RNAi干擾及其應(yīng)用.ppt

1、RNAi的發(fā)現(xiàn),20多年前，在對矮牽牛（petunias）進(jìn)行的研究中有個(gè)奇怪的發(fā)現(xiàn)：Rich Jorgensen和同事將一個(gè)能產(chǎn)生色素的基因置于一個(gè)強(qiáng)啟動子后，導(dǎo)入矮腳牽牛中，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵，多數(shù)花成了花斑的甚至白的。Jorgensen將將這種現(xiàn)象命名為協(xié)同抑制“cosuppression”，因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制。后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中，甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。,野生型,試驗(yàn),預(yù)測,1995年，Guo S等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因的表達(dá)。 設(shè)計(jì)： 反義RNA 特異性地阻斷par-1基因的

2、表達(dá)； 正義RNA 以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。 結(jié)果: 二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個(gè)意外以合理解釋。,RNAi的提出,直到1998年2月，F(xiàn)ire A和Mello C才首次揭開這個(gè)懸疑之謎。 他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱；而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。 他們證實(shí)，Guo S博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。 該小組將這一現(xiàn)象

3、稱為RNA干擾（RNA interference， 簡稱RNAi）。,RNAi廣泛存在于自然界,隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。 這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。 隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。,RNAi的定義,目前對RNAi (RNA interference)的定義有很多種，不同的資料對其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義： RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默

4、現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。 RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。,如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為 ： RNAi 是指通過反義RNA與正鏈RNA 形成雙鏈RNA 特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA 和反義RNA) ,從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA 降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。 RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsR

5、NA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的 mRNA降解成21nt23nt 的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。 RNAi是將與靶基因的mRNA 同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA ) 導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失, 屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。,RNAi的定義,1、RNAi 機(jī)制,體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果的提示,體外實(shí)驗(yàn)表明：RNAi反應(yīng)中，加入的dsRNA被切割為21-23核苷酸長的RNA片段，后者會使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長的片段。 從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細(xì)胞中，Hammond

6、等人部分純化了一種核酸酶，該核酸酶具有序列特異性，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么這種核酸酶是如何確定哪些mRNA該降解而哪些不該呢？ 由于在純化該核酸酶時(shí)，可以共分離出21-23核苷酸長的dsRNA片段，這暗示該核酸酶對mRNA的切割有可能是以這些片段作模板指導(dǎo)進(jìn)行的。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，人們提出一種RNAi作用的簡單模型。,RNAi作用的簡單模型,當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識別，切割成21-23核苷酸長的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識別目的mRNA。 識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈

7、發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。 核酸酶在同樣位置對mRNA進(jìn)行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對目的mRNA進(jìn)行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。 通過遺傳分析的方法，目前已從線蟲中已分離到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相關(guān)的基因。,RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制,Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.,RNAi相關(guān)的基因沉默通路示意,RNAi的特點(diǎn),1)高效性。Elbashi

8、r等在研究中發(fā)現(xiàn)分別為25 nmol/L與100 nmol/L的起始雙鏈RNA產(chǎn)生的結(jié)果是一樣的，只是高濃度起始的更有效些。將雙鏈RNA濃度降低到1.5 nmol/L時(shí)產(chǎn)生的基因沉默效果變化不大，只有當(dāng)濃度降低到0.05 nmol/L時(shí)，沉默的效果才消失。Holen等也證實(shí)1100 nmol/L的雙鏈RNA濃度對基因沉默的效果是一致的。這說明雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默效率是相當(dāng)高的。,2)需要ATP。Zamore等認(rèn)為RNAi過程中至少有2個(gè)步驟需要能量的供給：一是長的雙鏈RNA被 Dicer所酶切產(chǎn)生雙鏈RNA；二是在雙鏈RNA與RISC結(jié)合解鏈后形成有活性的RISC。 3)特異性。Elbas

9、hir等和Brummel kamp等發(fā)現(xiàn)在2123個(gè)堿基對中有12個(gè)堿基錯(cuò)配會大大降低對靶mRNA的降解效果。,4)位置效應(yīng)。Holen等根據(jù)人TF(tissue factor)不同的位置各合成了4組雙鏈RNA來檢測不同位置的雙鏈RNA對基因沉默效率的影響。在不同濃度和不同類型的細(xì)胞中，hTF167i和hTF372i能夠抑制8590的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i則幾乎沒有抑制基因的活性。他們還以hTF167為中心依次相差3個(gè)堿基對在其左右各合成了幾組雙鏈RNA，有趣的是它們所能抑制該基因活性的能力以hTF167為中心依次遞減。特別是hTF158i和 hTF16

