第10章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定.ppt

1、主要內(nèi)容,第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定,第一節(jié) 概述(理解) 第二節(jié) 蛋白的定性測定 一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)（理解） 二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（理解） 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測定 一、凱氏定氮法（掌握） 二、其他測定方法（理解） 第四節(jié) 氨基酸的定性測定（了解） 第五節(jié) 氨基酸的定量測定 一、 氨基酸的一般定量測定（理解） 二、 個(gè)別氨基酸的定量測定（自學(xué)，理解）,第一節(jié) 概述 一、蛋白質(zhì)的作用 1、蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)： 是構(gòu)成細(xì)胞的組成成分 2、擔(dān)當(dāng)重要的生理功能： 是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織時(shí)所需氨基酸的來源， 物質(zhì)代謝的生物催化劑， 營養(yǎng)物質(zhì)及氣體的運(yùn)輸 遺傳信息的傳遞與表達(dá) 人體內(nèi)的組

2、質(zhì)液pH（健康pH在7.37.5之間）及水分的平衡 為免疫系統(tǒng)制造對抗細(xì)菌和感染的抗體；,1、蛋白質(zhì)的組成: 蛋白質(zhì)由很多的AA單體以肽鍵結(jié)合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的含氮有機(jī)化合物，有的含有P、S、 Cu、Fe、I等元素，分子量高達(dá)數(shù)萬數(shù)百萬。含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其它有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 2、蛋白質(zhì)系數(shù)：一般而言，蛋白質(zhì)含氮量約為16%，即1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。 3、氨基酸的種類: 自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的氨基酸約有170多種，其中組成蛋白的氨基酸只有22種（都是-AA），其中對人而言的必需氨基酸有8種（犬的必需氨基酸有9種）。 4、組成蛋白的氨基酸（-AA

3、）的通式及AA兩性電解質(zhì)特性：,二、蛋白質(zhì)的組成及特性,必需氨基酸： 在組成蛋白的氨基酸中，在人體內(nèi)不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人類而言,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的定義: l蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量高,且總體氨基酸的組成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白質(zhì)。動(dòng)物來源和豆類食品是很好的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。,若蛋白質(zhì)或某些必需氨基酸供給不足： l 會導(dǎo)生物體生長發(fā)育緩慢，體重減輕，抵抗力下降，容易患??； l 男性精液品質(zhì)下降，精子數(shù)量減少； l 女性引起不孕，即使懷孕，胎兒也常發(fā)育不良而發(fā)生死胎或畸胎。 開發(fā)蛋白質(zhì)的生理效價(jià)高的食品及合理配膳等 是食品科學(xué)從業(yè)者的一項(xiàng)重要任務(wù)！,谷類和面食： （%） 大米（糙米、長

4、粒、生） 7.9 大米（白米、長粒、生） 7.1 小麥粉（整粒） 13.7 玉米粉（整粒、黃色） 6.9 玉米淀粉 0.3 豆類： 大豆（成熟的種子、生） 36.5 豆（腰子狀、所有品種） 23.6 豆腐（生、普通） 8.1 水果和蔬菜： 蘋果（生、帶皮） 0.2 蘆筍（生） 2.3 草莓（生） 0.6 萵苣（冰、生） 1.0,肉、家禽、魚： 牛肉（頸肉、烤前腿） 18.5 牛肉（腌制、干牛肉） 29.1 雞（可供煎炸的雞胸肉、生） 23.1 火腿（切片、普通的） 17.6 雞蛋（生、全蛋） 12.5 魚（太平洋鱈魚、生） 17.9 魚（罐裝金槍魚滴干的固體） 26.5 乳制品： 牛乳（全脂、

5、液體） 3.3 牛乳（脫脂、干） 36.2 干酪 24.9 酸奶（普通的、低脂） 5.3,三、部分食品的蛋白質(zhì)含量,四、常用的蛋白質(zhì)和氨基酸的測定方法 凱氏定氮法 雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法 近紅外光譜快速定量方法 氨基酸總量的測定 本章重點(diǎn)： 凱氏定氮法的原理及注意事項(xiàng)，雙縮脲法、印三酮法及氨基酸自動(dòng) 分析儀的原理及注意事項(xiàng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法，氨基酸總量的測定。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測定,一、蛋白質(zhì)的一般顯色法,1氨基黑法,氨基黑10B 是酸性染料，其磺基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。,（1）經(jīng)點(diǎn)樣后的層析紙經(jīng)電泳或?qū)游龊螅氚被?0B 醋酸甲醇溶液（13g 氨基黑10B

6、溶解于100mL 冰醋酸和900mL 甲醇中，充分搖勻，放置過夜，過濾后可反復(fù)使用幾次）中，染色10min，染色后，用10%醋酸甲醇溶液洗滌約57 次，待背景變成淺藍(lán)色后干燥。若欲進(jìn)行洗脫，用0.1mol/L 氫氧化鈉浸泡30min，于595nm 比色測定。,（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色：用甲醇固定后，在含1%氨基黑10B 0.1mol/L 氫氧化 鈉溶液中染色5min(室溫)，用5%乙醇洗脫背景底色?；蛴?%醋酸固定后，于96水浴中 用7%醋酸（含0.51%氨基黑10B）染色10min,7%醋酸洗脫背景底色。用氨基黑10B 染SDS-蛋白質(zhì)時(shí)效果不好。如果凝膠中含有兼性離子載體，先用10%

