第10章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定.ppt_第1頁(yè)
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1、主要內(nèi)容,第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定,第一節(jié) 概述(理解) 第二節(jié) 蛋白的定性測(cè)定 一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)(理解) 二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)(理解) 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 一、凱氏定氮法(掌握) 二、其他測(cè)定方法(理解) 第四節(jié) 氨基酸的定性測(cè)定(了解) 第五節(jié) 氨基酸的定量測(cè)定 一、 氨基酸的一般定量測(cè)定(理解) 二、 個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定(自學(xué),理解),第一節(jié) 概述 一、蛋白質(zhì)的作用 1、蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ): 是構(gòu)成細(xì)胞的組成成分 2、擔(dān)當(dāng)重要的生理功能: 是生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織時(shí)所需氨基酸的來(lái)源, 物質(zhì)代謝的生物催化劑, 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及氣體的運(yùn)輸 遺傳信息的傳遞與表達(dá) 人體內(nèi)的組

2、質(zhì)液pH(健康pH在7.37.5之間)及水分的平衡 為免疫系統(tǒng)制造對(duì)抗細(xì)菌和感染的抗體;,1、蛋白質(zhì)的組成: 蛋白質(zhì)由很多的AA單體以肽鍵結(jié)合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的含氮有機(jī)化合物,有的含有P、S、 Cu、Fe、I等元素,分子量高達(dá)數(shù)萬(wàn)數(shù)百萬(wàn)。含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其它有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。 2、蛋白質(zhì)系數(shù):一般而言,蛋白質(zhì)含氮量約為16%,即1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì),此數(shù)值(6.25)稱(chēng)為蛋白質(zhì)系數(shù)。 3、氨基酸的種類(lèi): 自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的氨基酸約有170多種,其中組成蛋白的氨基酸只有22種(都是-AA),其中對(duì)人而言的必需氨基酸有8種(犬的必需氨基酸有9種)。 4、組成蛋白的氨基酸(-AA

3、)的通式及AA兩性電解質(zhì)特性:,二、蛋白質(zhì)的組成及特性,必需氨基酸: 在組成蛋白的氨基酸中,在人體內(nèi)不能合成或合成速度很慢的氨基酸。 人類(lèi)而言,優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的定義: l蛋白質(zhì)中必需氨基酸的含量高,且總體氨基酸的組成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白質(zhì)。動(dòng)物來(lái)源和豆類(lèi)食品是很好的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。,若蛋白質(zhì)或某些必需氨基酸供給不足: l 會(huì)導(dǎo)生物體生長(zhǎng)發(fā)育緩慢,體重減輕,抵抗力下降,容易患??; l 男性精液品質(zhì)下降,精子數(shù)量減少; l 女性引起不孕,即使懷孕,胎兒也常發(fā)育不良而發(fā)生死胎或畸胎。 開(kāi)發(fā)蛋白質(zhì)的生理效價(jià)高的食品及合理配膳等 是食品科學(xué)從業(yè)者的一項(xiàng)重要任務(wù)!,谷類(lèi)和面食: (%) 大米(糙米、長(zhǎng)

4、粒、生) 7.9 大米(白米、長(zhǎng)粒、生) 7.1 小麥粉(整粒) 13.7 玉米粉(整粒、黃色) 6.9 玉米淀粉 0.3 豆類(lèi): 大豆(成熟的種子、生) 36.5 豆(腰子狀、所有品種) 23.6 豆腐(生、普通) 8.1 水果和蔬菜: 蘋(píng)果(生、帶皮) 0.2 蘆筍(生) 2.3 草莓(生) 0.6 萵苣(冰、生) 1.0,肉、家禽、魚(yú): 牛肉(頸肉、烤前腿) 18.5 牛肉(腌制、干牛肉) 29.1 雞(可供煎炸的雞胸肉、生) 23.1 火腿(切片、普通的) 17.6 雞蛋(生、全蛋) 12.5 魚(yú)(太平洋鱈魚(yú)、生) 17.9 魚(yú)(罐裝金槍魚(yú)滴干的固體) 26.5 乳制品: 牛乳(全脂、

5、液體) 3.3 牛乳(脫脂、干) 36.2 干酪 24.9 酸奶(普通的、低脂) 5.3,三、部分食品的蛋白質(zhì)含量,四、常用的蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定方法 凱氏定氮法 雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法 近紅外光譜快速定量方法 氨基酸總量的測(cè)定 本章重點(diǎn): 凱氏定氮法的原理及注意事項(xiàng),雙縮脲法、印三酮法及氨基酸自動(dòng) 分析儀的原理及注意事項(xiàng),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法,氨基酸總量的測(cè)定。,第二節(jié) 蛋白質(zhì)的定性測(cè)定,一、蛋白質(zhì)的一般顯色法,1氨基黑法,氨基黑10B 是酸性染料,其磺基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽,是最常用的蛋白質(zhì)染料。,(1)經(jīng)點(diǎn)樣后的層析紙經(jīng)電泳或?qū)游龊螅氚被?0B 醋酸甲醇溶液(13g 氨基黑10B

6、溶解于100mL 冰醋酸和900mL 甲醇中,充分搖勻,放置過(guò)夜,過(guò)濾后可反復(fù)使用幾次)中,染色10min,染色后,用10%醋酸甲醇溶液洗滌約57 次,待背景變成淺藍(lán)色后干燥。若欲進(jìn)行洗脫,用0.1mol/L 氫氧化鈉浸泡30min,于595nm 比色測(cè)定。,(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳后染色:用甲醇固定后,在含1%氨基黑10B 0.1mol/L 氫氧化 鈉溶液中染色5min(室溫),用5%乙醇洗脫背景底色?;蛴?%醋酸固定后,于96水浴中 用7%醋酸(含0.51%氨基黑10B)染色10min,7%醋酸洗脫背景底色。用氨基黑10B 染SDS-蛋白質(zhì)時(shí)效果不好。如果凝膠中含有兼性離子載體,先用10%