10、1i只與hTF167i相距9個(gè)和6個(gè)堿基，但它們幾乎沒有抑制該基因活性的能力。結(jié)果還表明雙鏈RNA對mRNA的結(jié)合部位有堿基偏好性，相對而言，GC含量較低的mRNA被沉默效果較好。,5)競爭效應(yīng)。Hoten等將10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無差異，但將20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i產(chǎn)生的抑制效果明顯降低。 6)可傳播性。在線蟲中，雙鏈RNA可以從起始位置傳播到遠(yuǎn)的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在線蟲細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)一種跨膜蛋白SID1，它可以將雙鏈RN

11、A轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，因此系統(tǒng)性的RNAi包括了SID1介導(dǎo)的雙鏈 RNA在細(xì)胞間的運(yùn)輸。但在果蠅上并未發(fā)現(xiàn)有此基因的同源物，因此在果蠅上通過注射產(chǎn)生的RNAi不能擴(kuò)散。,RNAi在植物與其他生物中的差異,在植物中存在系統(tǒng)性沉默(systematic RNAs ilencing)現(xiàn)象，RNAi不會局限于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，可以在細(xì)胞與細(xì)胞之間、甚至由誘導(dǎo)部位向更遠(yuǎn)的組織傳播。 植物中存在轉(zhuǎn)移性沉默(transitive RNAi)，對于轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因，如果dsRNA誘導(dǎo)的RNA沉默區(qū)域?qū)?yīng)于基因的中間區(qū)域，能檢測到與其側(cè)翼區(qū)段對應(yīng)的siRNA。但內(nèi)源基因卻缺乏轉(zhuǎn)移性沉默，表現(xiàn)出沉默區(qū)域的保守性。這兩種

12、現(xiàn)象在線蟲中也有發(fā)現(xiàn),但在哺乳動物和昆蟲中卻沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。 植物中的RNAi跟兩種不同大小的siRNA有關(guān)：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指導(dǎo)切割目的mRNA，而24nt則引發(fā)了系統(tǒng)性沉默和甲基化；而在動物中僅發(fā)現(xiàn)21nt的siRNA。,RNAi研究的一般技術(shù)路線,2、制備siRNA 的方法,（1）化學(xué)合成,盡管化學(xué)合成是最貴的方法，但是卻是最方便的研究人員幾乎不需要做什么工作。許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。 主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。 由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成34對siRNAs 的成本就更高了，比較常

13、見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究； 不適用于：篩選siRNA等長時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素,（2）體外轉(zhuǎn)錄,相對化學(xué)合成法而言成本比較低，是一種性價(jià)比高的篩選siRNAs的好方法。 更重要的是能夠更快的得到siRNAs。 值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNAs較高濃度得到的效果。 不足之處：實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。 最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種si

14、RNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。 不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長期研究。,Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting -Actin to Induce Gene Silencing.,（3）用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA,選擇通常是2001000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs 除掉沒有被消化的dsRNA siRNA混合物直接

15、轉(zhuǎn)染細(xì)胞 最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型 不適用于：長時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療,Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.,（4）siRNA表達(dá)載體,多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。包括的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。 之所以采用RNA p

16、ol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個(gè)）U來終止轉(zhuǎn)錄的。 使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動子下游。 最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長時(shí)間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長期研究。 不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）,（5） siRNA表達(dá)框架,siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)

17、入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。 這個(gè)方法最早是由Castanotto采用，包括一個(gè)RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)。 和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。 因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！,（5） siRNA表達(dá)框架,如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。 構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和

18、長效抑制的研究。 這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果有適合的新型轉(zhuǎn)染試劑能提高SEC的轉(zhuǎn)染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規(guī)模制備。 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子； 不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） 。,對于線蟲而言，雙鏈RNA在生物體中的表達(dá)通過注射或者喂食的方法都可以產(chǎn)生很好的效果。但這種簡單有效的方法對于其它生物來說并不可行。對于植物和哺乳動物來說，要有穩(wěn)定的抑制效果就必須有穩(wěn)定表達(dá)雙鏈RNA的合適方法，這還得要借助遺傳轉(zhuǎn)化的方法。目前已經(jīng)建立了多種適合產(chǎn)生雙鏈RNA的方法。,制

19、備siRNA5種不同方法的比較,制備siRNA5種不同方法的比較（續(xù)）,負(fù)對照,一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有負(fù)對照。 作為負(fù)對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。 通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。,3. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞,siRNAs需要進(jìn)入細(xì)胞后才能對蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制，因此將其高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是研究成功與否的關(guān)鍵步驟。 例如，一個(gè)siRNA對某個(gè)特定基因表達(dá)的抑制效率是90%，但是其轉(zhuǎn)染效率只有10%，那么總的抑制率只有9%。 目前傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法與試劑的效果都不是很理想。 對于植物細(xì)胞構(gòu)建合適的

