實驗二、蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應.ppt

1、實驗二、蛋白質(zhì)等電點測定及沉淀反應,一、實驗目的,1、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì) 2、學習測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法 3、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。 4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。 5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。,二、實驗原理,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：,蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的PH達到一定數(shù)值時，蛋白質(zhì)顆粒上正負電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)各有特異的等電點。 在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)

2、的等電點。最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值。,本實驗通過觀察不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。,在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。,蛋白質(zhì)的沉淀反應可分為兩類。,可逆的沉淀反應 此時蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下

3、用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應。,不可逆沉淀反應此時蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。,蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。,三、試劑器材,1、實驗材料： 雞蛋清 牛乳,2、儀器設備： 水浴鍋 溫度計 錐形瓶 100mL容量瓶 吸管 試管及試管架,0.4% 酪蛋白乙酸鈉溶液 取0.4g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細地研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200

4、mL錐形瓶內(nèi)，用少量4050的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶內(nèi)。加入10mL 1mol/L醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶內(nèi)的溶液全部移到100mL容量瓶內(nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。,3、試劑,1.00mol/L 醋酸溶液 100mL 0.10 mol/L醋酸溶液 300mL 0.01 mol/L醋酸溶液 50mL 蛋白質(zhì)溶液 500mL 5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液 （新鮮雞蛋清 ：水=1:9）,pH4.7 醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液； 3%硝酸銀溶液； 5%三氯乙酸溶液；95%乙醇； 飽和硫酸銨溶液； 硫酸銨結(jié)晶粉末； 0.1

5、 M鹽酸溶液； 0.1 M氫氧化鈉溶液； 0.05 M碳酸鈉溶液； 0.1 M醋酸溶液； 甲基紅溶液,四、實驗操作,（一）酪蛋白等電點的測定,（1）取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別 精確地加入各試劑，然后混勻。,（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL， 加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一管pH即為酪蛋白的等電點。,（二）蛋白質(zhì)沉淀實驗,1蛋白質(zhì)的鹽析：無機鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。 如球蛋白可在半飽和硫酸銨

6、溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。 由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當降低其鹽類濃度時，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過程。,加5%卵清蛋白溶液5 ml于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管中內(nèi)容物過濾，向濾液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。,2重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)： 重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復合物。 取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml，再加3%硝酸銀溶液12滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉

7、淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？,3有機酸沉淀蛋白質(zhì)： 取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 ml，再加1 ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。,4有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)： 取1支試管，加入2 ml蛋白質(zhì)溶液，再加入2 ml95%乙醇。混勻，觀察沉淀的生成。,5乙醇引起的變性與沉淀：取3支試管，編號。依下表順序加入試劑：,振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8 ml，然后在第2、3號管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1 M醋酸溶液及0.05 M碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1 M鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。,五、實驗結(jié)果,（一）蛋白質(zhì)等電點測定,（二）蛋白質(zhì)的鹽析,1蛋白質(zhì)的鹽析,2重金屬離子沉淀蛋