7、三氯醋酸浸泡,每隔2h換液一次,約10 次,再進(jìn)行染色。,(3)凝膠薄層的直接染色:將凝膠薄層放在一定濕度的烘箱內(nèi)逐步干燥(50),沒(méi)有調(diào)溫調(diào)濕箱時(shí)用一張濾紙放于烘箱內(nèi),以保持一定的濕度。將干燥的薄層板于漂洗液(750mL 甲醇,200mL 水,50mL 冰醋酸)中預(yù)處理10min,然后在染色液(750mL 甲醇,200mL水,50mL 冰醋酸,在此溶液中加氨基黑10B 飽和)中染色5h,再在漂洗液內(nèi)洗滌。,本法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高,缺點(diǎn)是花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng),不同蛋白質(zhì)染色強(qiáng)度不同。,2溴酚藍(lán)法,此法缺點(diǎn)是靈敏度低,某些摩爾質(zhì)量低的蛋白質(zhì)可能染不上顏色。,3考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯亮藍(lán)R250,考馬斯亮藍(lán)法

8、(Stain with Coomassie blue):考馬斯亮藍(lán)法 靈敏度比氨基黑高五倍,尤其適用于SDS電泳的微量蛋白質(zhì)的染 色。在549nm有最大吸收值,蛋白質(zhì)在110g呈線性關(guān)系。可 以檢測(cè)出0.1 ug 的蛋白質(zhì)條帶.,(1)經(jīng)電泳后濾紙或醋酸纖維膜在200g/L 磺基水楊酸溶液中浸1min,取出后放入2.5g/L 考馬斯亮藍(lán)R250 染色液(配制用的蒸餾水內(nèi)不含有重金屬離子)浸5min,在蒸餾水或7%醋酸中洗四次,每次5min,于90放置15min。,(2)聚丙烯酰胺凝膠也可同上處理。在酸性醇溶液中,考馬斯亮藍(lán)-兼性離子載體絡(luò)合 物溶解度顯著增大,因此能免去清除兼性離子載體的步驟。

9、可運(yùn)用下列方法之一: 凝膠用 10%三氯醋酸固定,在10%三氯醋酸-1%考馬斯亮藍(lán)R250(191)中室溫染色 0.5h,用10%三氯醋酸脫底色。,凝膠浸入預(yù)熱至 60的0.1%考馬斯亮藍(lán)固定染色液(150g 三氯醋酸,45g 磺基水楊酸溶于375mL 甲醇和930mL 蒸餾水的混合液。每1g 考馬斯亮藍(lán)R250 溶于此混合液1000mL中)中約30min,用酸性乙醇漂洗液(乙醇+水+冰醋酸=25+25+8)洗盡背景顏色。染色后凝膠保存于酸性乙醇漂洗液中。本法靈敏度:卵清蛋白0.03g,血清清蛋白0.02g,血紅蛋0.01g。,凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)固定染色液(2g 考馬斯亮藍(lán)R250,溶于100

10、mL 蒸餾水中,加2mol/L 硫酸100mL,過(guò)濾除去沉淀,向清液中滴加10mol/L KOH 至顏色從綠變藍(lán)為止。量體積,每100mL 加入三氯醋酸12g)中1h,然后用蒸餾水洗凈背景顏色或在0.2%H2SO4 溶液中浸泡片刻脫除背景顏色。染色后的凝膠保存于蒸餾水中。本法機(jī)制未明,起染色作用的可能不是考馬斯亮藍(lán)本身,靈敏度不如上法。,4酸性品紅法 經(jīng)電泳后濾紙置于 0.2%酸性品紅溶液中(2g 酸性品紅溶解于500mL 甲醇,400mL 蒸 餾水和100mL 冰醋酸中)加熱染色15min;取出后浸入醋酸甲醇溶液(500mL 甲醇,加400mL蒸餾水和100mL 冰醋酸)15min;然后浸入

11、10%醋酸溶液,每次20min,至背景無(wú)色為止。若欲進(jìn)行比色,可用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡2h,在波長(zhǎng)為570nm 處比色。,5氨基萘酚磺酸法 聚丙烯酰胺凝膠電泳后,把凝膠暴露于空氣中幾分鐘,或在 2mol/L HCl 中浸一下使表 層蛋白變性,再在0.003%氨基萘酚磺酸的0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中染3min,在紫外光下可顯黃綠色熒光。這樣的染色可保留凝膠內(nèi)部的酶和抗體的活性。如不需保留活性時(shí),可先在3mol/L HCl 中浸2min 以上使蛋白質(zhì)充分變性,再染色。,二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng),1糖蛋白的顯色 (1)過(guò)碘酸-Schiff 氏試劑顯色法: 試劑

12、過(guò)碘酸液:1.2g 過(guò)碘酸溶解于30mL 蒸餾水中,加15mL 0.2mol/L 醋酸鈉溶液及100mL 乙醇。臨用前配制,或保存在棕色瓶中,可用數(shù)日。,還原液:5g 碘化鉀,5g 硫代硫酸鈉溶100mL 蒸餾水中,加150mL95%乙醇及2.5mL 2mol/LHCl 。 現(xiàn)配現(xiàn)用。 亞硫酸品紅液:2g 堿性品紅溶解于400mL 沸水中,冷卻至50過(guò)濾。在濾液中加入10mL 2mol/L 鹽酸和4g 偏亞硫酸鉀(K2S2O5),將瓶塞緊放在冰箱中過(guò)夜,加1g 活性炭,過(guò)濾,再逐漸加入2mol/L 鹽酸,直至此溶液在玻片上干后不變紅色為止,保存在棕色瓶中,冰箱貯存,當(dāng)溶液變紅時(shí)不可以再用。,亞

13、硫酸鹽沖洗液: 1mL 濃硫酸,0.4g 偏亞硫酸鉀加入到100mL 水中。 顯色步驟 將含有樣品的濾紙浸在 70%乙醇中,片刻后吹干,在高碘酸液中浸5min,用70%乙醇洗一次,在還原液中浸58min,再用70%乙醇洗一次,在亞硫酸品紅液中浸2425min, 用亞硫酸鹽沖洗液洗三次,并用乙醇脫水后,放在玻璃板上吹干。顯色結(jié)果:在黑灰色的底 板上呈現(xiàn)紫紅色。,(2)甲苯胺藍(lán)(Toluidine blue)顯色法: 試劑 試劑甲:1.2g 過(guò)碘酸溶解在30mL 蒸餾水中,加15mL 0.5mol/L 醋酸鈉和100mL 96%乙醇?,F(xiàn)配現(xiàn)用。 試劑乙:100mL 甲醇加20mL 冰醋酸及80mL