7、三氯醋酸浸泡，每隔2h換液一次，約10 次，再進(jìn)行染色。,（3）凝膠薄層的直接染色：將凝膠薄層放在一定濕度的烘箱內(nèi)逐步干燥（50），沒有調(diào)溫調(diào)濕箱時(shí)用一張濾紙放于烘箱內(nèi)，以保持一定的濕度。將干燥的薄層板于漂洗液（750mL 甲醇，200mL 水，50mL 冰醋酸）中預(yù)處理10min，然后在染色液（750mL 甲醇，200mL水，50mL 冰醋酸，在此溶液中加氨基黑10B 飽和）中染色5h,再在漂洗液內(nèi)洗滌。,本法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，缺點(diǎn)是花費(fèi)時(shí)間長，不同蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度不同。,2溴酚藍(lán)法,此法缺點(diǎn)是靈敏度低，某些摩爾質(zhì)量低的蛋白質(zhì)可能染不上顏色。,3考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)R250,考馬斯亮藍(lán)法

8、(Stain with Coomassie blue)：考馬斯亮藍(lán)法 靈敏度比氨基黑高五倍，尤其適用于SDS電泳的微量蛋白質(zhì)的染 色。在549nm有最大吸收值，蛋白質(zhì)在110g呈線性關(guān)系?？?以檢測出0.1 ug 的蛋白質(zhì)條帶.,（1）經(jīng)電泳后濾紙或醋酸纖維膜在200g/L 磺基水楊酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L 考馬斯亮藍(lán)R250 染色液（配制用的蒸餾水內(nèi)不含有重金屬離子）浸5min，在蒸餾水或7%醋酸中洗四次，每次5min，于90放置15min。,（2）聚丙烯酰胺凝膠也可同上處理。在酸性醇溶液中，考馬斯亮藍(lán)-兼性離子載體絡(luò)合 物溶解度顯著增大，因此能免去清除兼性離子載體的步驟。

9、可運(yùn)用下列方法之一： 凝膠用 10%三氯醋酸固定，在10%三氯醋酸-1%考馬斯亮藍(lán)R250（191）中室溫染色 0.5h，用10%三氯醋酸脫底色。,凝膠浸入預(yù)熱至 60的0.1%考馬斯亮藍(lán)固定染色液（150g 三氯醋酸，45g 磺基水楊酸溶于375mL 甲醇和930mL 蒸餾水的混合液。每1g 考馬斯亮藍(lán)R250 溶于此混合液1000mL中）中約30min，用酸性乙醇漂洗液（乙醇+水+冰醋酸=25+25+8）洗盡背景顏色。染色后凝膠保存于酸性乙醇漂洗液中。本法靈敏度：卵清蛋白0.03g，血清清蛋白0.02g，血紅蛋0.01g。,凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)固定染色液（2g 考馬斯亮藍(lán)R250，溶于100

10、mL 蒸餾水中，加2mol/L 硫酸100mL，過濾除去沉淀，向清液中滴加10mol/L KOH 至顏色從綠變藍(lán)為止。量體積，每100mL 加入三氯醋酸12g）中1h，然后用蒸餾水洗凈背景顏色或在0.2%H2SO4 溶液中浸泡片刻脫除背景顏色。染色后的凝膠保存于蒸餾水中。本法機(jī)制未明，起染色作用的可能不是考馬斯亮藍(lán)本身，靈敏度不如上法。,4酸性品紅法 經(jīng)電泳后濾紙置于 0.2%酸性品紅溶液中（2g 酸性品紅溶解于500mL 甲醇，400mL 蒸 餾水和100mL 冰醋酸中）加熱染色15min；取出后浸入醋酸甲醇溶液（500mL 甲醇，加400mL蒸餾水和100mL 冰醋酸）15min；然后浸入

11、10%醋酸溶液，每次20min，至背景無色為止。若欲進(jìn)行比色，可用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡2h，在波長為570nm 處比色。,5氨基萘酚磺酸法 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，把凝膠暴露于空氣中幾分鐘，或在 2mol/L HCl 中浸一下使表 層蛋白變性，再在0.003%氨基萘酚磺酸的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.8）中染3min，在紫外光下可顯黃綠色熒光。這樣的染色可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性。如不需保留活性時(shí)，可先在3mol/L HCl 中浸2min 以上使蛋白質(zhì)充分變性，再染色。,二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng),1糖蛋白的顯色 (1)過碘酸-Schiff 氏試劑顯色法： 試劑