20、RNAi載體已經(jīng)有很多成功的報(bào)道。,4. RNAi的效果分析,可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 雜交等。 蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。 細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。,5、RNAi在植物中應(yīng)用的方法,（1）瞬時(shí)性的RNA沉默,導(dǎo)致產(chǎn)生瞬時(shí)性RNA沉默的方法包括 基因槍轟擊法 病毒侵染法,基因槍法,基因槍轟擊法盡管也能產(chǎn)生持久性的轉(zhuǎn)基因效應(yīng)，但在RNA沉默中它更多的應(yīng)用于瞬時(shí)性的RNA沉默研究。用該方法對植物的轉(zhuǎn)化速度快，并且當(dāng)DNA進(jìn)入目標(biāo)組織后就會被釋放并迅速表達(dá)dsR

21、NA而產(chǎn)生RNA沉默現(xiàn)象,Schweizer等通過基因槍轟擊谷物如小麥、玉米和大麥的葉片表皮細(xì)胞將表達(dá)dsRNA或hpRNA的DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化入植物并引發(fā)RNA沉默，這種方法已經(jīng)在沉默內(nèi)源基因A1、MLO、GUS基因中得到證實(shí),表現(xiàn)為目標(biāo)基因活性的降低 。 Klahre等在轉(zhuǎn)GUS基因煙草中通過基因槍介導(dǎo)的dsRNA、siRNA和正義、反義RNA轟擊以使GUS抑制蛋白沉默，發(fā)現(xiàn)每種方法都能產(chǎn)生siRNA而導(dǎo)致GUS抑制蛋白的沉默,結(jié)果使GUS能正常表達(dá)。,病毒誘導(dǎo)的基因沉默,病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是通過改造侵染植物的病毒使其攜帶用

22、于產(chǎn)生RNA沉默的DNA序列，當(dāng)用該病毒侵染植物時(shí)則產(chǎn)生RNA沉默現(xiàn)象 Kumagal等將人工構(gòu)建的植物基因PDS的片段插入煙草花葉病毒基因組中使其產(chǎn)生包含正向或反向PDS序列片段的RNA時(shí)產(chǎn)生了光褪色現(xiàn)象,揭示內(nèi)源的PDS基因被沉默,（2）持久性的RNA沉默,目前,在植物中持久表達(dá)RNA沉默通常采用構(gòu)建表達(dá)載體,通過PEG介導(dǎo)、電穿孔介導(dǎo)、農(nóng)桿菌侵染等方法使設(shè)計(jì)的序列整合到植物基因組中并穩(wěn)定表達(dá),Stoutjesdijk等報(bào)道擬南芥中到T5代時(shí)RNA沉默仍然是遺傳穩(wěn)定性的 。 Wesley等系統(tǒng)研究了不同結(jié)構(gòu)的RNA對沉默效率的影響，發(fā)現(xiàn)相比于單鏈正義或反義RNA，雙鏈RNA尤其是發(fā)夾式結(jié)構(gòu)

23、的RNA(hpRNA)對RNA沉默的效率有非常顯著的提高。如果在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列間加入一段非編碼序列如內(nèi)含子，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成含內(nèi)含子的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(intronsplicinghpRNA，ihpRNA),則沉默效果與hpRNA相比可從58%提高到90%,6、RNAi在植物中的應(yīng)用領(lǐng)域,RNAi在植物功能基因組研究中的應(yīng)用,RNAi為大規(guī)模高效及復(fù)雜的功能基因組學(xué)研究提供了一個(gè)便捷的平臺 。 Chuang等在花發(fā)育研究中采用RNA沉默技術(shù)驗(yàn)證了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并開創(chuàng)了RNA沉默技術(shù)在植物功能基因組學(xué)中的應(yīng)用 。 Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列設(shè)

24、計(jì)RNA沉默載體，成功的對OsRac基因家族進(jìn)行了沉默，發(fā)現(xiàn)該突變株系生長狀況和植株高度均比正常的要差，揭示該基因家族在生長發(fā)育過程中有重要的作用,RNAi在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用,盡管產(chǎn)量問題在傳統(tǒng)育種和植物遺傳工程研究中是最重要的目標(biāo),改善植物營養(yǎng)價(jià)值方面也越來越受到重視。常規(guī)育種方法在改善食物營養(yǎng)方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗時(shí)，并且對于作物性狀的改良只限于已經(jīng)得到的突變體材料 而利用RNA沉默技術(shù)，其優(yōu)越性不僅表現(xiàn)在可操作基因的范圍和突變的種類擴(kuò)大了，而且對目的基因的表達(dá)有了可控性,Liu等利用RNA沉默技術(shù)進(jìn)行了棉籽油成份的改良研究,通過抑制2個(gè)脂肪酸去飽和酶關(guān)鍵基因92去飽和酶編碼基因ghFAD21和62去飽和酶編碼基因ghFAD221的表達(dá)，分別將硬脂酸含量從非轉(zhuǎn)基因的2%3%提高到40%，油酸含量從15%提高到77%，并表明通過上述后代的雜交可獲得同時(shí)提高硬脂酸和油酸的植株，而且基因沉默程度沒有降低 。 Ogita等利用RNA沉默技術(shù)抑制咖啡植物中編碼可可堿合成酶(CaMXMT1)基因