14、 蒸餾水。 試劑丙:溴水。試劑 試劑丁:10g/L 甲苯胺藍(lán)水溶液。 試劑戊:40g/L 鉬酸銨溶液。,顯色步驟: 將點(diǎn)有樣品的濾紙依次在試劑甲中浸 15min,試劑丙中浸15min,用自來(lái)水漂洗,再在試劑丁中浸30min,自來(lái)水中漂洗至沒(méi)有藍(lán)色染料滲出(約3040min)后,再依次在試劑戊中浸3min,試劑乙中浸15min,丙酮中浸2min 后在空氣中干燥。顯色結(jié)果:糖蛋白部分染成藍(lán)色,背景帶有紅紫色。,(3)阿爾新藍(lán)(Alcian blue )顯色法: 聚丙烯酰胺凝膠在 12.5%三氯醋酸中固定30min 后,再用蒸餾水輕輕漂洗。放入1%過(guò) 碘酸液(在3%醋酸中)中氧化50min。用蒸餾水

15、反復(fù)洗滌去除多余的過(guò)碘酸鹽。再放入0.5%偏重亞硫酸鉀中還原剩余的過(guò)碘酸鹽30min,再用蒸餾水洗滌。浸在0.5%阿爾新藍(lán)(在3%醋酸中)溶液中染4h。,2脂蛋白的顯色 (1)蘇丹黑(Sudan black)顯色法: 將 0.1g 蘇丹黑B 溶解于煮沸的100mL 60%的乙醇溶液中,制備成飽和溶液,冷卻后過(guò)濾兩次,備用。顯色時(shí)將點(diǎn)有樣品的濾紙浸于上述溶液中,3h 后取出,用50%乙醇溶液洗滌兩次,每次15min,空氣中干燥。 聚丙烯酰胺凝膠電泳中預(yù)染法:加蘇丹黑B 到無(wú)水乙醇中成飽和液,并震搖使乙酰化。 用前過(guò)濾。按樣品液的1/10 量加入樣品液中染色1h 或4過(guò)夜。染色后的樣品再進(jìn)行電泳。

16、,(2)油紅-O(Oil red O)顯色法: 0.04g 油紅溶解于100mL60%的乙醇中,30放置過(guò)夜(16h)使充分飽和后,在30下濾去多余的染料,澄清液即可用于染色。將濾紙浸入染料液中,在30下染色18h 后,用水沖洗,使背景變淺,在空氣中干燥。脂蛋白為紅色,背景為桃紅色。本法在30以下顯色時(shí),會(huì)引起染料沉淀。,第三節(jié) 蛋白質(zhì)的定量測(cè)定 一、凱氏定氮法 (一)常量凱氏定氮法 1、原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質(zhì)分解, 其中碳和氫被氧化成二氧化碳和水逸出,而部分硫酸被還原成 二氧化硫,樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與過(guò)量的硫酸結(jié)合成硫酸 銨; 然后加堿蒸餾,使氨蒸出,用弱酸硼酸

17、吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng) 酸如鹽酸或硫酸溶液滴定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì) 的含量。,催化劑 煮沸,(1)、消化:NCOC + 濃H2SO4 (NH4)2SO4 + CO2 + SO2 + H2O (2)、氨化: 2NaOH +(NH4)2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O (3)、吸收: 2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O (4)、滴定:(NH4)2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds ),凱氏定氮法原理(方程式),2、結(jié)果計(jì)算,

18、凱氏定氮法操作方法,a消化裝置,1、硫酸鉀 及硫酸銅的作用 2、火候控制 3、裝置的氣密性 4、何時(shí)加堿 5、難消化的 對(duì)策 6、停止蒸餾,b蒸餾吸收裝置,操作方法,繼續(xù)微沸30min,冷卻 定容,0.5g Cuso4 10gk2so4,20mlH2so4,先小火,待內(nèi)容物全部炭化,泡沫停止,加大火,保持瓶?jī)?nèi)液體策沸,在消化反應(yīng)中,為了加速蛋白質(zhì)的分解,縮短消化時(shí)間,常加入下列物質(zhì): 1)硫酸鉀 加入硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解。它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度。其反應(yīng)式如下: K2SO4 + H2SO4 = 2KHSO4 2KHSO4 = K2SO4 + H2O+ SO3

19、但硫酸鉀加入量不能太大,否則消化體系溫度過(guò)高,又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失: (NH4)2SO4 NH3+(NH4)HSO4 (NH4)HSO4 NH3+ SO3+ H2O 2)硫酸銅 硫酸銅起催化劑的作用。硫酸銅的作用機(jī)理如下所示: 2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ O2,C + 2CuSO4 Cu2SO4 + SO2+ CO2Cu2SO4 + 2H2SO4 2CuSO4 + 2H2O + SO2,溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。指示消化到達(dá)終點(diǎn),說(shuō)明及注意事項(xiàng) 當(dāng)濃硫酸的用量為改變時(shí),硫酸銅,硫酸鉀,氫氧化鈉等試劑應(yīng)按比例改變。 所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制。 消化時(shí)不要

20、用強(qiáng)火,應(yīng)保持和緩沸騰,以免粘附在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮損失。 消化過(guò)程中應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶, 以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體 殘?jiān)聪虏⒋龠M(jìn)其消化完全。,樣品中若含脂肪或糖較多時(shí),消化過(guò)程中易產(chǎn)生大量泡沫,為防止泡沫溢出瓶外,在開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱,并不停地?fù)u動(dòng);或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑,并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí),可將凱氏燒瓶冷卻,加入30%過(guò)氧化氫23mL后再繼續(xù)加熱消化。 若取樣量較大,如干試樣超過(guò)5g,可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量。,一般消化至呈透明后,繼續(xù)消化30min即可,但對(duì)于含有特別難以氨化的氮化合

21、物的樣品,如含賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí),需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全,消化液呈藍(lán)色或淺綠色,但含鐵量多時(shí),呈較深綠色。 蒸餾裝置不能漏氣。 蒸餾前若加堿量不足,消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀,此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。,硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過(guò)40,否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失,此時(shí)可置于冷水浴中使用。 11蒸餾完畢后,應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口,再蒸1min后關(guān)掉熱源,否則可能造成吸收液倒吸。 12混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。,(二)微量凱氏定氮法 1、原理同常量凱氏定氮法。,微量凱氏定氮裝置,10ml140%Na