12、過碘酸液：1.2g 過碘酸溶解于30mL 蒸餾水中，加15mL 0.2mol/L 醋酸鈉溶液及100mL 乙醇。臨用前配制，或保存在棕色瓶中，可用數(shù)日。,還原液：5g 碘化鉀，5g 硫代硫酸鈉溶100mL 蒸餾水中，加150mL95%乙醇及2.5mL 2mol/LHCl 。 現(xiàn)配現(xiàn)用。 亞硫酸品紅液：2g 堿性品紅溶解于400mL 沸水中，冷卻至50過濾。在濾液中加入10mL 2mol/L 鹽酸和4g 偏亞硫酸鉀（K2S2O5），將瓶塞緊放在冰箱中過夜，加1g 活性炭，過濾，再逐漸加入2mol/L 鹽酸，直至此溶液在玻片上干后不變紅色為止，保存在棕色瓶中，冰箱貯存，當(dāng)溶液變紅時(shí)不可以再用。,亞

13、硫酸鹽沖洗液： 1mL 濃硫酸，0.4g 偏亞硫酸鉀加入到100mL 水中。 顯色步驟 將含有樣品的濾紙浸在 70%乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min，用70%乙醇洗一次，在還原液中浸58min，再用70%乙醇洗一次，在亞硫酸品紅液中浸2425min, 用亞硫酸鹽沖洗液洗三次，并用乙醇脫水后，放在玻璃板上吹干。顯色結(jié)果：在黑灰色的底 板上呈現(xiàn)紫紅色。,（2）甲苯胺藍(lán)（Toluidine blue）顯色法： 試劑 試劑甲：1.2g 過碘酸溶解在30mL 蒸餾水中，加15mL 0.5mol/L 醋酸鈉和100mL 96%乙醇?，F(xiàn)配現(xiàn)用。 試劑乙：100mL 甲醇加20mL 冰醋酸及80mL

14、 蒸餾水。 試劑丙：溴水。試劑 試劑?。?0g/L 甲苯胺藍(lán)水溶液。 試劑戊：40g/L 鉬酸銨溶液。,顯色步驟: 將點(diǎn)有樣品的濾紙依次在試劑甲中浸 15min，試劑丙中浸15min，用自來水漂洗，再在試劑丁中浸30min，自來水中漂洗至沒有藍(lán)色染料滲出（約3040min）后，再依次在試劑戊中浸3min，試劑乙中浸15min，丙酮中浸2min 后在空氣中干燥。顯色結(jié)果：糖蛋白部分染成藍(lán)色，背景帶有紅紫色。,（3）阿爾新藍(lán)（Alcian blue ）顯色法： 聚丙烯酰胺凝膠在 12.5%三氯醋酸中固定30min 后，再用蒸餾水輕輕漂洗。放入1%過 碘酸液（在3%醋酸中）中氧化50min。用蒸餾水

15、反復(fù)洗滌去除多余的過碘酸鹽。再放入0.5%偏重亞硫酸鉀中還原剩余的過碘酸鹽30min，再用蒸餾水洗滌。浸在0.5%阿爾新藍(lán)（在3%醋酸中）溶液中染4h。,2脂蛋白的顯色 （1）蘇丹黑（Sudan black）顯色法： 將 0.1g 蘇丹黑B 溶解于煮沸的100mL 60%的乙醇溶液中，制備成飽和溶液，冷卻后過濾兩次，備用。顯色時(shí)將點(diǎn)有樣品的濾紙浸于上述溶液中，3h 后取出，用50%乙醇溶液洗滌兩次，每次15min，空氣中干燥。 聚丙烯酰胺凝膠電泳中預(yù)染法：加蘇丹黑B 到無水乙醇中成飽和液，并震搖使乙酰化。 用前過濾。按樣品液的1/10 量加入樣品液中染色1h 或4過夜。染色后的樣品再進(jìn)行電泳。

16、,（2）油紅-O（Oil red O）顯色法： 0.04g 油紅溶解于100mL60%的乙醇中，30放置過夜（16h）使充分飽和后，在30下濾去多余的染料，澄清液即可用于染色。將濾紙浸入染料液中，在30下染色18h 后，用水沖洗，使背景變淺，在空氣中干燥。脂蛋白為紅色，背景為桃紅色。本法在30以下顯色時(shí)，會引起染料沉淀。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測定 一、凱氏定氮法 （一）常量凱氏定氮法 1、原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解， 其中碳和氫被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被還原成 二氧化硫，樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與過量的硫酸結(jié)合成硫酸 銨; 然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用弱酸硼酸

17、吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng) 酸如鹽酸或硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì) 的含量。,催化劑 煮沸,（1）、消化：NCOC + 濃H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O （2）、氨化： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O （3）、吸收: 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O （4）、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ),凱氏定氮法原理（方程式）,2、結(jié)果計(jì)算,

18、凱氏定氮法操作方法,a消化裝置,1、硫酸鉀 及硫酸銅的作用 2、火候控制 3、裝置的氣密性 4、何時(shí)加堿 5、難消化的 對策 6、停止蒸餾,b蒸餾吸收裝置,操作方法,繼續(xù)微沸30min,冷卻 定容,0.5g Cuso4 10gk2so4,20mlH2so4,先小火，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止，加大火，保持瓶內(nèi)液體策沸,在消化反應(yīng)中，為了加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)： 1）硫酸鉀 加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解。它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度。其反應(yīng)式如下： K2SO4 + H2SO4 = 2KHSO4 2KHSO4 = K2SO4 + H2O+ SO3

