磁珠提取(新).ppt

1、磁珠式核酸提取體系,核酸提取的總體要求,高質(zhì)量：純度高并且盡可能不破壞核酸 高產(chǎn)量：樣本量一定時盡可能提取多的核酸 高通量：同時提取多個標本 自動化：降低勞動量；生物科技的飛速發(fā)展，需要處理的核酸樣本迅速增多，自動化提取核酸成為一種迫切需要的選擇。,磁粒法核酸提取的特點,步驟： 裂解核酸結(jié)合洗滌洗脫 特點： 提取時間短 不使用酚、氯仿 用磁分離替代離心分離易于自動化，可以實現(xiàn)高通量提取 目前處于市場發(fā)育階段，是未來發(fā)展的方向 主要產(chǎn)品為國外產(chǎn)品：Promega、Roche、KingFisher、Dynal等，大多需要與專用儀器配套,各種提取方式操作比較,磁粒法核酸提取基本步驟,裂解細胞或病毒顆

2、粒 核酸與磁粒結(jié)合 磁分離棄上清 洗滌緩沖液洗滌磁粒 磁分離棄上清 洗脫液將核酸從磁粒洗脫 磁分離棄磁粒，收集上清,磁粒法提取核酸示意圖,磁粒提取試劑操作方式,磁架 磁筆 自動提取儀,裂解,結(jié)合,磁分離,吸去廢液,洗滌,洗脫,磁架提取核酸示意圖,裂解,結(jié)合,轉(zhuǎn)移磁粒,洗滌,洗脫,轉(zhuǎn)移磁粒,磁筆提取核酸示意圖,自動儀器提取,自動提取的原理與磁筆提取相同，只是用機器的運轉(zhuǎn)代替手工操作，實現(xiàn)高通量提取和減少工作量。,磁珠提取方法的優(yōu)化,裂解：裂解液配方，作用時間和溫度等 結(jié)合：結(jié)合液的選擇和用量等 洗滌：洗滌液配方等 洗脫：洗脫時間和溫度等,主要實驗結(jié)果,與其他方法或類似商業(yè)化試劑盒的比較 核酸提取

3、的靈敏度： HCV RNA，HIV RNA，HBV DNA,與Qiagen 磁珠式核酸提取試劑盒的比較,HCV RNA提取比較,HBV DNA提取比較,提取靈敏度實驗,陽性樣本梯度稀釋 國家靈敏度參考品,HCV RNA提取,HCV陽性樣本10倍稀釋梯度：100,10-1,10-2,10-3,10-4,磁珠提取與柱提取法比較（數(shù)據(jù)見下頁）,磁珠提取方法與柱提取法及水溶液梯度稀釋樣本比較,磁珠提取與柱提法的提取效果相當。在低濃度樣本提取方面，熒光增量與稀釋組無顯著差異，此方法在去除樣本中抑制物方面效果良好。,HCV RNA國家標準品檢測,10份陽性參考品: P1P10,HIV RNA提取,HIV陽性樣本梯度稀釋成1/5，1/25，1/50，1/100和1/200 五個濃度，提取RNA，原樣本提取后用TE按相同比例稀釋 ，上機比較。,HIV 樣本稀釋梯度： 1/5，1/25，1/50，1/100和1/200,HIV核酸國家參考品檢測,HIV RNA靈敏度和定量參考品：B2B5（至少檢出B2-B3）,HIV RNA線性參考品：A2A5。,HIV RNA熒光定量標準曲線, 線形相關(guān)系數(shù):0.9907,HIV 陽性參考品:P1, P2, P3, P5, P7, P8,HIV陽性參考品檢測,中檢所HBV核酸