22、oH和少量水,綠色,紅色,灰色,2、 說(shuō)明及注意事項(xiàng) 蒸餾前給水蒸汽發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3 容積處,加甲基橙指示數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升以使其始終保持酸性,這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測(cè)定結(jié)果。 20g/L 硼酸吸收液每次用量為25mL,用前加入甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑2 滴。 在蒸餾時(shí),蒸汽發(fā)生要均勻充足,蒸餾過(guò)程中不得?;饠鄽?,否則將發(fā)生倒吸。加堿要足量,操作要迅速;漏斗應(yīng)采用水封措施,以免氨由此逸出損失。,(三)、自動(dòng)凱氏定氮法 所謂自動(dòng)凱氏定氮法,是將常量凱氏定氮裝置組裝成具有自動(dòng)操作功能的一套裝置,其原理與試劑與常量法相同,操作方法簡(jiǎn)述如下:,kdn-04b全自動(dòng)凱氏定氮儀價(jià)格,操作方法

23、: (1)稱(chēng)取0.501.00g 樣品,置于消化瓶?jī)?nèi),加入硫酸銅與硫酸鉀制成的片劑兩片,加入濃硫酸10mL,將消化瓶置于紅外線消化爐中。消化爐分成兩組,每行一組共4 個(gè)消化爐。消化瓶放入消化爐后,用連接管連接密封住消化瓶,開(kāi)啟抽氣裝置,開(kāi)啟消化爐的電源,30min 后8 個(gè)樣品消化完畢,消化液完全澄清并呈綠色。 (2)取出消化瓶,移裝于自動(dòng)凱氏定氮儀中,接連開(kāi)啟加水的電鈕、加堿電鈕、自動(dòng)蒸餾滴定電鈕,開(kāi)啟電源,大約經(jīng)12min 后由數(shù)顯裝置即可給出樣品總氮百分含量,并記錄樣品總氮百分比。根據(jù)樣品的種類(lèi)選擇相應(yīng)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)F,即可得出樣品中蛋白質(zhì)含量。 (3)開(kāi)啟排廢液電鈕及加水電鈕,排出廢

24、液并對(duì)消化瓶清洗一次。大約在2h 左右時(shí)間內(nèi)可完成8 個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量測(cè)定工作。該法具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。,二、雙縮脲法,1原理 當(dāng)脲被小心地加熱至 150160時(shí),可由兩個(gè)分子間脫去一個(gè)氨分子而生成二縮脲(也叫雙縮脲),反應(yīng)如下:,雙縮脲與堿及少量硫酸銅溶液作用生成紫紅色的配合物,此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng):,此可用吸收光度法來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量,該配合物的最大吸收波長(zhǎng)為560nm。,2方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍 本法靈敏度較低,但操作簡(jiǎn)單快速,故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。 本法亦適用于豆類(lèi)、油料、米谷等作物種子及肉類(lèi)等樣品測(cè)定。,3操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:以采用凱氏定氮

25、法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣。按蛋白質(zhì)含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分別稱(chēng)取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣于8 支50mL 納氏比色管中,然后各加入1mL 四氯化碳,再用堿性硫酸銅溶液準(zhǔn)確稀釋至50mL,振搖10min,靜置1h,取上層清液離心5min,取離心分離后的透明液 于比色皿中,在560nm 波長(zhǎng)下以蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測(cè)定各溶液的吸光度A,以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo),吸光度A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,操作方法,1mlccl4 堿性Cuso4,加水至50ml,4結(jié)果計(jì)算,式中 c由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量,mg; m樣品

26、質(zhì)量,g。,5說(shuō)明及注意事項(xiàng) 蛋白質(zhì)的種類(lèi)不同,對(duì)發(fā)色程度影響不大。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作完整后,無(wú)需每次再作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 含脂肪高的樣品應(yīng)預(yù)先用醚抽出棄去。 樣品中有不溶性成分存在時(shí),會(huì)給比色測(cè)定帶來(lái)困難,此時(shí)可預(yù)先將蛋白質(zhì)抽出后再進(jìn)行測(cè)定。,當(dāng)肽鏈中含有脯氨酸時(shí),若有多量糖類(lèi)共存,則顯色不好,會(huì)使測(cè)定值偏低。 堿性硫酸銅溶液由0.1mol 氫氧化鉀、5g 酒石酸鉀鈉、1.6g 硫酸銅溶于水后加水至1000mL 配成。,三、紫外吸收法,1A280nm 光吸收法 (1)原理 蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物(“月示”、胨、肽和氨基酸)的芳香環(huán)殘基-NH-CH(R)-CO-在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)一定波長(zhǎng)的光具有選擇吸收作用。在此

27、波長(zhǎng)(280mm)下,光吸收程度與蛋白質(zhì)濃度(3mgmL)成直線關(guān)系,因此,通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的吸光度,并參照事 先用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可求出樣品蛋白質(zhì)含量。,(2)適用范圍 本法操作簡(jiǎn)便迅速,常用于生物化學(xué)研究工作;但由于許多非蛋白質(zhì)成分在紫外光區(qū) 也有吸收作用,加之光散射作用的干擾,故在食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用并不廣泛,最早用于測(cè) 定牛乳的蛋白質(zhì)含量,也可用于測(cè)定小麥面粉、糕點(diǎn)、豆類(lèi)、蛋黃及肉制品中的蛋白質(zhì)含量。,(3)操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品2.00g,置于50mL 燒杯中,加入0.1mol/L 檸檬酸溶液30mL,不斷攪拌10min 使其充分溶解

28、,用四層紗布過(guò)濾于玻璃離心管中,以30005000r/min的速度離心510min,傾出上清液。分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 于10mL 容量瓶中,各加入8mol/L 尿素的氫氧化鈉溶液定容至標(biāo)線,充分振搖2min,若渾濁,再次離心直至透明為止。將透明液置于比色皿中,以8mol/L 尿素的氫氧化鈉溶液作參比液,在280nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度A。,樣品的測(cè)定:準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣1.00g,如前處理,吸取的每毫升樣品溶液中含有大約38mg 的蛋白質(zhì)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的操作條件測(cè)定其吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蛋白質(zhì)的含量。,(4)結(jié)果計(jì)算,式中:c從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)