19、但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失： （NH4）2SO4 NH3+（NH4）HSO4 （NH4）HSO4 NH3+ SO3+ H2O 2）硫酸銅 硫酸銅起催化劑的作用。硫酸銅的作用機(jī)理如下所示： 2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ O2,C + 2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ CO2Cu2SO4 + 2H2SO4 2CuSO4 + 2H2O + SO2,溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。指示消化到達(dá)終點(diǎn),說明及注意事項(xiàng) 當(dāng)濃硫酸的用量為改變時(shí)，硫酸銅，硫酸鉀，氫氧化鈉等試劑應(yīng)按比例改變。 所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要

20、用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘附在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮損失。 消化過程中應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶， 以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體 殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全。,樣品中若含脂肪或糖較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并不停地?fù)u動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過氧化氫23mL后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量。,一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合

21、物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。,硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。 11蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1min后關(guān)掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。 12混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。,（二）微量凱氏定氮法 1、原理同常量凱氏定氮法。,微量凱氏定氮裝置,10ml140%Na

22、oH和少量水,綠色,紅色,灰色,2、 說明及注意事項(xiàng) 蒸餾前給水蒸汽發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3 容積處，加甲基橙指示數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性，這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結(jié)果。 20g/L 硼酸吸收液每次用量為25mL，用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2 滴。 在蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不得?；饠鄽猓駝t將發(fā)生倒吸。加堿要足量，操作要迅速；漏斗應(yīng)采用水封措施，以免氨由此逸出損失。,（三）、自動(dòng)凱氏定氮法 所謂自動(dòng)凱氏定氮法，是將常量凱氏定氮裝置組裝成具有自動(dòng)操作功能的一套裝置，其原理與試劑與常量法相同，操作方法簡述如下：,kdn-04b全自動(dòng)凱氏定氮儀價(jià)格,操作方法

23、： （1）稱取0.501.00g 樣品，置于消化瓶內(nèi)，加入硫酸銅與硫酸鉀制成的片劑兩片，加入濃硫酸10mL，將消化瓶置于紅外線消化爐中。消化爐分成兩組，每行一組共4 個(gè)消化爐。消化瓶放入消化爐后，用連接管連接密封住消化瓶，開啟抽氣裝置，開啟消化爐的電源，30min 后8 個(gè)樣品消化完畢，消化液完全澄清并呈綠色。 （2）取出消化瓶，移裝于自動(dòng)凱氏定氮儀中，接連開啟加水的電鈕、加堿電鈕、自動(dòng)蒸餾滴定電鈕，開啟電源，大約經(jīng)12min 后由數(shù)顯裝置即可給出樣品總氮百分含量，并記錄樣品總氮百分比。根據(jù)樣品的種類選擇相應(yīng)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)F，即可得出樣品中蛋白質(zhì)含量。 （3）開啟排廢液電鈕及加水電鈕，排出廢

24、液并對消化瓶清洗一次。大約在2h 左右時(shí)間內(nèi)可完成8 個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量測定工作。該法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。,二、雙縮脲法,1原理 當(dāng)脲被小心地加熱至 150160時(shí)，可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成二縮脲（也叫雙縮脲），反應(yīng)如下：,雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)：,此可用吸收光度法來測定蛋白質(zhì)含量，該配合物的最大吸收波長為560nm。,2方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。 本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。,3操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以采用凱氏定氮

25、法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣。按蛋白質(zhì)含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣于8 支50mL 納氏比色管中，然后各加入1mL 四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀釋至50mL，振搖10min，靜置1h，取上層清液離心5min，取離心分離后的透明液 于比色皿中，在560nm 波長下以蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測定各溶液的吸光度A，以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,操作方法,1mlccl4 堿性Cuso4,加水至50ml,4結(jié)果計(jì)算,式中 c由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg； m樣品

26、質(zhì)量，g。,5說明及注意事項(xiàng) 蛋白質(zhì)的種類不同，對發(fā)色程度影響不大。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完整后，無需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去。 樣品中有不溶性成分存在時(shí)，會給比色測定帶來困難，此時(shí)可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進(jìn)行測定。,當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時(shí)，若有多量糖類共存，則顯色不好，會使測定值偏低。 堿性硫酸銅溶液由0.1mol 氫氧化鉀、5g 酒石酸鉀鈉、1.6g 硫酸銅溶于水后加水至1000mL 配成。,三、紫外吸收法,1A280nm 光吸收法 （1）原理 蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物（“月示”、胨、肽和氨基酸）的芳香環(huán)殘基-NH-CH（R）-CO-在紫外區(qū)內(nèi)對一定波長的光具有選擇吸收作用。在此

