氨酸的組分、脯氨酸的組分、親水性和氨基酸殘基的總數(shù)。,分析蛋白質的氨基酸組分可以預測包涵體形成的概率。 每種氨基酸出現(xiàn)在各種二級結構中的傾向或者頻率不同。 例如：Glu(谷aa)主要出現(xiàn)在螺旋中 Asp(天冬aa)和Gly(甘aa)主要分布在轉角中 Pro也常出現(xiàn)在轉角中，但一般不會出現(xiàn)在螺旋中,表達蛋白形成包涵體的優(yōu)缺點： 優(yōu)點：易于分離 蛋白被保護而免受胞內(nèi)酶的降解 蛋白質沒有活性，不會對寄主細胞造成傷害 缺點：很難恢復生物學活性 蛋白質的終產(chǎn)量低

11、,解決方案：限制包涵體的形成 外源基因與分子伴侶共表達 分子伴侶：能夠阻止聚合作用而使蛋白質正確折疊。 使用硫氧還蛋白缺陷的寄主菌株 目的：維持有利的氧化還原電位 低溫誘導，降低蛋白質的合成速率 與高可溶性的多肽融合表達,周質中表達 優(yōu)點：周質中細胞蛋白少，有利于外源蛋白的純化。 周質中的氧化環(huán)境有利于蛋白質的正確折疊。 周質中蛋白質的降解作用小。 條件：需要信號肽的引導，使表達蛋白由細胞內(nèi)膜轉 運到周質。 信號肽：有原核的信號肽，也有真核的信號肽。,蛋白轉運過程相當復雜 蛋白質跨膜過程還與細胞的結構特征有關。 即使存在信號肽，也不能保證蛋白正確轉運到周質中。 如：免疫球蛋白與T-細胞受體分子

12、結構相似。 免疫球蛋白可以在周質中表達。 T-細胞受體不能在周質中表達。,細胞外表達：易于分離純化，但相當困難。 原因：細菌細胞有兩層膜，即內(nèi)膜和外膜，表達蛋白 需跨越兩層膜屏障。 解決方案： 利用大腸桿菌固有的途徑：將外源蛋白與 E. coli分泌型蛋白融合表達。 增加E. coli細胞外膜的滲漏性：信號肽序列、透化劑、與細菌素釋放蛋白或具透化作用的基因共表達。,2. 融合蛋白的表達,融合基因的概念：具有來自兩個或兩個以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。 DNA體外重組構建的融合基因： 外源基因與啟動子融合：編碼產(chǎn)物不一定是融合蛋白。 兩個或以上不同基因的編碼序列組成的融合基因：編碼產(chǎn)物為單

13、一的多肽序列，稱為融合蛋白、雜種蛋白、嵌合蛋白。,融合蛋白質配偶體 作用：阻止包涵體的形成 改善蛋白質的折疊性能 限制蛋白酶的酶解 簡化蛋白質的檢測與純化程序 種類：GST、His6、MBP等,表達融合蛋白的策略 用融合載體表達融合蛋白質：在設計時注意外源基因與靶基因連接后仍保持正確的讀碼框。,BamHI, SmaI, EcoRI, XbaI, NcoI, SalI XhoI, SacI, HindIII,用融合載體組合表達融合蛋白質：在克隆外源基因時，不用考慮讀碼框問題。,用pBR322質粒載體表達融合蛋白質 pBR322質粒載體中含有唯一的PstI位點 用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶和dGTP

14、或dCTP進行同聚物加尾。 G、C配對，T4 DNA連接酶連接后，總有一部分具有正確的讀碼結構。,融合蛋白的純化： 利用與融合蛋白中的配偶體相對應的配體作為吸附劑，制備親和層析柱。 通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白被滯留下來，其它蛋白則流出柱外。 通過洗脫處理，可回收到純化的融合蛋白。,融合蛋白的切割：配偶體的存在可能影響融合蛋白的功能。 方法： 化學切割：如溴化氰特異切割甲硫氨酸殘基，AUG不是起始密碼子時編碼，適合鏈內(nèi)不含甲硫氨酸殘基的多肽的切割。,酶切割：如凝血因子Xa，在融合基因之間插入編碼Xa的識別序列，融合蛋白純化后可用Xa切除大腸桿菌的多肽，得到天然的目標蛋白。,3