29、質(zhì)量,mg; m測(cè)定樣品溶液所相當(dāng)于樣品的質(zhì)量,mg。,(7)說(shuō)明及注意事項(xiàng) 測(cè)定牛乳樣品時(shí)的操作手續(xù):準(zhǔn)確吸取混合均勻的樣品0.2mL于25mL納氏比色管中,用95%97%的冰醋酸稀釋至標(biāo)線,搖勻,以9597%冰醋酸為參比液,用1cm 比色皿 于280nm 處測(cè)定吸光度,并用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定樣品蛋白質(zhì)含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線以采用凱氏定氮 法已測(cè)出蛋白質(zhì)含量的牛乳標(biāo)準(zhǔn)樣繪制)。,測(cè)定糕點(diǎn)時(shí),應(yīng)將表皮的顏色去掉。 溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解有影響,操作溫度應(yīng)控制在 2030。,2A260nm 和A280nm 比值法 (1)原理 凡是有共軛雙鍵的物質(zhì),均具有紫外吸收值。因此,若樣品中含核酸,則嘌呤、嘧啶兩類(lèi)堿基對(duì)蛋白

30、質(zhì)的測(cè)定產(chǎn)生干擾,應(yīng)加以校正。核酸在260nm 處的紫外吸收值大于280nm處的紫外吸收值,但蛋白質(zhì)恰恰相反。利用這些性質(zhì),通過(guò)計(jì)算可以適當(dāng)較正核酸對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的干擾。但是,由于不同的蛋白質(zhì)和核酸對(duì)紫外吸收不同,校正后的測(cè)定結(jié)果還存 在一定的誤差。,(2)測(cè)定 取一定量的樣品稀釋液,分別測(cè)出樣品的A280nm 和A260nm的值,計(jì)算出A280nm/A260nm 的比值后,從下表中查出校正因子“F”值,同時(shí)可查出該樣品內(nèi)混雜的核酸百分含量。將F 值代入,由下述公式可直接算出該樣品的蛋白質(zhì)含量: 蛋白質(zhì)含量( mg/mL=F1/dA280nmn 式中A280nm該樣品液在280nm 波長(zhǎng)下的

31、吸收值; d石英杯的厚度(cm); n樣品的稀釋倍數(shù)。,四、福林-酚比色法,1原理 蛋白質(zhì)與福林(Folin)-酚試劑反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理主要是蛋白質(zhì)中的肽 鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng),同時(shí)也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸-磷鎢 酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比,是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng) 典方法之一。,2試劑 福林酚試劑甲:將溶液 A50mL 和溶液B 1mL 混合即成?,F(xiàn)用現(xiàn)配,過(guò)期失效。溶液 A:1g Na2CO3 溶于50mL 0.1mol/LNaOH 溶液中。溶液 B:將1%硫酸溶液和20g/L 酒石酸鈉(鉀)溶液等體積混合而成。,福林酚試劑乙

32、:在 1.5L 體積的磨口回流管中,加入100g 鎢酸鈉(Na2WO42H2O)、25g 鉬酸鈉(Na2MoO42H2O)以及700mL 蒸餾水,再加入50mL85%磷酸溶液及100mL 濃鹽酸,充分混合,接上回流冷凝管,以小火回流10h?;亓魍戤?,加入150g 硫酸鋰、50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴,開(kāi)口繼續(xù)沸騰15min,以便除去過(guò)量的溴,冷卻后加水定容至1000mL,過(guò)濾,濾液呈微綠色,置于棕色瓶中保存。使用時(shí)用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,以酚酞作指示劑,最后用蒸餾水稀釋?zhuān)s1 倍左右),使最終濃度為1.0mol/L. 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱(chēng)取牛血清蛋白或酪蛋白,配制成100g/mL 溶液。,

33、3測(cè)定 吸取一定量的樣品稀釋液,加入試劑甲3.0mL,置于25中水浴保溫10min,再加 入試劑乙0.3mL,立即混勻,保溫30min,以介質(zhì)溶液調(diào)零,測(cè)定A750nm 值,與蛋白質(zhì) 標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照,求出樣品的蛋白質(zhì)的含量。 本法在060mg/L 蛋白質(zhì)范圍呈良好線性關(guān)系。,4說(shuō)明 福林-酚法靈敏度高,實(shí)測(cè)下限較雙縮脲法約小2 個(gè)數(shù)量級(jí)。但對(duì)雙縮脲法有干擾的物質(zhì)對(duì)福林酚法的影響更大。酚類(lèi)及檸檬酸均對(duì)本法有干擾。,五、染料結(jié)合法 1原理 在特定條件下,蛋白質(zhì)可與某些染料(如胺黑10B 或酸性橙12 等)定量結(jié)合而生成沉淀,用分光光度計(jì)測(cè)定沉淀反應(yīng)完成后剩余的染料量可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量,進(jìn)而可求

34、得樣品中蛋白質(zhì)含量。 2適用范圍 本法適用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品。,3試劑,檸檬酸溶液:稱(chēng)取檸檬酸(含1 分子結(jié)晶水)20.14g,用水稀釋至1000mL,加入1.0mL丙酸(防腐),搖勻后pH 應(yīng)為2.2。 胺黑10B 染料溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取胺黑10B 染料1.066g,用pH2.2 的檸檬酸溶液定容至1000mL,搖勻,取出1mL,用水稀釋至250mL,以水為參比液,用1cm 比色皿于615nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度應(yīng)為0.320;否則用染料檸檬酸溶液或水進(jìn)行調(diào)節(jié)。,4操作方法 樣品處理:用組織搗碎機(jī)將樣品粉碎,準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量(蛋白質(zhì)含量在370430mg),作標(biāo)樣用時(shí)稱(chēng)四

35、份(兩份凱氏法、兩份染料結(jié)合法)。如樣品脂肪含量高,用乙醚提取脂肪棄去,然后再作試驗(yàn)。 染料結(jié)合:將脫脂肪后樣品全部放入組織搗碎機(jī)中,準(zhǔn)確加入吸光度為0.320 的染料溶液200mL,緩慢攪拌4min。,過(guò)濾離心:將結(jié)合后的樣品溶液用鋪有玻璃棉的布氏漏斗自然過(guò)濾,或用G2 熔結(jié)玻璃漏斗抽濾,靜置20min,取上清夜4mL,用水定容至100mL,搖勻,取出部分溶液離心5min(2000r/min)。 比色:取離心后的澄清透明溶液,用1cm 比色皿,以蒸餾水為參比液于615nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:用凱氏定氮法測(cè)出上述兩份平行樣品的總氮量,進(jìn)而計(jì)算出用于染料結(jié)合法測(cè)定的每份平行樣的