27、波長（280mm）下，光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度（3mgmL）成直線關(guān)系，因此，通過測定蛋白質(zhì)溶液的吸光度，并參照事 先用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出樣品蛋白質(zhì)含量。,（2）適用范圍 本法操作簡便迅速，常用于生物化學(xué)研究工作；但由于許多非蛋白質(zhì)成分在紫外光區(qū) 也有吸收作用，加之光散射作用的干擾，故在食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用并不廣泛，最早用于測 定牛乳的蛋白質(zhì)含量，也可用于測定小麥面粉、糕點(diǎn)、豆類、蛋黃及肉制品中的蛋白質(zhì)含量。,（3）操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取樣品2.00g，置于50mL 燒杯中，加入0.1mol/L 檸檬酸溶液30mL，不斷攪拌10min 使其充分溶解

28、，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以30005000r/min的速度離心510min，傾出上清液。分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 于10mL 容量瓶中，各加入8mol/L 尿素的氫氧化鈉溶液定容至標(biāo)線，充分振搖2min，若渾濁，再次離心直至透明為止。將透明液置于比色皿中，以8mol/L 尿素的氫氧化鈉溶液作參比液，在280nm 波長處測定各溶液的吸光度A。,樣品的測定：準(zhǔn)確稱取試樣1.00g，如前處理，吸取的每毫升樣品溶液中含有大約38mg 的蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作條件測定其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)的含量。,（4）結(jié)果計(jì)算,式中：c從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)

29、質(zhì)量，mg； m測定樣品溶液所相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，mg。,（7）說明及注意事項(xiàng) 測定牛乳樣品時(shí)的操作手續(xù)：準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2mL于25mL納氏比色管中，用95%97%的冰醋酸稀釋至標(biāo)線，搖勻，以9597%冰醋酸為參比液，用1cm 比色皿 于280nm 處測定吸光度，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣品蛋白質(zhì)含量（標(biāo)準(zhǔn)曲線以采用凱氏定氮 法已測出蛋白質(zhì)含量的牛乳標(biāo)準(zhǔn)樣繪制）。,測定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)將表皮的顏色去掉。 溫度對蛋白質(zhì)水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在 2030。,2A260nm 和A280nm 比值法 （1）原理 凡是有共軛雙鍵的物質(zhì)，均具有紫外吸收值。因此，若樣品中含核酸，則嘌呤、嘧啶兩類堿基對蛋白

30、質(zhì)的測定產(chǎn)生干擾，應(yīng)加以校正。核酸在260nm 處的紫外吸收值大于280nm處的紫外吸收值，但蛋白質(zhì)恰恰相反。利用這些性質(zhì)，通過計(jì)算可以適當(dāng)較正核酸對測定蛋白質(zhì)濃度的干擾。但是，由于不同的蛋白質(zhì)和核酸對紫外吸收不同，校正后的測定結(jié)果還存 在一定的誤差。,（2）測定 取一定量的樣品稀釋液，分別測出樣品的A280nm 和A260nm的值，計(jì)算出A280nm/A260nm 的比值后，從下表中查出校正因子“F”值，同時(shí)可查出該樣品內(nèi)混雜的核酸百分含量。將F 值代入，由下述公式可直接算出該樣品的蛋白質(zhì)含量： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL=F1/dA280nmn 式中A280nm該樣品液在280nm 波長下的

31、吸收值； d石英杯的厚度（cm）； n樣品的稀釋倍數(shù)。,四、福林-酚比色法,1原理 蛋白質(zhì)與福林（Folin）-酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中的肽 鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢 酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng) 典方法之一。,2試劑 福林酚試劑甲：將溶液 A50mL 和溶液B 1mL 混合即成?，F(xiàn)用現(xiàn)配，過期失效。溶液 A：1g Na2CO3 溶于50mL 0.1mol/LNaOH 溶液中。溶液 B：將1%硫酸溶液和20g/L 酒石酸鈉（鉀）溶液等體積混合而成。,福林酚試劑乙

32、：在 1.5L 體積的磨口回流管中，加入100g 鎢酸鈉（Na2WO42H2O）、25g 鉬酸鈉（Na2MoO42H2O）以及700mL 蒸餾水，再加入50mL85%磷酸溶液及100mL 濃鹽酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流10h?；亓魍戤叄尤?50g 硫酸鋰、50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15min，以便除去過量的溴，冷卻后加水定容至1000mL，過濾，濾液呈微綠色，置于棕色瓶中保存。使用時(shí)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以酚酞作指示劑，最后用蒸餾水稀釋（約1 倍左右），使最終濃度為1.0mol/L. 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取牛血清蛋白或酪蛋白，配制成100g/mL 溶液。,

33、3測定 吸取一定量的樣品稀釋液，加入試劑甲3.0mL，置于25中水浴保溫10min，再加 入試劑乙0.3mL，立即混勻，保溫30min，以介質(zhì)溶液調(diào)零，測定A750nm 值，與蛋白質(zhì) 標(biāo)準(zhǔn)液作對照，求出樣品的蛋白質(zhì)的含量。 本法在060mg/L 蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。,4說明 福林-酚法靈敏度高，實(shí)測下限較雙縮脲法約小2 個(gè)數(shù)量級。但對雙縮脲法有干擾的物質(zhì)對福林酚法的影響更大。酚類及檸檬酸均對本法有干擾。,五、染料結(jié)合法 1原理 在特定條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料（如胺黑10B 或酸性橙12 等）定量結(jié)合而生成沉淀，用分光光度計(jì)測定沉淀反應(yīng)完成后剩余的染料量可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量，進(jìn)而可求