15、. 外源蛋白在大腸桿菌中的穩(wěn)定性,影響因素： 蛋白的酶解作用：細菌細胞的蛋白酶能選擇性地酶解異常蛋白質，包括外源蛋白。 解決方案：外源蛋白在周質或胞外表達 使用蛋白酶缺陷的菌株 低溫培養(yǎng)、與分子伴侶共表達 消除蛋白酶切割位點、目標蛋白的疏水性修飾,結構決定因子：N-氨基酸性質及內(nèi)部的PEST序列 N-端法則：N-端為精aa、賴aa、亮aa、苯丙aa、酪aa、色aa時，蛋白質的穩(wěn)定性差。 N-端附近的內(nèi)部賴aa是遍在蛋白質的受體，易受依賴于遍在蛋白質的蛋白酶降解。 PEST序列：指真核蛋白中富含脯aa、谷aa、絲aa、蘇aa的區(qū)段，易發(fā)生胞內(nèi)降解，該序列的磷酸化作用增加了與鈣離子結合，從而促進依

16、賴于鈣離子的蛋白酶的降解。,表達部位：周質與胞外所含蛋白酶較少，在這些部位表達的蛋白不易被降解。 分子伴侶的穩(wěn)定作用：阻止聚合作用，促進蛋白質的正確折疊。 一種分子伴侶的超量表達無法使蛋白正確折疊，不同類型分子伴侶彼此協(xié)調(diào)參與蛋白質的折疊。,第四節(jié) 影響真核基因表達效率的因素,影響因素： 啟動子的強度、DNA轉錄起始序列 密碼子的選擇、 mRNA的二級結構 轉錄的終止、質粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性 寄主細胞的生理特征等,1. 5-UTR對克隆基因表達效率的影響,啟動子結構的影響： 啟動子序列具有2種保守序列，即-35區(qū)(5-TTGACA)和-10區(qū)(5-TATAAT)。啟動子序列與此越相似，其表達能力

17、越強。 -35區(qū)和-10區(qū)之間的距離：也是影響克隆基因表達效率的重要因素。距離越接近17bp，啟動子的活性越強。 對于某些啟動子，-35區(qū)上游的10-100bp序列：起上游激活物的作用。,啟動子與克隆基因之間距離的影響： 發(fā)生2-3nt長度的變化，就能顯著影響翻譯的效率。 與質粒mRNA 5-端的二級結構有關：SD序列或AUG密碼子參與mRNA分子的堿基配對會明顯降低mRNA的翻譯效率。 要獲得良好表達， AUG密碼子或SD序列必須處于易接觸的部位，以利于與核糖體結合起始翻譯過程。 mRNA 5-末端與SD序列的距離也是影響翻譯效率的重要因素，距離小于15nt時，翻譯效率會顯著下降。,提高克隆

18、基因表達效率的方案： 建立克隆庫：使目的基因放置在與啟動子不同距離的位置上，從重組體中篩選產(chǎn)量最高的克隆。 對于表達產(chǎn)物難以測定的基因，可先將其N-端片斷與報告基因融合，再建立克隆庫，通過報告基因產(chǎn)物的活性來篩選克隆基因有效表達的重組菌落。最后將該質粒中的報告基因用克隆基因的C-端片斷替換，即得到高效表達克隆基因的重組質粒。,質粒的拷貝數(shù)的影響： 提高表達效率的途徑：增加mRNA的數(shù)量。影響mRNA合成速率的因素有兩種，即啟動子的強度和基因的拷貝數(shù)。 提高基因的拷貝數(shù)：將其克隆到高拷貝數(shù)的質粒載體上。 質粒的不穩(wěn)定性的影響：發(fā)生質粒丟失 保持抗生素的選擇壓力 將質粒分配功能區(qū)par克隆到質粒載體上,2. 質粒的生物學特性對表達效率的影響,對無質粒的細胞進行反選擇,3. mRNA轉錄物的分子特性對表達效率的影響,轉錄起始序列的影響： SD序列的影響：起始密碼子上游的5-10nt，核糖體的結合位點。與16S rRNA互補程度越高，轉譯的效率越高。 SD序列后的4個堿基的影響：為