36、蛋白質(zhì)含量,以比色測(cè)定得到的吸光度(實(shí)質(zhì)是由沉淀反應(yīng)后剩余的染料所產(chǎn)生的吸光度)為縱坐標(biāo)(注意數(shù)值最好按從上到下吸光度增大的順序標(biāo)出),以相應(yīng)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)繪圖,即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線供分析同類(lèi)樣品蛋白質(zhì)含量使用。 測(cè)樣:完全按照上述(1)(4)步驟進(jìn)行,根據(jù)測(cè)出的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量即可。,6說(shuō)明及注意事項(xiàng) 取樣要均勻。 繪制完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線可供同類(lèi)樣品長(zhǎng)期使用,而不需要每次測(cè)樣時(shí)都作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 脂肪含量高的樣品,應(yīng)先用乙醚脫脂,然后再測(cè)定。 在樣品溶解性能不好時(shí),也可用此法測(cè)定。 本法具有較高的經(jīng)驗(yàn)性,故操作方法必須標(biāo)準(zhǔn)化。 本法所用染料還包括橙黃G 和溴酚藍(lán)等。,六、考馬

37、斯亮藍(lán)染料比色法 1原理 考馬斯亮藍(lán)G250 是一種蛋白質(zhì)染料,與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華引力結(jié)合,使蛋白質(zhì)染色,在620nm 處有最大吸收值,可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。此法簡(jiǎn)單而快速,適合大量樣品的測(cè)定,靈敏度與福林酚法相似,但不受酚類(lèi)、游離氨基酸和小分子的影響。,2試劑 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液:精確稱(chēng)取牛血清蛋白10mg,用蒸餾水配成100g/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 染料試劑: 考馬斯亮藍(lán)G-250 (Coomassic brilliant blue G-250)60mg 溶解 過(guò)濾 貯棕色瓶。,100mL 3%過(guò)氯酸,3.測(cè)定方法,本法在 0100mg/L 蛋白質(zhì)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。,0100mg/ml

38、 系列標(biāo)液,空白,待測(cè)樣液,七、水楊酸比色法,1原理 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化而轉(zhuǎn)化成銨鹽溶液后,在一定的酸度和溫度條件下可與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成藍(lán)色化合物,可以在波長(zhǎng)660nm 處比色測(cè)定,求出樣品含氮量,進(jìn)而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。,2操作方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取每毫升相當(dāng)于氮含量2.5g 的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0mL,分別置于25mL 容量瓶或比色管中,分別加入2mL 空白酸工作液、5mL 磷酸 緩沖溶液,并分別加水至15mL,再加入5mL 水楊酸鈉溶液,移入3637的恒溫水浴中 加熱15min 后,逐瓶加入2.5mL 次氯酸鈉溶液,搖勻后再在恒溫水浴

39、中加熱15min,取出加水至標(biāo)線,在分光光度計(jì)上于660nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定,測(cè)得各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度后繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。,樣品處理:準(zhǔn)確稱(chēng)取 0.201.00g 樣品(視含氮量而定,小麥及飼料稱(chēng)取樣品0.50g左右),置于凱氏定氮瓶中,加入15mL 濃硫酸、0.5g 硫酸銅及4.5g 無(wú)水硫酸鈉,小火加熱至沸騰后,加大火力進(jìn)行消化。待瓶?jī)?nèi)溶液澄清呈暗綠色時(shí),不斷地?fù)u動(dòng)瓶子,使瓶壁黏附的殘?jiān)芟孪?。待瓶?jī)?nèi)溶液澄清后取出冷卻,移至25mL 容量瓶中并用水稀釋至標(biāo)線。,樣品測(cè)定:準(zhǔn)確吸取上述消化好的樣液 10mL(如取5mL 則補(bǔ)加5mL 空白酸原液),置于100mL 容量瓶中,并用水稀釋至標(biāo)線。

40、準(zhǔn)確吸取2mL 于25mL 容量瓶中(或比色管中),加入5mL 磷酸鹽緩沖溶液,以下操作手續(xù)按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟進(jìn)行,并以試劑空白為參比液測(cè)定樣液的吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其含氮量。,4說(shuō)明 樣品消化完全后當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性好,但樣液放至第二天比色即有變化。 溫度對(duì)顯色影響極大,故應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。 對(duì)谷物及飼料等樣品的測(cè)定證明,此法結(jié) 果與凱氏法基本一致。 試劑配制請(qǐng)參考黃偉坤等編著食品檢驗(yàn)與分析書(shū)。,八、紅外光譜法 1原理 紅外光譜法測(cè)定由食品或其他物質(zhì)中分子引起的輻射吸收(近紅外、中紅外、遠(yuǎn)紅外區(qū))。 食品中不同的功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽,多肽鍵在中紅外波段(

41、6.47m)和近紅外(NIR)波段(如33003500nm,20802220nm,15601670nm)的特征吸收可用于測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量。針對(duì)所要測(cè)的成分,用紅外波長(zhǎng)光輻射樣品,通過(guò)測(cè)定樣品反射或透射光的能量(反比于能量的吸收)可以預(yù)測(cè)其成分的濃度。,2應(yīng)用 紅外牛乳分析儀采用中紅外光譜法測(cè)定牛乳蛋白質(zhì)含量,同時(shí)近紅外光譜儀也廣泛應(yīng) 用于食品蛋白質(zhì)的分析中(如谷物、谷類(lèi)制品、肉類(lèi)和乳制品中)。這些儀器非常昂貴,且 多須經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)試。但分析人員只需經(jīng)最低程度的培訓(xùn)就可以快速分析樣品(30s2min)。,第四節(jié) 氨基酸的定量測(cè)定,甲醛滴定法 茚三酮比色法 非水溶液滴定法 雙指示劑法 電位法

42、三硝基苯磺酸法 鄰苯二甲醛法,一、氨基酸的一般定量測(cè)定,(一)甲醛滴定法 1原理 氨基酸具有酸性的-COOH 基和堿性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí),-NH2 基與甲醛結(jié)合,從而使其堿性消失。這樣就可以用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)堿溶液來(lái)滴定-COOH 基,并用間接的方法測(cè)定氨基酸總量。反應(yīng)式(有三種不同的推論)如下:,2方法特點(diǎn)及應(yīng)用 此法簡(jiǎn)單易行、快速方便,與亞硝酸氮?dú)馊萘糠ǚ治鼋Y(jié)果相近。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測(cè)定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化,來(lái)了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況,并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物,使結(jié)果偏低;酪氨酸含