34、得樣品中蛋白質(zhì)含量。 2適用范圍 本法適用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品。,3試劑,檸檬酸溶液：稱取檸檬酸（含1 分子結(jié)晶水）20.14g，用水稀釋至1000mL，加入1.0mL丙酸（防腐），搖勻后pH 應(yīng)為2.2。 胺黑10B 染料溶液：準(zhǔn)確稱取胺黑10B 染料1.066g，用pH2.2 的檸檬酸溶液定容至1000mL，搖勻，取出1mL，用水稀釋至250mL，以水為參比液，用1cm 比色皿于615nm波長處測定吸光度應(yīng)為0.320；否則用染料檸檬酸溶液或水進(jìn)行調(diào)節(jié)。,4操作方法 樣品處理：用組織搗碎機(jī)將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取一定量（蛋白質(zhì)含量在370430mg），作標(biāo)樣用時(shí)稱四

35、份（兩份凱氏法、兩份染料結(jié)合法）。如樣品脂肪含量高，用乙醚提取脂肪棄去，然后再作試驗(yàn)。 染料結(jié)合：將脫脂肪后樣品全部放入組織搗碎機(jī)中，準(zhǔn)確加入吸光度為0.320 的染料溶液200mL，緩慢攪拌4min。,過濾離心：將結(jié)合后的樣品溶液用鋪有玻璃棉的布氏漏斗自然過濾，或用G2 熔結(jié)玻璃漏斗抽濾，靜置20min，取上清夜4mL，用水定容至100mL，搖勻，取出部分溶液離心5min（2000r/min）。 比色：取離心后的澄清透明溶液，用1cm 比色皿，以蒸餾水為參比液于615nm 波長處測定吸光度。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用凱氏定氮法測出上述兩份平行樣品的總氮量，進(jìn)而計(jì)算出用于染料結(jié)合法測定的每份平行樣的

36、蛋白質(zhì)含量，以比色測定得到的吸光度（實(shí)質(zhì)是由沉淀反應(yīng)后剩余的染料所產(chǎn)生的吸光度）為縱坐標(biāo)（注意數(shù)值最好按從上到下吸光度增大的順序標(biāo)出），以相應(yīng)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)繪圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線供分析同類樣品蛋白質(zhì)含量使用。 測樣：完全按照上述（1）（4）步驟進(jìn)行，根據(jù)測出的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量即可。,6說明及注意事項(xiàng) 取樣要均勻。 繪制完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線可供同類樣品長期使用，而不需要每次測樣時(shí)都作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 脂肪含量高的樣品，應(yīng)先用乙醚脫脂，然后再測定。 在樣品溶解性能不好時(shí)，也可用此法測定。 本法具有較高的經(jīng)驗(yàn)性，故操作方法必須標(biāo)準(zhǔn)化。 本法所用染料還包括橙黃G 和溴酚藍(lán)等。,六、考馬

37、斯亮藍(lán)染料比色法 1原理 考馬斯亮藍(lán)G250 是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過范德華引力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在620nm 處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。此法簡單而快速，適合大量樣品的測定，靈敏度與福林酚法相似，但不受酚類、游離氨基酸和小分子的影響。,2試劑 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：精確稱取牛血清蛋白10mg，用蒸餾水配成100g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 染料試劑： 考馬斯亮藍(lán)G-250 （Coomassic brilliant blue G-250）60mg 溶解 過濾 貯棕色瓶。,100mL 3%過氯酸,3.測定方法,本法在 0100mg/L 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。,0100mg/ml

38、 系列標(biāo)液,空白,待測樣液,七、水楊酸比色法,1原理 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍(lán)色化合物，可以在波長660nm 處比色測定，求出樣品含氮量，進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。,2操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取每毫升相當(dāng)于氮含量2.5g 的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0mL，分別置于25mL 容量瓶或比色管中，分別加入2mL 空白酸工作液、5mL 磷酸 緩沖溶液，并分別加水至15mL，再加入5mL 水楊酸鈉溶液，移入3637的恒溫水浴中 加熱15min 后，逐瓶加入2.5mL 次氯酸鈉溶液，搖勻后再在恒溫水浴

39、中加熱15min，取出加水至標(biāo)線，在分光光度計(jì)上于660nm 波長處進(jìn)行比色測定，測得各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度后繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。,樣品處理：準(zhǔn)確稱取 0.201.00g 樣品（視含氮量而定，小麥及飼料稱取樣品0.50g左右），置于凱氏定氮瓶中，加入15mL 濃硫酸、0.5g 硫酸銅及4.5g 無水硫酸鈉，小火加熱至沸騰后，加大火力進(jìn)行消化。待瓶內(nèi)溶液澄清呈暗綠色時(shí)，不斷地?fù)u動(dòng)瓶子，使瓶壁黏附的殘?jiān)芟孪４績?nèi)溶液澄清后取出冷卻，移至25mL 容量瓶中并用水稀釋至標(biāo)線。,樣品測定：準(zhǔn)確吸取上述消化好的樣液 10mL（如取5mL 則補(bǔ)加5mL 空白酸原液），置于100mL 容量瓶中，并用水稀釋至標(biāo)線。

40、準(zhǔn)確吸取2mL 于25mL 容量瓶中（或比色管中），加入5mL 磷酸鹽緩沖溶液，以下操作手續(xù)按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟進(jìn)行，并以試劑空白為參比液測定樣液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含氮量。,4說明 樣品消化完全后當(dāng)天進(jìn)行測定結(jié)果的重現(xiàn)性好，但樣液放至第二天比色即有變化。 溫度對顯色影響極大，故應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。 對谷物及飼料等樣品的測定證明，此法結(jié) 果與凱氏法基本一致。 試劑配制請參考黃偉坤等編著食品檢驗(yàn)與分析書。,八、紅外光譜法 1原理 紅外光譜法測定由食品或其他物質(zhì)中分子引起的輻射吸收（近紅外、中紅外、遠(yuǎn)紅外區(qū)）。 食品中不同的功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段（

41、6.47m）和近紅外（NIR）波段（如33003500nm，20802220nm，15601670nm）的特征吸收可用于測定食品中的蛋白質(zhì)含量。針對所要測的成分，用紅外波長光輻射樣品，通過測定樣品反射或透射光的能量（反比于能量的吸收）可以預(yù)測其成分的濃度。,2應(yīng)用 紅外牛乳分析儀采用中紅外光譜法測定牛乳蛋白質(zhì)含量，同時(shí)近紅外光譜儀也廣泛應(yīng) 用于食品蛋白質(zhì)的分析中（如谷物、谷類制品、肉類和乳制品中）。這些儀器非常昂貴，且 多須經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)試。但分析人員只需經(jīng)最低程度的培訓(xùn)就可以快速分析樣品（30s2min）。,第四節(jié) 氨基酸的定量測定,甲醛滴定法 茚三酮比色法 非水溶液滴定法 雙指示劑法 電位法

42、三硝基苯磺酸法 鄰苯二甲醛法,一、氨基酸的一般定量測定,（一）甲醛滴定法 1原理 氨基酸具有酸性的-COOH 基和堿性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2 基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿溶液來滴定-COOH 基，并用間接的方法測定氨基酸總量。反應(yīng)式（有三種不同的推論）如下：,2方法特點(diǎn)及應(yīng)用 此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含

43、有酚羧基，滴定時(shí)也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng)，往往使結(jié)果偏高。,3操作方法 吸取含氨基酸約20mg 的樣品溶液于100mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0mL置于200mL 燒杯中，加水60mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液mL 數(shù)，供計(jì)算總酸含量。,加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)。 同時(shí)取80mL 蒸餾水置于另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至pH82，（此時(shí)不計(jì)堿消耗量），再加

44、入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，作為試劑空白試驗(yàn)。,4結(jié)果計(jì)算 氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）= 式中： V1樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； V2空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL； c氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L； m測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量，g； 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmoL。,5說明 本法準(zhǔn)確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。 渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測定。,(二)茚三酮比色法 1原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)

45、紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應(yīng)），可用吸光光度法測定。 該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據(jù)此可以測定樣品中氨基酸含量。,2操作方法 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取 200g /mL 的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當(dāng)于0、100、200、300、400、500、600g 氨基酸），分別置于25mL 容量瓶或比色管中，各加水補(bǔ)充至容積為4.0mL，然后加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各1mL，混合均勻，于水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標(biāo)線，搖勻。靜置15min

46、后，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克 數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,(2)樣品測定 吸取澄清的樣品溶液 14mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，用測得的A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得對應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。,4說明及注意事項(xiàng) 通常采用的樣品處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎樣品 510g 或吸取樣液樣品510mL，置于燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用3040mL 熱水洗滌活性炭，收集濾液于100mL 容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻備測。 茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，

47、使用前須進(jìn)行 純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著食品檢驗(yàn)與分析。,(三)非水溶液滴定法 1原理 氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。根據(jù)酸堿的質(zhì)子學(xué)說：一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為酸，能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿；弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強(qiáng)，而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強(qiáng)，因此本來在水溶液中不能滴定的弱堿或弱酸，如果選擇適當(dāng)?shù)娜軇┦蛊鋸?qiáng)度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中 呈現(xiàn)中性，而在冰醋酸中就能接受質(zhì)子顯示出堿性，因此可以用高氯酸等強(qiáng)酸進(jìn)行滴定。,本法適合于氨基酸成品的含量測定。允許 測定的范圍是幾十毫克的氨基酸,2測定 (1)直接法（適用于能溶解于冰醋

48、酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解 于20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定（用10mL 體積 的微量滴定管），終點(diǎn)為紫色剛消失，呈現(xiàn)藍(lán)色?？瞻坠転椴缓被岬谋姿嵋海味ㄖ?同樣終點(diǎn)顏色。,(2)回滴法（適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣 品3040mg 左右，溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩余的酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經(jīng)過綠、藍(lán)至初次出現(xiàn)不褪的紫色為終點(diǎn)。,3說明 (1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組 氨