43、有酚羧基,滴定時(shí)也會(huì)消耗一些堿而致使結(jié)果偏高;溶液中若有銨存在也可與甲醛反應(yīng),往往使結(jié)果偏高。,3操作方法 吸取含氨基酸約20mg 的樣品溶液于100mL 容量瓶中,加水至標(biāo)線,混勻后吸取20.0mL置于200mL 燒杯中,加水60mL,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器,用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液mL 數(shù),供計(jì)算總酸含量。,加入10.0mL 甲醛溶液,混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2,記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)。 同時(shí)取80mL 蒸餾水置于另一200mL 潔凈燒瓶中,先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至pH82,(此時(shí)不計(jì)堿消耗量),再加

44、入10.0mL 中性甲醛溶液,用0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,作為試劑空白試驗(yàn)。,4結(jié)果計(jì)算 氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)= 式中: V1樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點(diǎn)(pH9.2)所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL; V2空白試驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL; c氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L; m測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量,g; 0.014氮的毫摩爾質(zhì)量,g/mmoL。,5說(shuō)明 本法準(zhǔn)確快速,可用于各類(lèi)樣品游離氨基酸含量測(cè)定。 渾濁和色深樣液可不經(jīng)處理而直接測(cè)定。,(二)茚三酮比色法 1原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用,生成藍(lán)

45、紫色化合物(除脯氨酸外均有此反應(yīng)),可用吸光光度法測(cè)定。 該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比,其最大吸收波長(zhǎng)為 570nm,故據(jù)此可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。,2操作方法 (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取 200g /mL 的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL(相當(dāng)于0、100、200、300、400、500、600g 氨基酸),分別置于25mL 容量瓶或比色管中,各加水補(bǔ)充至容積為4.0mL,然后加入茚三酮溶液(20g/L)和磷酸鹽緩沖溶液(pH 為8.04)各1mL,混合均勻,于水浴上加熱15min,取出迅速冷至室溫,加水至標(biāo)線,搖勻。靜置15min

46、后,在570nm 波長(zhǎng)下,以試劑空白為參比液測(cè)定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克 數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度A 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。,(2)樣品測(cè)定 吸取澄清的樣品溶液 14mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟,在相同條件下測(cè)定吸光度A 值,用測(cè)得的A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得對(duì)應(yīng)的氨基酸微克數(shù)。,4說(shuō)明及注意事項(xiàng) 通常采用的樣品處理方法為:準(zhǔn)確稱(chēng)取粉碎樣品 510g 或吸取樣液樣品510mL,置于燒杯中,加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭,加熱煮沸,過(guò)濾,用3040mL 熱水洗滌活性炭,收集濾液于100mL 容量瓶中,加水至標(biāo)線,搖勻備測(cè)。 茚三酮受陽(yáng)光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色,

47、使用前須進(jìn)行 純化,具體操作可參閱黃偉坤等編著食品檢驗(yàn)與分析。,(三)非水溶液滴定法 1原理 氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其含量。根據(jù)酸堿的質(zhì)子學(xué)說(shuō):一切能給出質(zhì)子的物質(zhì)為酸,能接受質(zhì)子的物質(zhì)為堿;弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強(qiáng),而弱酸在堿性溶劑中酸性顯得更強(qiáng),因此本來(lái)在水溶液中不能滴定的弱堿或弱酸,如果選擇適當(dāng)?shù)娜軇┦蛊鋸?qiáng)度增加,則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基,在水中 呈現(xiàn)中性,而在冰醋酸中就能接受質(zhì)子顯示出堿性,因此可以用高氯酸等強(qiáng)酸進(jìn)行滴定。,本法適合于氨基酸成品的含量測(cè)定。允許 測(cè)定的范圍是幾十毫克的氨基酸,2測(cè)定 (1)直接法(適用于能溶解于冰醋

48、酸的氨基酸):精確稱(chēng)取氨基酸樣品50mg 左右,溶解 于20mL 冰醋酸中,加2 滴甲基紫指示劑,用0.100mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定(用10mL 體積 的微量滴定管),終點(diǎn)為紫色剛消失,呈現(xiàn)藍(lán)色??瞻坠転椴缓被岬谋姿嵋?,滴定至 同樣終點(diǎn)顏色。,(2)回滴法(適用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸):精確稱(chēng)取氨基酸樣 品3040mg 左右,溶解于5mL0.1mol/L 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中,加2 滴甲基紫指示劑,剩余的酸以醋酸鈉溶液滴定,顏色變化由黃,經(jīng)過(guò)綠、藍(lán)至初次出現(xiàn)不褪的紫色為終點(diǎn)。,3說(shuō)明 (1)能溶解于冰醋酸的氨基酸,可以用直接法測(cè)定的有:丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組 氨

49、酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解于冰 醋酸,但能溶解于高氯酸可以回滴法測(cè)定的有:賴(lài)氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。,(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解,可以將樣品溶解于2mL 甲酸中,再加20mL 冰醋酸,直接用標(biāo)準(zhǔn)的高氯酸溶液滴定。,二、個(gè)別氨基酸的定量測(cè)定,(一)賴(lài)氨酸的測(cè)定 1原理 用銅離子阻礙游離氨基酸的-氨基,使賴(lài)氨酸的-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基 苯(FDNB)反應(yīng),生成-DNP-賴(lài)氨酸。經(jīng)酸化和用二乙基醚提取,在波長(zhǎng)390nm 處有吸收峰, 從而求出樣品中游離賴(lài)氨酸的含量.,2試劑 (1)氯化銅液:稱(chēng)28.0g 無(wú)

50、水氯化銅,用水稀釋至1000mL。 (2)磷酸三鈉溶液:稱(chēng)68.5g 無(wú)水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。 (3)硼酸鹽緩沖液(pH9.19.2):稱(chēng)54.64g 帶有10 結(jié)晶水的四硼酸鈉,用水稀釋至1000mL 。,(4)磷酸銅懸浮液:攪拌情況下,把氯化銅液200mL,緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液中,把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ,用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉淀物,洗滌離心3 次,把最后的沉淀物懸浮在硼酸鹽緩沖液中,并用緩沖液稀釋至1L。 (5)1-氟-2,4 二硝基苯(FDNB)溶液:吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。 (6)賴(lài)氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱(chēng)取

51、一定量賴(lài)氨酸-HCl,用水配成200mg/L 的工作標(biāo)準(zhǔn)液。 (7)100g/L 丙氨酸溶液。,3測(cè)定 (1)稱(chēng)取通過(guò)40 目篩的均勻試樣1.00g,置于100mL 燒瓶中。另吸取賴(lài)氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)工作液5mL(相當(dāng)1mg 賴(lài)氨酸-HCl),連同試劑同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。 (2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液,然后再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。,(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不斷搖動(dòng)使之酸化和分散均勻。 (4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40

52、mL 懸浮液進(jìn)行離心。 (5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次,除去醚。并將溶液收集于有刻度試管中,于65水浴中加熱15min,以除去殘留的醚。并記錄溶液的毫升數(shù)。,(6)吸取上述各處理液10mL,分別與95%乙醇溶液10mL 混合,用濾紙過(guò)濾。 (7)用試劑空白液凋零,測(cè)定樣液A390nm,與賴(lài)氨酸-HCl 標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照,求出樣品中賴(lài)氨酸-HCl 的含量。 本法在 040mg/L 賴(lài)氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。,4說(shuō)明 (1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸,增加總氨基酸的濃度,有助于賴(lài)氨酸-HCl 濃度 具有良好的線性關(guān)系。 (2)用醚提取酸性溶液,可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生

53、物除去,并把FDWB 的產(chǎn)物破壞,否則這些產(chǎn)物在390nm 處存在干擾。,(二)色氨酸的測(cè)定,1.原理 樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)堿水解后,游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用,生成哈爾滿(mǎn)化合物(norharman),具有特征熒光值,可以進(jìn)行定量測(cè)定。反應(yīng)式如下:,2試劑 (1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液:稱(chēng)取三氯化鐵(FeCl36H2O)41mg,加入10%三氯乙酸溶液溶解并定溶至500mL。 (2)2%甲醛:量取甲醛溶液(36%38%)5.5mL,加水至100mL。 (3)色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱(chēng)取10mg 色氨酸,用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,置棕色瓶

54、中備用,使用時(shí)用水稀釋成1mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液.,3測(cè)定 稱(chēng)取樣品粉末 100200mg 于離心管中,加入4mL 乙醚,搖勻后過(guò)夜,以3000r/min 速度離心。將乙醚提取液移入試管內(nèi),并用乙醚洗滌殘?jiān)? 次,收集乙醚液于試管中,于40水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL,火焰封口,于110水解1624h。水解液用4mol/L HCl 溶液調(diào)節(jié)至pH68 后,用水定容至50mL,過(guò)濾備用。,吸取濾液 0.2mL,加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL,搖勻后于100水浴中加熱1h,取出,冷卻后用水定容至10mL。在激發(fā)波長(zhǎng)為36

55、5nm,發(fā)射波長(zhǎng)449nm 條件下,測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度,與色氨酸標(biāo)樣作對(duì)照,求出樣品中色氨酸含量。 本法在 010mg/L 色氨酸溶液范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。,第五節(jié) 氨基酸的分離及測(cè)定,一、薄層色譜法,1原理 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液,滴在制好的薄層板上,在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開(kāi),樣品各組分在薄層板上經(jīng)過(guò)多次的被吸附、解吸、交換等作用,同一物質(zhì)具有相同的Rf 值,不同成分則有不同的Rf 值,因而各種氨基酸可達(dá)到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色,與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比,即可鑒別樣品中所含氨基酸的種類(lèi),從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。,2試劑 展開(kāi)劑:叔丁醇-甲乙酮-氫氧化銨-水(531

56、1),須臨時(shí)配制。 展開(kāi)劑:異丙醇-甲酸-水(2015),須臨時(shí)配制。 5g/L 茚三酮的無(wú)水丙酮溶液 羧甲基纖維素或微晶纖維素 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液:濃度02mg/mL。,3操作方法 薄層板制備:稱(chēng)取10g 微晶纖維素,加入20mL 水和2.5mL 丙酮,研磨1min 后調(diào) 成勻漿后,用薄層涂布器于潔凈干燥的玻璃板上(玻璃板200200mm,厚度3mm),使涂 層厚度以300500m 為宜(比一般的薄板厚一些),置水平架上晾干后即可使用。, 樣品液制備:稱(chēng)取樣品5mg,放入小試管內(nèi),加入0.6mL5.7mol/L 鹽酸溶液(恒沸 點(diǎn)鹽酸)。在火焰上熔融封口后,置于110烘箱中水解24h。取出,打開(kāi)

57、封口,置真空干燥器中減壓抽干,以去掉多余的鹽酸。以稀氨水調(diào)節(jié)pH7 左右,再加入10%異丙醇至最后體 積達(dá)0.5mL,置冰箱中保存?zhèn)溆谩? 點(diǎn)樣:用微量注射器吸取樣液5uL(每種氨基酸約1 至10g),分次滴加在距薄板 下邊緣約2cm 處,邊點(diǎn)邊用電吹風(fēng)吹干,使點(diǎn)樣直徑在23mm 內(nèi)。, 展開(kāi):采用雙向上行法展開(kāi)。將已點(diǎn)樣的兩個(gè)薄板的薄層面朝外合在一起,放入層析缸(250100250mm)中的玻璃船內(nèi),將兩板的上端分開(kāi)靠在缸壁上。先進(jìn)行堿向展層,將展開(kāi)劑I 從兩塊板中間加入,薄層浸入展開(kāi)劑中的深度約0.5cm,蓋好缸蓋,進(jìn)行展開(kāi)。 當(dāng)溶劑前沿達(dá)到距原點(diǎn)約11cm 時(shí)(時(shí)間約11.5h),即可將薄板取出,冷風(fēng)吹干,放平, 刮去前沿上端的黃色雜質(zhì)部分。再進(jìn)行酸向?qū)诱梗瑢⒈“逯匦路湃肓硪粋€(gè)缸中的船槽內(nèi),與 堿向體系成垂直方向,加入展開(kāi)劑II,進(jìn)行展層。展開(kāi)至

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