49、酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解于冰 醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。,(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解于2mL 甲酸中，再加20mL 冰醋酸，直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。,二、個(gè)別氨基酸的定量測定,（一）賴氨酸的測定 1原理 用銅離子阻礙游離氨基酸的-氨基,使賴氨酸的-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基 苯(FDNB)反應(yīng),生成-DNP-賴氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰, 從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.,2試劑 (1)氯化銅液：稱28.0g 無

50、水氯化銅，用水稀釋至1000mL。 (2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。 (3)硼酸鹽緩沖液（pH9.19.2）：稱54.64g 帶有10 結(jié)晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至1000mL 。,(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉淀物，洗滌離心3 次，把最后的沉淀物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，并用緩沖液稀釋至1L。 (5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。 (6)賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取

51、一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標(biāo)準(zhǔn)液。 (7)100g/L 丙氨酸溶液。,3測定 (1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置于100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)工作液5mL（相當(dāng)1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。 (2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。,(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不斷搖動(dòng)使之酸化和分散均勻。 (4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40

52、mL 懸浮液進(jìn)行離心。 (5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并將溶液收集于有刻度試管中,于65水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數(shù)。,(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。 (7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)液對照，求出樣品中賴氨酸-HCl 的含量。 本法在 040mg/L 賴氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。,4說明 (1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助于賴氨酸-HCl 濃度 具有良好的線性關(guān)系。 (2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生

53、物除去，并把FDWB 的產(chǎn)物破壞，否則這些產(chǎn)物在390nm 處存在干擾。,（二）色氨酸的測定,1.原理 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生成哈爾滿化合物（norharman），具有特征熒光值，可以進(jìn)行定量測定。反應(yīng)式如下：,2試劑 (1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl36H2O)41mg，加入10%三氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。 (2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%38%)5.5mL，加水至100mL。 (3)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,置棕色瓶

54、中備用,使用時(shí)用水稀釋成1mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.,3測定 稱取樣品粉末 100200mg 于離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻后過夜，以3000r/min 速度離心。將乙醚提取液移入試管內(nèi),并用乙醚洗滌殘?jiān)? 次，收集乙醚液于試管中，于40水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，于110水解1624h。水解液用4mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)至pH68 后,用水定容至50mL,過濾備用。,吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，搖勻后于100水浴中加熱1h，取出，冷卻后用水定容至10mL。在激發(fā)波長為36

55、5nm，發(fā)射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強(qiáng)度，與色氨酸標(biāo)樣作對照，求出樣品中色氨酸含量。 本法在 010mg/L 色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。,第五節(jié) 氨基酸的分離及測定,一、薄層色譜法,1原理 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf 值，不同成分則有不同的Rf 值，因而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，即可鑒別樣品中所含氨基酸的種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。,2試劑 展開劑：叔丁醇-甲乙酮-氫氧化銨-水（531

56、1），須臨時(shí)配制。 展開劑：異丙醇-甲酸-水（2015），須臨時(shí)配制。 5g/L 茚三酮的無水丙酮溶液 羧甲基纖維素或微晶纖維素 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：濃度02mg/mL。,3操作方法 薄層板制備：稱取10g 微晶纖維素，加入20mL 水和2.5mL 丙酮，研磨1min 后調(diào) 成勻漿后，用薄層涂布器于潔凈干燥的玻璃板上（玻璃板200200mm，厚度3mm），使涂 層厚度以300500m 為宜（比一般的薄板厚一些），置水平架上晾干后即可使用。, 樣品液制備：稱取樣品5mg，放入小試管內(nèi)，加入0.6mL5.7mol/L 鹽酸溶液（恒沸 點(diǎn)鹽酸）。在火焰上熔融封口后，置于110烘箱中水解24h。取出，打開

57、封口，置真空干燥器中減壓抽干，以去掉多余的鹽酸。以稀氨水調(diào)節(jié)pH7 左右，再加入10%異丙醇至最后體 積達(dá)0.5mL，置冰箱中保存?zhèn)溆谩? 點(diǎn)樣：用微量注射器吸取樣液5uL（每種氨基酸約1 至10g），分次滴加在距薄板 下邊緣約2cm 處，邊點(diǎn)邊用電吹風(fēng)吹干，使點(diǎn)樣直徑在23mm 內(nèi)。, 展開：采用雙向上行法展開。將已點(diǎn)樣的兩個(gè)薄板的薄層面朝外合在一起，放入層析缸（250100250mm）中的玻璃船內(nèi)，將兩板的上端分開靠在缸壁上。先進(jìn)行堿向展層，將展開劑I 從兩塊板中間加入，薄層浸入展開劑中的深度約0.5cm，蓋好缸蓋，進(jìn)行展開。 當(dāng)溶劑前沿達(dá)到距原點(diǎn)約11cm 時(shí)（時(shí)間約11.5h），即可將薄板取出，冷風(fēng)吹干，放平， 刮去前沿上端的黃色雜質(zhì)部分。再進(jìn)行酸向?qū)诱?，將薄板重新放入另一個(gè)缸中的船槽內(nèi)，與 堿向體系成垂直方向，加入展開劑II，進(jìn)行展層。展開至